خانه > مقالات و پایان نامه > مطالعه اثر احتمالی miR-20b و miR-301a

مطالعه اثر احتمالی miR-20b و miR-301a

مطالعه اثر احتمالی miR-20b و miR-301a در تمایز سلول‌های Th17 در بیماری آرتریت روماتوئید

معرفی: یکی از اساسی‌ترین سلول‌های سیستم ایمنی که در بیماری روماتوئید آرتریت RA دخالت دارند، سلول‌های Th17 می‌باشند که در بسیاری دیگر از بیماری‌های خودایمن نیز اثرگذار هستند. اخیراً از microRNAها در درمان بسیاری از بیماری‌ها استفاده می‌شود. miRNAها دسته‌ای از RNAهای غیر‌کدشونده به طول ۲۲ تا ۲۵ نوکلئوتید هستند که نقش‌های تنظیمی اساسی در فرآیندهای مختلف سلولی دارند. در این مطالعه با استفاده از پایگاه داده‌های بیوانفورماتیک، تلاش شده است تا miRNAهایی که در مسیر تمایز به Th17 نقش دارند را مشخص نموده و از این طریق کاندیداهایی برای مهار این مسیر و کاهش علائم بیماری به دست آورند.

مواد و روش‌ها: مطالعه انجام‌شده از نوع تئوریکال بیوانفورماتیک است. در این مطالعه از طریق پایگاه داده Target Scan و microRNA میانکنش میان ژن‌های دخیل در تمایز سلول‌هایTCD4+ بکر به سلول‌های Th17 با microRNAهایی که تغییرات بیان آن‌ها در بیماری‌های خود ایمن مختلف به اثبات رسیده است، مورد بررسی قرار گرفته و اثر احتمالی چندین miRNA در این مسیر مشخص شده است.

یافته‌ها: یافته‌های به دست آمده از این تحقیق نشان داد که miR-20b با مهار بیان Stat3 باعث کاهش تمایز سلول‌های Th17 می‌شود، در مقابل miR-301a با افزایش بیان Stat3 باعث افزایش تمایز سلول‌های Th17 خواهد شد.

نتیجه‌گیری: شناسایی میکرو RNAها و مولکول‌های هدف آن‌ها، افق روشنی را برای شناخت مسیرهایی که منجر به بیماری‌های خودایمن می‌شوند فراهم کرده است، ازاین‌رو می‌توان از این ترکیبات به‌عنوان نشان‌گرهای زیستی بالقوه در تشخیص، پیش‌بینی و درمان بیماری‌های خودایمن استفاده کرد.

کلمات کلیدی: آرتریت روماتوئید،microRNA ، سلول‌های Th17، بیماری‌های خودایمن

 

مقدمه

آرتریت روماتوئید بیماری خودایمنی مزمن و التهابی است که درنهایت موجب تخریب مفاصل شده و با ناتوانایی‌های حرکتی پیشرونده و عوارض سیستمیک همراه است (۱). این بیماری شایع‌ترین آرتریت التهابی است که در ۱-۵/۰ درصد بالغین گزارش شده و زنان در مقایسه با مردان بیشتر به این بیماری مبتلا می‌شوند (۲). اتیولوژی آرتریت روماتوئید به‌طور کامل شناخته نشده است اما شواهد، نشانگر نقش مهم و پیچیده فاکتورهای محیطی و ژنتیکی در اتیولوژی این بیماری می‌باشد (۳). تخریب مفاصل در آرتریت روماتوئید متعاقب عفونت یا پروسه‌های خودایمنی با تکثیر ماکروفاژهای سینوویال و فیبروبلاست‌ها همراه است (۴). لنفوسیت‌ها در نواحی اطراف رگ‌ها ارتشاح می‌یابند و سلول‌های اندوتلیال در این ناحیه تکثیر می‌شوند. در ادامه، رگزایی در محل اتفاق می‌افتد و رگ‌های خونی در مفاصل درگیر، به‌واسطه لخته‌های کوچک یا سلول‌های التهابی مسدود می‌شوند. با گذشت زمان، بافت سینوویال ملتهب به‌طور نامنظم رشد کرده و غضروف و استخوان را تخریب می‌کند (۵، ۶). سایتوکاین‌های مختلف، پروتئینازها و فاکتورهای رشدی که طی این فرایندها ترشح می‌شوند، تخریب مفصل و عوارض سیستمیک را گسترش می‌دهند. تولید بیش از حد عوامل پیش‌برنده التهاب مانند سایتوکین‌های التهابی منجر به پیشرفت فرایند تخریب می‌شود (۷).

سلول‌های T خودواکنشگر مثل Th17 نقش مهمی در پاتوژنز آرتریت روماتوئید ایفا می‌کنند. سلول‌هایTh17  سلول‌هایی التهابی هستند که فاکتور رونویسی اصلی آن‌ها RORgt می‌باشد. این سلول‌ها به میزان زیادی IL-17 ترشح می‌کنند. تعداد این سلول‌ها در خون محیطی بیماران آرتریت روماتوئید افزایش می‌یابد؛ همچنین میزان بالای IL-17 در سرم و مایع مفصلی بیماران آرتریت روماتوئید گزارش شده است (۸). در بیماران آرتریت روماتوئید، سلول‌های فیبروبلاست، کندروسیت‌ها و ماکروفاژها در اثر تحریک با IL-17، آنزیم‌های تجزیه‌کننده بافت را ترشح می‌کنند که این آنزیم‌ها موجب تخریب پیشرونده غضروف می‌گردند. IL-17 می‌تواند تولید سایتوکاین‌های التهابی مثل TNF-α، IL-1 و ماتریکس متالوپروتئینازها را تحریک نموده و فرایندهای التهابی را در مفصل تشدید کند (۹).

همچنین مطالعات نشان می‌دهند در بیماران آرتریت روماتوئید بالانس بین سلول‌های Treg و Th17 با کاهش سلول‌های Treg و افزایش سلول‌های Th17 مختل شده که متعاقب آن التهاب و خودایمنی تشدید می‌شود (۱۰، ۱۱).

MRNA گروه جدیدی از RNA غیرکدکننده و تک‌رشته‌ای به طول تقریباً ۲۲ نوکلئوتید هستند که تاکنون نقش آن‌ها در تنظیم پروسه‌های سلولی و نموی مختلف از قبیل رشد، سیکل سلولی، متابولیسم، تمایز، اپوپتوز، رگ‌زایی و التهاب مشخص شده است (۱۲). MIRNA با تنظیم بیان ژن در سطح پس از رونویسی، اثر خود را اعمال می‌کند، به‌طوری‌که با تخریب و یا مهار ترجمه MRNA از ترجمه پروتئین جلوگیری به عمل می‌آورد (۱۳). بیان MIRNA در سطح رونویسی توسط فاکتورهای رونویسی در طی نمو یا در پاسخ به سیگنال‌های محیطی کنترل می‌شود. اختلال در تنظیم بیان و یا عملکرد MIRNA با بروز بیماری‌های مختلف از قبیل سرطان، بیماری‌های تخریب‌کننده اعصاب و بیماری‌های خودایمن مرتبط است (۱۴)، به‌علاوه تنظیم پاسخ‌های ایمنی به‌وسیله MIRNA در پستانداران توسط مطالعات متعدد تأیید شده است. miRNAها همان‌گونه که در روندهای تکاملی و نیز عملکردی اجزای ایمنی ذاتی تأثیرگذارند، بر ایمنی اختصاصی نیز تأثیرات مهمی دارند (۱۵). مشابه با تکامل سلول‌های ایمنی ذاتی، تکامل سلول‌های T در تیموس و روند فعال شدن آن‌ها در محیط توسط شبکه‌های پیچیده‌ای از پروتئین‌های سیگنال‌رسان که می‌توانند به‌وسیله‌ی miRNAها تنظیم شوند، کنترل می‌شوند. در رابطه با ایجاد انواع سلول‌های T الگوهای متنوعی از miRNAها در مراحل مختلف تکامل این سلول‌ها نقش دارند. اختلال در تنظیم بیان MIRNA در چندین بیماری خودایمن نظیر rheumatoid arthritis، systemic lupus erythematosus، MS و  Sjogren’s syndromeگزارش شــــده است (۱۶، ۱۷).

هدف از این پژوهش مشخص کردن miRNAهایی به روش بیوانفورماتیک است که بتوانند بیشترین تأثیر را در مسیر تمایز سلول‌های Th17 و ترشح سایتوکین‌های التهابی از این سلول‌ها داشته باشند، ازاین‌رو به‌نظر می‌رسد که مطالعه این Micro RNAها در بیماران مبتلا به روماتوئید آرتریت به‌منظور شناسایی نقش MiRNA در مکانیسم‌های بیماری‌زایی آرتریت روماتوئید و ابداع روش‌های درمانی مؤثر، مفید باشد.

 

مواد و روش‌ها

این مطالعه از نوع تئوریکال بیوانفورماتیک بوده و به‌صورت نظری با تکیه بر پایگاه‌های داده Target Scan و microRNA صورت پذیرفته است. روش انجام کار به سه بخش جمع‌آوری اولیه داده‌ها از مقالات، بررسی داده‌های به‌دست‌آمده در پایگاه‌های داده Target Scan و microRNA و نهایتاً تفسیر یافته‌ها و نتیجه‌گیری بود که به‌تفصیل ارائه شده است.

 

جمع‌آوری داده‌ها

فاکتورهای رونویسی دخیل در تمایز سلول‌های Th17

TGFb با IL-6 در بیان فاکتور رونویسی RORgt که فاکتور اصلی در تمایز سلول‌های Th17 است اثر هم‌افزایی دارد. تحقیقات دیگری نشان می‌دهند که رسپتور هسته‌ای مرتبط دیگری به نام RORga نیز می‌تواند در تمایز سلول‌های Th17 نقش داشته باشد. RORga نیز توسط TGFb و IL-6 القا می‌شود و می‌تواند با RORɣt در القای IL-17 اثر هم‌افزایی داشته باشد. علاوه بر RORgt و RORga تکامل سلول‌های Th17 به STAT3 نیز وابسته است که توسط IL-6 و IL-23 فعال می‌شود.

سایتوکین IL-23 همچنین می‌تواند باعث فعال کردن STAT4 شود که به‌عنوان واسطه سیگنال‌دهی IL-12 و برای تمایز سلول‌های Th1 ضروری است، بااین‌حال این سایتوکین نقش مهمی نیـــز در القای IL-17 دارد.

علاوه بر STAT3 و STAT4 به‌نظر می‌رسد که فاکتورهای رونویسی دیگری نیز در تکامل و تمایز سلول‌های Th17 نقش داشته باشند؛ ازجمله SMAD-2 و SMAD-3.

 

شناسایی ملکول‌های هدف microRNA

یکی از مهم‌ترین مباحث مربوط به microRNAها شناسایی ملکول‌های هدف آن‌ها است. ایجاد تعداد کمی جفت باز مکمل برای برهمکنش عملکردی بین micoRNA و توالی ملکول هدف ضروری است. در اغلب موارد، ایجاد جفت باز مکمل در ۷-۶ نوکلئوتید صورت می‌گیرد که معمولاً شامل نوکلئوتیدهای ۲ تا ۹ از انتهای ´۵ microRNA هستند و به این ناحیه seed گویند. بقیه بازهای microRNA ظرفیت جفت شدن محدودی با توالی‌هایUTR’۳ مجاور جایگاه seed نشان می‌دهند و همین اتصالات گذرا به microRNA اجازه اتصال به چندین جایگاه درونی در یک UTR’۳ می‌دهد.

 

بررسی میانکنش بین miRNA-mRNA از طریق پایگاه داده Target scan

TargetScan هدف‌های بیولوژیکی miRNAها را به کمک جستجوی حضور نواحی ۸-۷تایی حفاظت‌شده‌ای که با ناحیه seed هر miRNA جفت می‌شود، پیشگویی می‌کند. به‌عنوان یک گزینه، نواحی غیرحفاظت‌شده نیز پیش‌گویی می‌شود، همچنین نواحی دارای جفت‌شدگی ناکامل در ناحیه seed به‌واسطه جبران جفت‌شدگی حفاظت‌شده در  ناحیه ۳ شناسایی می‌شوند. در پستانداران، پیش‌گویی‌ها بر اساس درجه دقت در هدف‌یابی رتبه‌بندی می‌شود. به‌عنوان یک گزینه دیگر پیش‌گویی‌ها بر اساس احتمال هدف‌یابی حفاظت‌شده (PCT) آن‌ها رتبه‌بندی می‌شوند.

 

بررسی میانکنش بین miRNA-mRNA از طریق پایگاه داده microRNA

سایت microRNA.org منبع جامعی از پروفایل‌های بیانی و پیشگویی‌کننده اهداف microRNA است. پیشگویی اهداف microRNA برپایه استفاده از الگوریتم ارتقا یافته miRanda استوار است که دانش بیولوژیکی کنونی در مورد اصول هدف‌یابی را با لیست به‌روز شده‌ای از microRNAهای پستانداران درهم می‌آمیزد. نواحی هدف پیش‌بینی‌شده توسط miRanda برای تعیین احتمال کاهش بیان mRNA به کمک mirSVR، یک مدل اولیه که برای توالی و دیگر خصوصیات مرتبط با دوبلکس miRNA:mRNA پیش‌بینی‌شده آموزش‌دیده، امتیاز داده می‌شود.

با بررسی‌های انجام‌شده بر روی ژن‌هایی که در تنظیم تمایز سلول‌های Th17 نقش دارند و میانکنش آن‌ها با miRNAهای منتخب، انتخاب این miRNAها بر اساس مطالعاتی صورت پذیرفته است که تاکنون در مقالات معتبر جهانی به چاپ رسیده‌اند و در ارتباط با تمایز سلول‌های Th17 می‌باشند، با در نظر گرفتن اینکه سلول‌های Th17 با ترشح IL-17 نقش مهمی در بیماری‌های خودایمن ازجمله آرتریت روماتوئید، لوپوس، مالتیپل اسکلروزیس، سندرم شوگرن دارند.

 

نتایج

شناسایی دو microRNA که در تمایز سلول‌های Th17 در بیماری آرتریت روماتوئید نقش دارند.

یافته‌های بدست آمده از پایگاه داده Target Scan و MicroRNA نشان داد که miR-20b با مهار بیان Stat3 باعث کاهش تمایز سلول‌های Th17 می‌شود، در مقابل miR-301a با افزایش بیان Stat3 باعث افزایش تمایز سلول‌های Th17 خواهد شد؛ درنتیجه مطالعه ما نشان داد که هر microRNA می‌تواند اهداف مختلفی داشته باشد و همچنین یک ژن واحد می‌تواند به‌عنوان هدف microRNAهای متفاوتی قرار بگیرد و منجر به افزایش بیان و یا کاهش بیان پروتئین خاصی شود.

miR-20b جزء خوشه miRNA 106a-363 است که همـــــــــــراه با miR17-92 و
miR 106b-25 متعلق به خانواده بزرگ بسیار مشابه miR-17 هستند. miR-20b همولوژی بسیار زیادی با miR-17-5p دارد. miR-20b با هدف قرار دادن STAT3 که از فاکتورهای رونویسی اصلی در مسیر تمایز سلول‌های Th17 هستند منجر به کاهش تمایز این سلول‌ها می‌شود.

miR-301a ازجمله microRNAهایی است که در طی تکامل بشدت حفاظت‌شده است و به همراه miR-130a و miR-130b جزء خانواده miR130/301 می‌باشد. miR-301a به‌عنوان یکی از مهم‌ترین microRNAهای فعال‌کننده مسیر NFKB شناخته می‌شود که با افزایش تولید سایتوکین‌های التهابی باعث پیشروی التهاب می‌شود و از طرفی با هدف قرار دادن مسیر IL-6/23–STAT3 در افزایش تمایز سلول‌های Th17 نیز نقش دارد و از این طریق نیز منجر به افزایش التهاب در بافت‌های مختلف خواهد شد.

 

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که پیش‌بینی‌های بیوانفورماتیکی که در این مطالعه انجام شده با تحقیقاتی که تاکنون انجام شده مطابقت دارد.

همانطور که پیش‌تر نیز اشاره شد، علاوه بر RORgt و RORɣa، تکامل سلول‌های Th17 در موش‌ها به STAT3 نیز وابسته است که توسط IL-6 و IL-23 فعال می‌شود. STAT3 نقش‌های بسیاری در تکامل سلول‌های Th17 دارد ازجمله در فعال کردن سلول‌های Th17 که با IL-23 تحریک‌ شده‌اند؛ به این صورت که مستقیماً به پرومتور IL-17a متصل می‌شود و باعث القای بیان IL-17 می‌شود (۱۸، ۱۹). در سلول‌های T بکر که با IL-6 و TGFb تحریک شده‌اند نیز STAT3 برای بیان RORgt لازم است اما توانایی STAT 3 در اتصال به فاکتور رونویسی RORgc هنوز به‌درستی مشخص نشده است (۲۰).

ZHu و همکارانش در سال ۲۰۱۴ نقش miR-20b را در سرطان و بیماران مبتلا به MS گزارش کرده‌اند، همچنین مطالعه آن‌ها نقش miR-20b را در تمایز سلول‌های Th17 در مدل موشی EAE نشان داده است. در این مطالعه دیده شده که بیان miR-20b در طی EAE در سلول‌های T CD4+ کاهش دارد و این کاهش بیان در سلول‌های Th17 محسوس‌تر می‌باشد (۲۱). افزایش بیان miR-20b مانع تمایز Th17 درinvivo  و invitro می‌شود. نتایج این مطالعه نشان داد که miR-20b با هدف قرار دادن stat3 و RORgt به‌صورت منفی در تمایز سلول‌های Th17 نقش دارد. این مطالعه نشان داد که افزایش بیانmiR-20b  بر تمایز سلول‌های Th1 و Th2 بی‌تأثیر است، درحالی‌که می‌تواند بیان سلول‌های Treg را افزایش داده و از طرفی مانع تمایز سلول‌های Th17 شود (۲۱، ۲۲).

در مقابل Marcin و همکارانش در سال ۲۰۱۲ به مطالعه نقش miR-301a در تمایز سلول‌های Th17 پرداخته‌اند. مطالعه آن‌ها نشان داده است که miR-301a با مهار بیان PIAS3 که تنظیم‌کننده منفی stat3 است باعث افزایش بیان stat3 و درنتیجه افزایش تمایز سلول‌های Th17 می‌شود (۲۳). به‌تازگی گزارش شده است که بیان miR-301a در پاسخ به فعال شدن سلول‌های TCD8+ افزایش می‌یابد که احتمالاً نقش تنظیمی بر بیانCD69  دارد (۲۴)، همچنین متعاقب تحریکات TCR نیز افزایش بیان miR-301a دیده شده است. مهار بیان miR-301a باعث کاهش ترشحIL-17  می‌شود و فاکتورهای رونویس مربوط به سلول‌های Th17 ازجمله RORa، RORC و RORgt نیز کاهش نشان می‌دهند (۲۳). بلوکه کردن miR-301a در invitro جمعیت سلول‌های Th17 را بشدت کاهش می‌دهد اما بر روی جمعیت سلول‌های Treg بی‌تأثیر است (۲۵). همچنین با کاهش بیان miR-301a، سیگنال‌رسانی IL-6 و IL-23 نیز کاهش پیدا می‌کند که منجر به کاهش فسفوریلاسیونstat3  می‌شود و از این طریق بر جمعیت سلول‌های Th17 تأثیر می‌گذارد (۲۶).

 

نتیجه‌گیری

miRNAهای عملکردی می‌توانند بسته به نوع سلول، مراحل مختلف تمایز سلول و حتی فعال یا غیرفعال بودن سلول، هدف‌های متفاوتی داشته باشند. مشخصاً یکی از اهداف اصلی در سال‌های آینده تلاش برای فهم و درک پاتوفیزیولوژی بیماری RA و کشف روش‌های درمانی و داروهای مناسب جهت مبارزه با این بیماری است. به نظر می‌رسد درک بهتر نقش microRNAها می‌تواند مسیر دستیابی به اهداف مذکور را هموار سازد.

 

فتانه توسلیان۱، الهام عبدالهی۲

  • دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم پزشکی، گروه ایمنولوژی
  • دانشگاه علوم پزشکی مشهد، دانشکده علوم پزشکی، گروه ایمنولوژی