معماری
آزمایش HbA1C

اندازه گیری hba1c به روش lplc

اندازه‌گیری HbA1c در نمونه‌های Dried Blood Spot) DBS)

به روش LPLC با استفاده از دستگاه DS5

 

خلاصه

کنترل مناسب و به موقع دیابت به میزان زیادی مانع بروز عوارض ناشی از آن و ایجاد بیماری و ناتوانی در فرد می‌گردد، لذا به منظور نظارت بر دیابت فرد و کمک به تصمیم‌گیری‌های درمانی، میزان گلوکز و HbA1c اندازه‌گیری می‌شود این تست جهت ارزیابی کیفیت کنترل بیماری در بیماران دیابتی توصیه می‌گردد. با توجه به محدوديت‌هاي موجود در انجام آزمايش HbA1c به خصوص در كشورهاي در حال توسعه، جمع‌آوري نمونه بيمار بر روي كاغذهاي فيلتر استاندارد به عنوان نمونه آزمايش، امكان نگهداري طولاني‌تر و در صورت نیاز، ارسال نمونه به آزمايشگاه‌هاي ديگر را فراهم مي‌سازد از اين رو در اين مطالعه مقايسه‌اي بين نتايج HbA1c حاصل از نمونه‌هاي DBS (Dried Blood Spot) و خون تام به روش LPLC با استفاده از دستگاه DS5 انجام شده است تا امکان جایگزینی نمونه DBS ارزیابی گردد.

 

مقدمه:

گلبول‌هاي قرمز كروموپروتئينی با وزن مولكولي تقريبي 68000 دالتون هستند كه 94% آنها را گلبولين و 6% بقيه آن را آهن تشكيل مي‌دهد. هموگلوبین یکی از پروتئین‌های داخل گلبول قرمز است که وظیفه حمل اکسیژن در خون را به عهده دارد، هموگلوبین مانند تمام پروتئین‌های دیگر بدن با قندها از جمله گلوکز ترکیب می‌شود.

آزمایش HbA1C

درصد تقريبي هموگلوبين‌هاي مختلف در افراد سالم غيرديابتيك به صورت زير مي‌باشد:

HbA:97%       HbA2:2.5%     HbF:0.5%

غشاي هموگلوبين‌ها كاملاً آماده اتصال به گلوكز است به اين صورت كه گلوكز طي يك واكنش غيرآنزيماتيك و به طور غيرقابل بازگشت در قسمت N– ترمينال والين در زنجيره β به هموگلوبين متصل مي‌شود.

قسمتي از HbA كه قند به آن متصل شده است HbA1 ناميده مي‌شود كه برحسب نوع قند متصل شده به آن به سه جزء اصلي تقسيم مي‌شود كه عبارتند از:    HbA1c, HbA1b, HbA1a

در HbA1c قند متصل شده از نوع گلوكز مي‌باشد كه اين نوع هموگلوبين قسمت عمده (70 تا 90 درصد) HbA1 را تشكيل مي‌دهد، بنابراين ميزان HbA1c رابطه مستقيم با غلظت قند موجود در پلاسما دارد. آزمایش HbA1c براي بررسي وضعيت قند خون بيماران ديابتي در 6 الي 8 هفته گذشته انجام مي‌گردد. با اين آزمایش می‌توان مشکلاتی مانند قند خون بالای بعد از غذا و یا در طول شب را که گاهی اوقات توسط اندازه‌گیری با گلوکومتر تشخیص داده نمی‌شود، به خوبی شناسایی کرد.

برای محاسبه‌ی تقریبی قند خون متوسط از روی مقدارHbA1c می‌توان از فرمول زیر استفاده کرد

7/46 – A1C(%) Hb×7/28eAG(mg/dl)=

12 11 10 9 8 7 6 5 4 HbA1c %
345 310 275 240 205 170 135 100 65 Mean of plasma glucose (mg/dl)

اما در واقعیت دانشمندان مشاهده کرده‌اند که این مقادیر در بسیاری از بیماران به دلایل مختلف با آنچه محاسبه می‌شود متفاوت است.

از آنجايي كه گلبول‌هاي قرمز طول عمري حدود 120 روز دارند ميزان HbA1c سريع تغيير نخواهد كرد. 50% از غلظت HbA1c به دست آمده مربوط به RBCهاي 30 روزه، 40% مربوط به RBCهاي 31 تا 90روزه و تنها 10% از اين ميزان مربوط به گلبول‌هاي قرمز 91 تا 120 روزه مي‌باشد. به همين دليل انجام اين تست هر 3 ماه يك بار به بيماران ديابتي توصيه مي‌شود.

 

محدوده طبيعي و پاتولوژيك HbA1c

4.0 – 6.5% Non Diabetic
6.0 – 7.0 % Goal
7.0 – 8.0% Good Control
>8.0% Action Suggested

 

مطالعات متعددی نشان داده‌ كه نگه داشتن HbA1c كمتر از 7% نه تنها از پیدایش عوارض دیابت در چشم‌ها، كلیه‌ها و اعصاب جلوگیری مي‌كند، بلكه حتی در صورت وجود این عوارض، از پیشرفت آن جلوگیری به عمل مي‌آورد. طبق توصيه انجمن دیابت امریکا مقدار HbA1c باید در بزرگسالان در حد کمتر از 7% حفظ شود ولي اين ميزان برای کودکان و نوجوانان متفاوت است. برای کودکان کوچک‌تر از 6 سال حفظ سطح HbA1c بين 5/7 تا 5/8%، برای کودکان 6  تا 12 سال 8%< و در نوجوانان سطوح کمتر از 5/7% توصیه شده است.

امروزه روش‌هاي متعددي براي اندازه‌گيري تست HbA1c وجود دارد (بيش از 30 روش) كه كليه اين روش‌ها در دو گروه پايه دسته‌بندي مي‌شوند.

اولين گروه شامل روش‌هايي است كه بر پايه تفاوت شارژ الكتريكي بين اجزاء گليكوزيله و غيرگليكوزيله مي‌باشند مثل روش ion exchange chromatography ,Agar gel electrophoresis و گروه دوم شامل روش‌هايي است كه بر پايه تفاوت ساختماني بين اجزاء گليكوزيله و غيرگليكوزيله مي‌باشند مثل روش bronate affinity chromatography و روش‌هاي ايمنولوژيك كه هر كدام از اين روش‌ها محاسن و معايب خاص خود را دارا مي‌باشد.

طي چند سال اخير، آزمايشگاه‌هاي تشخيص پزشكي بيشتر از دو روش
ion exchange chromatography و bronate affinity chromatography جهت اندازه گيري HbA1c استفاده مي‌كنند كه اين روش‌ها علاوه بر محاسني كه دارند نقاط ضعفي نيز دارند؛ به عنوان مثال نياز به تجهيزات خاص دارند يا به طور اختصاصي، HbA1c را جدا نمي‌كنند و در صورت وجود برخي از واريانت‌هاي هموگلوبين يا هموگلوبين‌هاي مديفيه شده، آنها نيز به همراه HbA1c استخراج مي‌گردند. در روش
ion exchange chromatography كه بر اساس تفاوت شارژ الكتريكي بين اجزاء گليكوزيله و غيرگليكوزيله عمل مي‌كند، از بين رفتن بار مثبت در انتهاي والين زنجيره β به غير از زمان گليكوزيله شدن در ساير پيوند‌ها نظير كرباميله شدن يا استيله شدن نيز به وجود مي‌آيد كه اين عوامل باعث ايجاد تداخل در نتيجه آزمايش مي‌گردد. روش bronate affinity chromatography در مقايسه با روش‌هاي ديگر (كه بر پايه شارژ الكتريكي عمل مي‌كنند) كمتر در مقابل هموگلوبينوپاتي‌ها دچار تأثير مي‌شود و يا در متدهايي مانند HPLC با ديدن كروماتوگراف‌ها مي‌توان به وجود هموگلوبينوپاتي‌ها پي برد.

البته به جز هموگلوبينوپاتي‌ها عوامل ديگري نيز بر نتيجه آزمايش تأثيرگذارند، براي مثال هر عاملي كه باعث كوتاه شدن دوره زندگي اريتروسيت‌ها گردد يا مقدار آنها را كاهش دهد (مثل آنمي هموليتيك و يا از دست دادن شديد خون در اثر تصادفات و …) باعث پايين آمدن نتيجه آزمايش به طور كاذب مي‌گردد. همچنين غلظت بالاي ويتامين C و E (به دليل جلوگيري از گليكوزيله شدن هموگلوبين) نيز باعث ايجاد نتايج پايين به صورت كاذب مي‌شوند و در مقابل عواملي مانند آنمي فقر آهن، غلظت بالاي تري‌گليسيريد، بيليروبين و اوره در خون، مصرف طولاني مدت الكل و مواد مخدر باعث گزارش نتايج بالاي كاذب در بعضي روش‌ها مي‌گردد.

در حال حاضر روش‌هاي متــــــداول در ايران شامل ion exchange chromatography HPLC , LPLC , مي‌باشد و نمونه موردنياز جهت اندازه‌گيري HbA1c در تمامي روش‌هاي ذكر شده خون تام (خون حاوي ماده ضد انعقاد EDTA) مي‌باشد كه به مدت حداكثر يك هفته در دماي يخچال (8-2 درجه سانتيگراد) قابل نگهداري است. با توجه به محدوديت‌هاي موجود در انجام آزمايش HbA1c به خصوص در كشورهاي در حال توسعه، جمع‌آوري نمونه بيمار بر روي كاغذهاي فيلتر استاندارد به عنوان نمونه آزمايش، امكان نگهداري طولاني‌تر و ارسال آسان‌تر نمونه به آزمايشگاه‌هاي ديگر را فراهم مي‌سازد. از اين رو در مقاله پیش رو مقايسه‌اي بين نتايج HbA1c حاصل از نمونه‌هاي خون تام و DBS (Dried Blood Spot) به روش LPLC با استفاده از دستگاه DS5 (اين دستگاه داراي تأييديه NGSP مي‌باشد) انجام شده است.

روش مطالعه

در اين بررسي تعداد 75 بيمار ديابتي داراي ديابت نوع 1 و 2 مورد ارزيابي قرار گرفتند. نمونه خون وريدي از بيماران در لوله‌هاي حاوي ماده ضد انعقاد EDTA جمع‌آوري گرديد.

 

تهيه نمونه‌هاي DBS

كاغذ فيلتر مورد استفاده در اين مطالعه واتمن Grade 903 بوده كه قبل از لكه‌گذاري مطابق پروتكل CLSI LA4-A4 از نظر كيفيت مورد ارزيابي قرار گرفته و تأييد شده است.

مقادير 20µl و به تعداد 5 لكه از هر نمونه بر روي يك كاغذ فيلتر لكه‌گذاري شده و كاغذ فيلترها جهت خشك شدن به مدت 4 ساعت در دماي اتاق قرار داده شد.

ابتدا نمونه‌هاي خون تام توسط دستگاه DS5، در شرايط قابل قبول آزمايشگاهي و در مقابل كنترل‌هاي تجاري معتبر مورد آزمايش قرار گرفتند و نتايج HbA1c آنها ثبت گرديد.

جهت انجام آزمايش روي نمونه‌هاي DBS ابتدا دو دیسک خونی 1.8 inch (3mm) از هر نمونه (حاوی 10µlخون تام) پانچ كرده و داخل لوله آزمايش گذاشته شد و سپس 1000µl از محلول هموليزانت كيت سيستم DS5 به آن اضافه گرديد، سپس لوله‌ها به مدت 3 ساعت در دماي اتاق قرار داده شد. در اين مدت چند بار لوله‌ها را تكان داده و سپس اطمينان حاصل گردید كه ديسك‌هاي خون كاملاً داخل محلول قرار گرفتند. پس از پايان زمان موردنظر بدون اينكه ديسك‌هاي خوني از داخل لوله آزمايش درآورده شوند بوسيله شيكر محلول داخل لوله‌ها را به خوبي مخلوط كرده و سپس محلول يكنواخت شده جهت اندازه‌گيري غلظت HbA1c به دستگاه داده شد.

 

يافته‌ها

75 نمونه ارزيابي شده در محدوده غلظتي 5/4% تا 9/12% HbA1c قرار داشتند. ميانگين غلظتي در نمونه‌های خون تام 9507/7% و در نمونه‌های DBS، 9640/7% مي‌باشد. مقايسه آماري نتايج که توسط نرم‌افزار SPSS انجام شده است، نشانگر همخوانی بالای نتايج حاصل از دو نمونه مورد ارزیابی مي‌باشد.

r = 0.993               r² = 0.986

Y = 0.947 X + 0.434

نمودار معادله خطی فوق در شکل زیر نمایش داده شده است.

 

با توجه به آناليز آماري نتایج ( P = 0.6296)، اختلاف بين ميزان HbA1c در نمونه‌هاي خون تام و DBS معني‌دار نمي‌باشد. نمودار اختلاف نتايج در زير نمايش داده شده است:

 

همچنین لازم به ذکر است که محدوده قابل قبول برای اختلاف بین نتایج حاصل از مقایسه دو روش، طبق استاندارد NGSP معادل 7.5% +- در نظر گرفته شده است که اختلاف نتایج بدست آمده در این مطالعه در محدوده قابل قبول قرار داشت.

 

بحث و نتیجه‌گیری

همخوانی بالای نتایج به دست آمده از هر دو نمونه و معنی‌دار نبودن اختلاف نتایج آنها، نمایانگر امکان استفاده و جایگزینی نمونه DBS به جای نمونه خون تام در روش LPLC می‌باشد. حجم کم نمونه مورد‌نیاز در این نوع نمونه‌گیری و آسان بودن این روش که حتی نیاز به فرد متخصص آزمایشگاهی ندارد این امکان را فراهم می‌آورد که با آموزش بیماران دیابتی، نمونه در منزل و توسط خود بیمار گرفته شده و سپس جهت انجام آزمایش به راحتی به آزمایشگاه ارسال گردد، به این ترتیب احتمال انجام به موقع این آزمایش در بیماران دیابتی بالا رفته و به تبع آن احتمال بروز عوارض شایع دیابت همچون رتینوپاتی، نفروپاتی، نوروپاتی و …که ناشی از افزایش مزمن قند خون می‌باشد به حداقل می‌رسد.

 

یلدا غلامیان
References:

1-Lomeo A, Bolner A, Scattolo N, Guzzo P, Amadori F, Sartori S, Lomeo L.HPLC analysis of HbA1c in dried blood spot samples (DBS): a reliable future for diabetes monitoring.

Clin Lab. 2008;54(5-6):161-7.

2-Jones TG, Warber KD, Roberts BD.Analysis of hemoglobin A1c from dried blood spot samples with the Tina-quantR II immunoturbidimetric method.

J Diabetes Sci Technol. 2010 Mar 1;4(2):244-9.

  1. Fokkema MR, Bakker AJ, de Boer F, Kooistra J, de Vries S, Wolthuis A. HbA1c measurements from dried blood spots: validation and patient satisfaction. Clin Chem Lab Med. 2009;47(10):1259–1264. [PubMed]             4-clinical chemistry 166-174(2004)                                                                                                                          5-laboratory medicine practice guidelines(27-33)                                                                                                     6- www.ngsp.org

 

 

 

پاسخ دهید