روش لوری در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

روش لوری در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

شایع‌ترین روش اندازه‌گیری پروتئین‌ها در کارهای تحقیقاتی، روش لوری می‌باشد. این روش گروه فنل را در ریشه تیروزین مورد شناسایی قرار داده و دارای حساسیت ۱۰۰-۲ میکروگرم در میلی‌لیتر پروتئین است. از آن جائی که روش لوری موجب تشخیص ریشه تیروزین در پروتئین‌ها می‌شود و تعداد ریشه‌ای تیروزین در بین پروتئین‌های مختلف تفاوت دارد، ضروری به نظر می‌رسد که از پروتئینی به عنوان استاندارد استفاده شود که از نظر تعداد ریشه‌های تیروزین با پروتئین موردنظر مشابه باشد. نکته مهم دیگر در اندازه‌گیری پروتئین به روش لوری زمان دقیق انکوباسیون می‌باشد؛ زیرا اختلاف در زمان انکوباسیون برای نمونه‌هایی که قرار است با این روش اندازه‌گیری شوند، موجب تولید نتایجی می‌شود که تکرارپذیر نیستند. روش لوری همچنین با طیف وسیعی از ترکیبات از قبیل تریس (Tris) و اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید (EDTA) که هر دو از اجزای شایع بافرها می‌باشند و برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب به کار می‌روند، تداخل می‌نمایند. هر چند اثر این عوامل را می‌توان با رقیق کردن نمونه کاهش داد.

 

مزایای روش لوری

– حساسیت در محدوده وسیع

– رایج‌ترین روش رفرانس برای اندازه‌گیری پروتئین‌ها

– انجام در دمای اتاق

– ۲۰-۱۰ مرتبه حساس‌تر از تشخیص با نور UV در طول موج ۲۸۰ نانومتر

– قابلیت انجام در میکروپلیت

– سرعت انجام آزمایش (۲-۱ ساعت)

– گستردگی استفاده در علم بیوشیمی

 

 

معایب روش لوری

– تداخل بسیاری از مواد با این روش

– پرزحمت بودن تهیه معرف Alkaline copper

– معرف تهیه شده در طی مدت زمان ذخیره موجب ایجاد کربنات شده که با فعالیت نوری آن تداخل می‌نماید.

– معرف باید به صورت تازه و روزانه تهیه شود.

– طولانی بودن مدت زمان آزمایش

– ناپایداری معرف در مقابل نور

– تفاوت مقدار رنگ در پروتئین‌های مختلف

– نیاز به تهیه استاندارد بسیار دقیق

– متناسب نبودن دقیق رنگ ایجاد شده با غلظت پروتئین

– تداخل با سوکروز، لیپیدها، برخی بافرها، مونوساکاریدها و هگزوزآمین‌ها

– تداخل با غلظت‌های بالای سولفات آمونیوم، ترکیبات سولفهیدریل و فسفات

 

اصول آزمایش

در این روش، نخستین مرحله واکنش بیوره می‌باشد که موجب احیا مس دو ظرفیتی (Cu2+) به مس یک ظرفیتی (Cu+) می‌شود، سپس واکنش دوم از مس یک ظرفیتی برای احیای معرف Folin-Ciocalteu (فسفو‌مولیبدات و فسفوتنگستات) استفاده می‌نماید. این محصول به مولیبدنوم/تنگستن بلو احیا می‌شود و در طول موج ۷۵۰-۵۰۰ نانومتر به روش کالریمتری قابل شناسایی است. حضور اسیدهای قوی و آمونیوم سولفات با این روش تداخل می‌نمایند.

 

در روش لوری، چون احیای مس رخ می‌دهد باید مطمئن شویم که آب مقطر مورد استفاده در ظرف پلاستیکی نگهداری شده و از مصرف آب مقطری که در ظرف‌های مسی نگهداری شده است، خودداری نماییم.

 

روش لوری با تکیه بر دو واکنش متفاوت پایه‌گذاری شده است. واکنش نخست تشکیل کمپلکس یون مس با پیوندهای آمیدی و ایجاد مس احیا شده در محلول قلیایی می‌باشد. این واکنش کروموفور بیوره نامیده می‌شود. واکنش دوم، احیا معرف Folin-Ciocalteu به وسیله ریشه‌های تیروزین و تریپتوفان می‌باشد. معرف
Folin-Ciocalteu احیا شده آبی رنگ بوده و از این رو به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج ۷۵۰-۵۰۰ نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. واکنش بیوره به تنهایی حساسیت کافی را ندارد. استفاده از معرف
Folin-Ciocalteu برای تشخیص مس احیا شده، اندازه‌گیری پروتئین را نزدیک به ۱۰۰ مرتبه حساس‌تر از واکنش بیوره به تنهایی می‌سازد.

این روش اندازه‌گیری نسبتاً حساس می‌باشد اما نسبت به سایر روش‌های اندازه‌گیری پروتئین‌ها، وقت‌گیر بوده و مستعد تداخل ترکیبات بسیاری می‌باشد. از جمله این عوامل مداخله‌گر به ریجنت‌ها، کربوهیدرات‌ها، گلیسرول، تریسین، EDTA، تریس، ترکیبات پتاسیم، ترکیبات سولفهیدریل، ترکیبات دی سولفید، منیزیوم و کلسیم می‌توان اشاره نمود. اغلب این عوامل مداخله‌گر به طور رایج در بافرهای تهیه پروتئین‌ها به کار می‌روند. این مشکل یکی از محدودیت‌های استفاده از این روش در اندازه‌گیری پروتئین‌ها می‌باشد. روش لوری به تغییرات محتوای ریشه‌های تیروزین و تریپتوفان حساس است، بنابراین اگر در پی اندازه‌گیری پروتئینی هستیم که حاوی تعداد غیرمعمول از ریشه‌های این دو اسید آمینه می‌باشد، استفاده از استاندارد مناسب ضروری است. منحنی استاندارد در محدوده μg 100-1 پروتئین، خطی می‌باشد.

 

در روش اندازه‌گیری لوری، می‌توان طول موج را در محدوده ۷۵۰-۵۰۰ نانومتر انتخاب نمود. در بسیاری از تحقیقات از طول موج ۶۶۰ نانومتر استفاده می‌شود. استفاده از سایر طول موج‌ها به منظور کاستن از تأثیر آلودگی‌ها مثل تداخل کلروفیل در نمونه‌های گیاهی که در طول موج ۶۶۰ نانومتر تداخل می‌نمایند اما در طول موج ۷۵۰ نانومتر تداخلشان از بین می‌رود نیز شایع می‌باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

مقایسه نتایج اندازه‌گیری برخی پروتئین‌های مختلف با روش لوری و بیوره

 

 

روش اصلاح شده لوری

 

در سال ۱۹۵۱ Oliver H. Lowry روشی کالریمتری برای اندازه‌گیری پروتئین‌ها ارائه کرد که نسبت به روش اندازه‌گیری پیشین پروتئین‌ها تغییراتی داشت و مقاله او به عنوان یکی از مقالاتی معرفی شد که بیشترین استنادات به آن شده بود. روش اندازه‌گیری پروتئین اصلاح شده لوری از یک معرف پایدار به جای دو معرف ناپایداری که Dr. Lowry معرفی کرده بود استفاده می‌نمود. انجام روش اندازه‌گیری پروتئین اصلاح شده لوری آسان بود زیرا انکوباسیون آن در دمای اتاق انجام می‌گرفت و حساسیت کافی را داشت به حدی که می‌توانست پروتئین را در مقادیر میکروگرم در میلی‌لیتر اندازه‌گیری نماید.

 

مکانیسم واکنش

مکانیسم واقعی تشکیل رنگ در روش اندازه‌گیری پروتئین اصلاح شده لوری بطور کامل شناخته نشده است. واکنش تولید رنگ با پروتئین‌ها در دو مرحله مجزا اتفاق می‌افتد. در ابتدا پروتئین با سولفات مس قلیایی در حضور تارتارات در طی ده دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق واکنش می‌دهند. در طی انکوباسیون، کمپلکس tetradentate copper از اتصال چهار پیوند پپتیدی با یک اتم مس تشکیل می‌شود. کمپلکس tetradentate copper دارای رنگ آبی کمرنگ می‌باشد که این واکنش، واکنش بیوره نامیده می‌شود. پس از انکوباسیون، معرف فولین فنول (Folin phenol) اضافه می‌شود. اعتقاد بر این است که افزایش شدت رنگ متعاقب انتقال الکترون‌ها از کمپلکس tetradentate copper به کمپلکس فسفو مولیبدیک/فسفو تنگستیک اسید (معرف فولین فنول) رخ می‌دهد.

 

مکانیسم اندازه‌گیری پروتئین به روش اصلاح شده لوری

 

کمپلکس فسفو مولیبدیک/فسفو تنگستیک اسید احیا شده که در این واکنش تولید می‌شود دارای رنگ آبی پررنگ می‌باشد. معرف فولین فنول تقریباً بلافاصله فعالیتش را پس از افزودن به محلول معرف کار قلیایی نمونه از دست می‌دهد. شدت رنگ آبی ایجاد شده در طی ۳۰ دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق به تدریج پررنگ‌تر می‌شود. به وسیله Lowry و همکاران و Legler و همکاران پیشنهاد شده است که در طی ۳۰ دقیقه انکوباسیون، بازآرایی کمپلکس ناپایدار رنگ آبی ایجاد شده اولیه منجر به کمپلکس رنگی آبی نهایی پایدار می‌شود که دارای جذب نوری بالاتری می‌باشد.

در مورد پپتید‌های کوچک، با افزایش اندازه پپتید، مقدار رنگ نیز افزایش می‌یابد. حضور هر کدام از اسید آمینه‌های تیروزین، تریپتوفان، سیستئین، هیستیدین و آسپاراژین در اسکلت پپتید یا پروتئین موجب افزایش شدت رنگ تولید شده می‌شود، زیرا این اسیدهای آمینه موجب احیای اکی‌والان‌های بیشتری از کمپلکس فسفو‌مولیبدیک/فسفو تنگستیک اسید می‌شوند. به استثنای اسیدهای آمینه تیروزین و تریپتوفان، اسیدهای آمینه آزاد با روش اندازه‌گیری پروتئین اصلاح شده لوری، ایجاد رنگ نمی‌کنند، اگرچه اغلب پیوندهای دی‌پپتید قابل شناسایی هستند. در غیاب پنج اسید آمینه ذکر شده در بالا در ساختمان اسکلت پپتیدها، پروتئین‌های دارای ریشه پرولین، با این روش، شدت رنگ کمتری تولید می‌کنند که ناشی از تداخل این اسید آمینه با تشکیل کمپلکس فسفو مولیبدیک/فسفو تنگستیک اسید می‌باشد.

 

مزایای روش اصلاح شده لوری

رنگ آبی نهایی تولید شده در طول موج ۷۵۰ نانومتر به صورت اپتیمم اندازه‌گیری می‌شود؛ اگر چه ما می‌توانیم آن را در هر طول موجی بین ۶۵۰ تا ۷۵۰ نانومتر اندازه‌گیری نماییم که در اینجا مقدار شدت رنگ، کمی پایین‌تر خوانده می‌شود. بهتر است که اندازه‌گیری شدت رنگ در ۷۵۰ نانومتر انجام شود زیرا در سایر طول موج‌ها، برخی مواد دیگر موجب جذب نور می‌شوند. مقدار نور جذب شده در ۷۵۰ نانومتر، مستقیماً با مقدار پروتئین در نمونه متناسب می‌باشد اما منحنیی که ایجاد می‌شود کاملاً خطی نمی‌باشد. این روش نسبت به روش اندازه‌گیری پروتئین‌ها بر پایه کوماسی بلو دارای تغییرات پروتئین- پروتئین کمتری می‌باشد.

 

 

منحنی استاندارد به دست آمده با BSA و BGG با روش اصلاح شده لوری (۷۵۰ nm=λ )

 

هنگامی که منحنی‌های استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) و گاما گلبولین گاوی (BGG) با هم مقایسه می‌شوند در روش اصلاح شده لوری کمتر از ۱۵ درصد اختلاف در سیگنال تولید شده مشاهده می‌شود، در حالیکه این اختلاف در روش کوماسی (برادفورد) بیش از ۳۰ درصد می‌باشد.

 

معایب روش اصلاح شده لوری

این روش در حضور دترجنت‌ها و یون‌های پتاسیم ایجاد رسوب می‌نماید. گاهی اوقات با سانتریفوژ نمونه‌ها و اندازه‌گیری شدت رنگ ایجاد شده در محلول روئی نمونه می‌توان بر این مشکل ایجاد شده در حضور یون‌های پتاسیم فائق آمد. اغلب سورفاکتانت‌ها حتی در غلظت‌های بسیار پایین نیز موجب رسوب معرف‌ها می‌شوند. تنها مورد استثنا، سدیم دودسیل سولفات (SDS) می‌باشد که در غلظت‌های تا یک درصد با معرف‌ها رقابت می‌نماید. عوامل شلاته کننده با اتصال مس تداخل نموده و مانع تشکیل کمپلکس پیوند پپتید- مس می‌شوند. ترکیبات احیا کننده و تیول‌های آزاد نیز با احیای کمپلکس فسفو مولیبدیک/فسفو تنگستیک اسید تداخل نموده و به محض افزودن معرف‌های این روش، موجب ایجاد رنگ آبی شدید می‌گردند.

نکات تکمیلی

 

معرف‌های این روش در دمای ۲۶-۱۸ درجه سانتیگراد به مدت یک ماه و برای نگهداری طولانی‌تر باید در یخچال نگهداری شوند. نگهداری معرف‌ها به مدت بیشتر از یک ماه در دمای اتاق ممکن است موجب ایجاد شدت رنگ کمتری شوند. معرف‌های نگهداری شده در یخچال باید قبل از شروع کار به دمای اتاق رسانده شوند. استفاده از معرف‌های سرد در این روش ممکن است موجب ایجاد جذب نوری پایین‌تری شوند. در این روش باید معرف فولین فنول دقیقاً پس از مدت زمان ده دقیقه به هر لوله افزوده شود. معرف فولین فنول تقریباً بلافاصله پس از افزوده شدن، در PH قلیایی معرف لوری غیرفعال می‌شود، بنابراین لازم است که دقیقاً پس از مدت زمان ۱۰ دقیقه معرف فولین فنول به هر لوله افزوده شده و همزمان لوله‌ها را باید با تکان دادن مخلوط نمود. این کار موجب می‌شود که در هر مرحله کار، تعداد نمونه‌هایی که با این روش اندازه‌گیری می‌شوند کمتر باشند. اگر فاصله میان انجام دادن کارهای هر لوله با لوله بعدی فقط ۱۰ ثانیه اختلاف وجود داشته باشد، تنها قادر به اندازه‌گیری مقادیر ۶۰ لوله می‌باشیم.

 

مقایسه نتایج اندازه‌گیری برخی پروتئین‌های مختلف با روش اصلاح شده لوری و برادفورد

 

 

References:

۱- Noble J.E. and Bailey M.J.A. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 2009: 463;73–۹۵٫

۲- Knight MI. and Chambers PJ. Problems associated with determining protein concentration: A comparision of techniques for protein estimations. Molecular Biotechnology. 2003: 23; 19-28.

۳- Sapan CV., Lundblad RL. and Price NC. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999: 29; 99–۱۰۸٫

۴- Lowry OH., Rosebrough NJ., Farr AL. and Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951: 193; 265–۲۷۵٫

۵- Peterson GL. Determination of total protein. Methods Enzymol. 1983: 91; 95–۱۲۱٫

۶- Markwell MAK., Haas SM., Tolbert NE. and Bieber LL. Protein determination in membrane and lipoprotein samples. Methods Enzymol. 1981: 72; 296–۳۰۳٫

۷- Stoscheck CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology. 1990: 182; 50-69.

 

مراد رستمی: کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

معصومه جرفی: کارشناس ارشد میکروب شناسی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

برگرفته از سایت ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

 

امتیاز مطلب
تاریخ ارسال
اطلاعات آزمایشگاهی
5
اشتراک گذاری

ارسال یک پاسخ