معماری

بررسی تنوع ژنوتیپی گونه‌های پاپیلوما ویروس در نمونه‌های ضایعات دهانی بیماران مبتلا به سرطان دهان در ایران

سرطان سلول سنگفرشی حدود ۹۳% از سرطان‌های حفره‌ی دهانی را تشکیل می‌دهد. یکی از عوامل ایجادکننده‌ی این سرطان، ویروس پاپیلومای انسانی است که تنوع ژنوتایپی گوناگونی دارد. تعیین ژنوتیپ‌های شایع پاپیلوما در ایجاد سرطان دهان می‌تواند در کنترل و جلوگیری از انتقال آن نقش داشته باشد.

مواد و روش‌ها: ۷۰ نمونه بافت پارافینه از بخش کنسر در بیمارستان امام خمینی تهیه شد، پس از پارافین‌زدایی، با کمک نرم‌افزار Gene Runner، ۱ پرایمرفوروارد و ۳ پرایمر ریورس دژنره‌شده برای شناسایی ژنوتیپ‌های ۶-۱۶-۱۸-۳۳-۳۴ طراحی گردید. نمونه‌ها برای انجام واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفته سپس روی ژل آگارز الکتروفورز شدند. پس از برقراری جریان به مدت ۳۰ دقیقه، نمونه‌ها با نور UV مشاهده شدند. نمونه‌های+ HPV با نرم‌افزار Blast در NCBI تعیین سکانس شدند.

نتایج: ۸ نمونه‌ی +HPV به دست آمد که ۳ نمونه HPV+6 و ۵ نمونه HPV+16 بودند. HPV+6 عامل مولد زگیل تناسلی است که از طریق تماس پوست با پوست یا روابط دهانی تناسلی انتشار می‌یابد. از بین نمونه‌ها، ۳ نمونه مربوط به زنان و ۵ نمونه مربوط به مردان است. انتشار ویروس در مردان ۲% بیشتر از زنان است. بالاترین استعداد ابتلا به بیماری در سنین بین ۳۰ تا ۴۵ سال و پس از آن بالای ۶۰ سال است. همچنین بالاترین نمونه‌های HPV+ مربوط به شهر تهران و پس از آن اسلام‌شهر است.

کلیدواژه‌ها: کارسینوم, سلول سنگفرشی, ویروس پاپیلومای انسانی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

مقدمه:

سرطان دهان از کنترل خارج شدن رشد و تکثیر سلول‌های سنگفرشی دهان است که «کارسینوم اسکواموس» نامیده می‌شود و در ابتدا به‌صورت ضایعات پیش‌سرطانی مشاهده می‌شود (۴۹-۴۷-۲۳-۱). این بیماری اغلب لثه، غدد بزاقی، لب، غدد لنفاوی گردن، لوزه‌ها، گونه‌ها، فک و زبان را درگیر کرده و سبب لق شدن دندان‌ها، بدشکلی صورت، گلودردهای مداوم، اختلال در بلع، زخم‌های سفید و دیر‌خوب‌‌شونده در دهان و گوش‌دردهای طولانی‌مدت می‌شود (۵۲-۴۸-۲۱-۱۷).

عوامل متعددی از قبیل مصرف سیگار و الکل، روابط جنسی دهانی- تناسلی، سابقه‌ی سرطان، دندان خراب، نور خورشید، رژیم غذایی فاقد میوه و سبزی تازه و سن بالای ۴۰ سال، شانس ابتلا به سرطان را افزایش می‌دهد (۵۷-۴۴-۳۵-۱۹-۱۱).

پاپیلوماویروس از خانواده‌ی ویروس‌های DNA دار و دورشته‌ای، دارای ۱۰۰ ژنوتیپ مختلف است که تمایل بسیاری به سلول‌های پوششی پوست و سلول‌های مخاطی دارد، بنابراین در پوست طبیعی افراد سالم به‌وفور یافت می‌شود و حتی می‌تواند سبب بروز انواع سرطان‌ها ازجمله سرطان دهان گردد (۳۱-۲۵-۲۲-۱۰-۴).

اگر ضایعات پیش‌سرطانی در مراحل اولیه‌ی عفونت تشخیص داده نشود، از لحاظ مورفولژیکی، ضایعه‌ی خوش‌خیم به بدخیم تبدیل می‌شود (۲۸-۱۷)، لذا تشخیص به‌موقع عفونت ویروسی می‌تواند در جلوگیری از پیشرفت ضایعات مؤثر باشد. اگرچه ویروس پاپیلوما ژنوتیپ‌های مختلفی دارد، اما تمام ژنوتیپ‌های آن نمی‌تواند سبب بروز سرطان دهان شود.

اربابی و همکاران با بررسی نمونه‌های بزاق دهان و استفاده از روش PCR – RT، فقط ژنوتیپ‌های ۱۶ و ۱۸ را در ارتباط با سرطان دهان شناسایی کردند (۵). مشهدی، هراتیان و نیک‌اخلاق با همکارانشان نیز در آزمایشاتی جداگانه و با استفاده از روش PCR، نتیجه‌ی مشابهی بدست آوردند (۳۱-۲۲-۲۱). در اسپانیا لاماس و همکارانش تنها ژنوتیپ ۱۶ را از نمونه‌ی بیماران جدا کردند (۳۹-۳۸-۳۷). در هند نیز گوت-هی توانست ژنوتیپ ۱۸ را از بیماران جدا کند (۲۸-۱۳-۷).

در آرژانتین، آنیلس و همکارانش استخراج ژنوتیپ ۶ و ۱۶ را در نمونه‌های بیماران گزارش کردند (۶۲-۱۶-۳-۲)، لذا با توجه به اهمیت پاپیلوما ویروس در ایجاد سرطان دهان، این تحقیق بر پایه‌ی شناسایی ژنوتیپ‌های شایع این ویروس در ایجاد بیماری در بین مراجعه‌کنندگان به بیمارستان امام خمینی تهران انجام گرفته است تا شاید گامی در جهت شناسایی به‌موقع و پیشگیری‌کننده از سرطان دهان برداشته شود.

 

مواد و روش‌ها:

نمونه‌برداری

در این مطالعه‌ی توصیفی- تحلیلی ۷۰ نمونه بلوک پارافینی که دارای بافت کافی بود از بین پرونده‌های موجود در بخش کنسر در بیمارستان امام خمینی تهران انتخاب شدند. این نمونه‌ها از سراسر کشور جمع‌آوری ‌شده و به این مرکز انتقال یافته بودند که ۳۵ نمونه مربوط به زنان و ۳۵ نمونه مربوط به مردان بود. سن بیماران مراجعه‌کننده نیز از ۱۵ تا ۷۵ سال بوده است. اسلایدهای میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفت و وجود سرطان در بافت‌ها تأیید گردید.

 

استخراجDNA  وPCR

نمونه‌ها به‌وسیله‌ی دستگاه میکروتوم به قطر ۹/۰ میلی‌متر برش زده شد و یک شب در دمای محیط قرار گرفت، سپس بافت‌ها پارافین‌زدایی شدند. برای این کار از بافر Deparaffinization، اتانل، بافر لیزکننده و پروتئاز در مراحل مختلفی استفاده شد و سانتریفیوژ انجام گرفت. در مرحله‌ی پایانی نمونه‌ها توسط بافر Elution Buffer از ستون جدا شده و محلول محتوی DNA سریعاً به فریزر و دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد انتقال یافت.

۲۴ ساعت بعد، برای تعیین مقدار و کیفیت DNA استخراج‌شده از روش الکتروفورز، استفاده شد. باندهای حاصل از DNA در هر نمونه که دارای کمترین کشیدگی و کاملاً واضح بود، کیفیت مطلوب DNA را نشان می‌داد. به‌منظور انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) بر روی نمونه‌ها، ابتدا توسط نرم‌افزار Gene runner، ۵ پرایمر سنس و ۱۳ پرایمر آنتی‌سنس بر اساس پروتئین‌های اولیه‌ی E6 و E7 طراحی گردید، سپس پرایمرها دژنره شده و در نهایت یک پرایمر سنس و سه پرایمر آنتی‌سنس به دست آمد. توالی پرایمرهای مورد استفاده به شرح زیر است:

 

 

 

سپس مخلوط PCR در حجم ۲۵ میلی‌لیتر به شرح زیر تهیه شده و درون تیوب‌های ml2/0 استریل آماده گردید.

مقادیر (ML) ترکیبات
۱ پرایمر F
۱ پرایمر R
۵/۱۲ Master mix
۳ DNA الگو
۵/۷ H2O استریل
ml25 حجم نهایی

 

جدول ۱: اجزای PCR و مقادیر آن برحسب میلی‌لیتر

سپس فرآیند PCR شامل مراحل زیر انجام گرفت:

  • مرحله‌ی اول شامل ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه
  • مرحله‌ی دوم شامل ۴۰ چرخه‌ی سه مرحله‌ای مشتمل بر:
  • ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۵ ثانیه
  • ۵۴ درجه‌ی سانتی‌گراد به مدت ۴۵ ثانیه
  • ۷۲ درجه‌ی سانتی‌گراد به مدت ۱ دقیقه
  • مرحله‌ی سوم شامل ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۷ دقیقه

بعد از پایان فعالیت دستگاه، فرآورده‌های PCR به دستگاه الکتروفورز انتقال یافته و سرانجام نتایج پس از رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید با استفاده از نورافشان اشعه‌ی فرابنفش مورد بررسی قرار گرفتند. از ۷۰ نمونه تحت بررسی، تنها ۸ نمونه مثبت شدند.

 

 

توالی‌یابی و آنالیز نتایج:

Ladder استفاده‌شده در این تحقیق طولی معادل ۵۰۰ جفت باز دارد. باندهای تشکیل‌شده در نمونه‌های مثبت نیز طولی معادل ۴۳۵ تا ۴۹۲ جفت باز داشتند. مثبت شدن این نمونه‌ها نشان می‌داد بروز سرطان سر و گردن با حضور ویروس پاپیلوما در ارتباط است.

با انجام مراحل تعیین توالی ژنی و استفاده از روش‌های بیوانفورماتیک، ژنوتیپ‌های اصلی ایجادکننده‌ی سرطان سر و گردن در بین ژنوتیپ‌های مورد مطالعه‌ی ۶-۱۱-۱۶-۱۸-۳۳-۳۴ مورد بررسی قرار گرفتند.

در این مرحله مکان‌های مشابه بین دو یا چند توالی که می‌تواند نشان‌دهنده‌ی ارتباط عملکردی، ساختاری و یا تکاملی مابین توالی‌ها باشد، هم‌تراز شده و به شکل سطرهایی زیر هم درون یک ماتریس نشان داده شد. هم‌تراز کردن نمونه‌های مثبت توسط نرم‌افزار MEGA5 انجام گردید. تعیین توالی نوکلئوتیدی محصول PCR نیز توسط شرکت ژن فناوران انجام گرفت، سپس توسط نرم‌افزار Blast در NCBI مقایسه صورت گرفت. پس از انجام PCR و توالی‌یابی ژنی، پرونده‌های بیماران بررسی و اطلاعات دموگرافیک موردنیاز استخراج و مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت.

 

یافته‌ها:

در مطالعه‌ی حاضر که جهت بررسی ژنوتیپ‌های شایع پاپیلوما ویروس در ایجاد سرطان دهان بر روی ۷۰ بیمار انجام گرفت، ۸ نمونه پس از انجام PCR و الکتروفورز مثبت شدند. توالی‌های نوکلئوتیدی نمونه‌های مثبت پس از توالی‌یابی توسط نرم‌افزار Blast+ در NCBI مورد بررسی قرار گرفتند. پس از انجام بررسی‌ها نتایج زیر بدست آمد:

 

 

نمونه‌های مثبت حاوی ژنوتیپ‌های ۱۶ و ۶ بودند که ۳ نمونه HPV6 و ۵ نمونه HPV16 بود.

از سه نمونه‌ی HPV6، یک نمونه‌ی مربوط به زن و از نمونه‌ی HPV16، دو نمونه‌ی مربوط به زنان بوده ولی سایر نمونه‌ها مربوط به مردان بودند.

نمونه‌های مثبت از نظر فراوانی در گروه‌های مختلف سنی نیز جداسازی شده و در جدول زیر قرار گرفتند.

درصد ابتلا به سرطان گروه سنی افراد
ــــ ۳۰ – ۱۵
۴ ۴۵ – ۳۰
۲ ۶۰ – ۴۵
۲ ۶۰ سال به بالا

 

جدول ۲: فراوانی نمونه‌های HPV+ در بین گروه‌های سنی مختلف

برطبق این مطالعات، بیشترین ابتلا به سرطان دهان در بین افراد ۳۰ تا ۴۵ سال و کمترین شانس ابتلا در بین افراد ۱۵ تا ۳۰ سال مشاهده شده است، همچنین نمونه‌های HPV+ از نظر پراکندگی محل سکونت با استفاده از نرم‌افزار SPSS مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفتند (نمودار ۱). مطابق با نمودار، در تهران و اسلام‌شهر نسبت به سایر شهرها، نمونه‌های HPV+ بیشتری گزارش شده است.

۲
تهران
۱
کرج
اسلامشهر
۲
زابل
۱
مازندران
۱
سنندج
۱
 

 

 

تعداد بیماران

 

 

 

نمودار ۱: توزیع فراوانی ژنوتیپ‌های پاپیلوما ویروس براساس شهر محل سکونت با استفاده از نرم‌افزار SPSS

 

بحث:

امروزه مطالعه بر روی سرطان سلول سنگفرشی به‌عنوان شایع‌ترین تومور حفره‌ی دهانی و ارتباط آن با فاکتورهای مختلف، اساس تحقیقات گسترده‌ای در سراسر دنیا است (۴۱-۳۵-۱۷-۹-۵). در این مطالعه تنوع ژنوتیپی گونه‌های پاپیلوما ویروس در ارتباط با سرطان دهان مورد بررسی قرار گرفت، سپس ارزیابی حضور ویروس پاپیلومای انسانی توسط روش PCR انجام شد تا حضور ویروس در DNA بیماران به‌صورت مثبت یا منفی تعیین گردد.

مزیت مهم روش PCR نسبت به سایر روش‌ها و دلیل انتخاب آن در این مطالعه، اختصاصی بودن و حساسیت بالای این روش می‌باشد که با استفاده از DNA به‌راحتی قابل انجام است (۴۸-۳۹-۱۸).

در این تحقیق ۴% از مبتلایان در اثر HPV6 و ۷% در اثر HPV16 آلوده شده بودند، اگرچه طبق نتایج بدست آمده در تحقیقات گلزاری، نیک‌اخلاق و هراتیان انتظار می‌رفت ژنوتیپ‌های ۱۶ و ۱۸ در نمونه‌ها یافت شود. بر اساس نتایج نیک اخلاق فقط ۳% از نمونه‌های سرطان دهانHPV+ بودند و مصرف سیگار، اشعه‌ی آفتاب و ژنتیک مؤثرتر از ویروس پاپیلوما در نظر گرفته شده است، اما در تحقیقات حاضر چون در پرونده‌های بیماران اشاره‌ای به سیگاری بودن یا نبودن آن‌ها نشده بود، نمی‌توان دراین‌باره نظری ارائه کرد.

هراتیان و همکاران نیز بر روی بیماران مبتلا به سندروم فانکونی (نوعی آنمی) مطالعه انجام داده بودند. گرچه این مطالعه درصد بالایی از HPV16 و سپس HPV18 را گزارش کرده بود، اما پرونده‌ی بیماران تحت مطالعه، ازنظر وجود یا عدم وجود بیماری‌های دیگر بررسی نشده بودند.

در این میان اربابی و همکارانش از روش RT-PCR استفاده کرده و بزاق افراد را تحت بررسی قرار دادند. آن‌ها نیز در تحقیقات خود HPV16 و HPV18 را به‌عنوان نمونه‌های شایع گزارش کردند.

نمونه‌های منفی بسیاری در این تحقیق بدست آمد و نشان داد استفاده از بزاق ضریب اطمینان کمتری نسبت به بافت آلوده‌ی سرطانی در تشخیص وجود ژنوتیپ‌های مختلف پاپیلوما ویروس دارد.

پرایمرهای استفاده شده در این تحقیق بر اساس پروتئین‌های اولیه‌ی E7 و E6 طراحی شده بود. اگرچه کمپیسی[۱] در آمریکا نیز از همین پروتئین‌ها برای تشخیص HPV استفاده کرده بود، اما نتایج به‌دست‌آمده‌ی او نیز تنها ژنوتیپ‌های ۱۶ و ۱۸ را در نمونه‌ها یافت.

نتیجه‌ی به دست آمده در این مطالعه کاملاً مشابه نتایج آنیلیس[۲] و همکارانش در آرژانتین است. گرچه آنان از روش RFLP – PCR و پرایمرهای My11 و My09 استفاده کردند ولی توانستند ژنوتیپ‌های ۱۶ و ۶ را در نمونه‌ها بیابند.

البته تفاوت‌های بدست آمده در نتایج حاصل می‌تواند به تفاوت‌هایی از جمله تغییر در شرایط جغرافیایی، نوع تغذیه، رعایت بهداشت دهان و دندان، مصرف یا عدم مصرف سیگار، قرار گرفتن در معرض مستقیم تابش خورشید و آلودگی هوا نیز مربوط باشد. در هر حال وجود ژنوتیپ ۶ از ویروس پاپیلوما در نمونه‌های مثبت بیماران اشاره به راه‌های دیگر انتقال ویروس دارد.

HPV 6 عامل بروز زگیل تناسلی است که انتقال آن از طریق پوست به پوست و یا از طریق ارتباط دهانی- تناسلی صورت می‌گیرد و با هر روش آمیزشی قابل‌انتقال است. زگیل تناسلی نیز به‌طور قابل‌رؤیت در تمام افراد بروز نمی‌کند، بلکه فقط ۱ تا ۵ درصد از افراد مبتلا به زگیل تناسلی، آلودگی قابل‌مشاهده دارند؛ بنابراین افراد آلوده بدون هیچ علامتی می‌توانند سبب انتشار ویروس شوند. از سوی دیگر پس از بررسی پراکندگی و شیوع بیماری بین زنان و مردان، تعداد زنان مبتلا کمتر از مردان به دست آمد.

مطابق با این مطالعه، ۳ نفر زن و ۵ نفر مرد با ژنوتیپ‌های HPV+  شناسایی شدند، لذا به نظر می‌رسد احتمال آلودگی مردان از زنان بیشتر است، این در حالی است که تاکنون هیچ نوع بررسی در ایران بر روی جنسیت افراد و آلودگی با ویروس پاپیلوما صورت نگرفته بود. در سودان نیز نتایج به‌دست‌آمده توسط بابیکر[۳] و همکارانش برعکس نتایج بدست آمده است؛ یعنی میزان زنان مبتلا به سرطان دهان در اثر آلودگی با HPV  نسبت به مردان بیشتر است. علت این تفاوت به نحوه‌ی زندگی، عادات تغذیه‌ای، شرایط آب و هوایی و حتی آمیزش جنسی اشاره دارد.

همچنین نمونه‌های HPV+  از نظر محل سکونت نیز مورد بررسی قرار گرفتند. بیشترین آمار مربوط به شهر تهران و سپس اسلام‌شهر بود. آخرین تحقیقات انجام‌شده توسط فاضلی و همکارانش، سیر تکاملی سرطان دهان را نشان داده ولی به گستردگی و شیوع آن در شهرهای مختلف اشاره‌ای نداشته است. ضمناً این مطالعات مربوط به سال ۸۳ می‌باشد و پس ‌از آن بررسی‌های مجدد آماری انجام نشده است. حال با توجه به رشد بیماری و حضور ژنوتیپ‌های HPV در نمونه‌های بیماران، بررسی‌های بیشتر ضروری است.

ضمناً در این مطالعه فراوانی بیماری سرطان دهان در بین گروه‌های سنی مختلف نیز مورد بررسی قرار گرفت؛ طبق این تحقیق بیشترین آمار مبتلایان مربوط به گروه‌های سنی ۳۰ تا ۴۵ سال است و در افراد با سن کمتر از ۳۰ سال هیچ نمونه‌ی مثبتی یافت نشد. لازم به ذکر است در هیچ‌کدام از پژوهش‌های انجام‌شده سن افراد مورد بررسی قرار نگرفته بود.

اگرچه با افزایش سن و کاهش قدرت سیستم ایمنی بدن، شانس ابتلا به انواع سرطان‌ها افزایش می‌یابد، اما مطابق با نتایج بدست آمده، خطر ابتلا به سرطان دهان، در سنین ۳۰ تا ۴۵ سال بیشتر است و پس از آن افراد بالای ۶۰ سال نسبت به سایر گروه‌ها در معرض خطر بیشتری قرار دارند.

 

نتیجه‌گیری:

با توجه به اطلاعات به‌دست‌آمده، HPV6 و HPV16 در بروز سرطان دهان نقش دارند. شیوع HPV6 نیز با زگیل تناسلی مرتبط است که انتشار آن را از طریق روابط دهانی- تناسلی سریع‌تر و آسان‌تر می‌سازد. همچنین وجود ویروس پاپیلوما در افراد ۳۰ تا ۴۵ سال نسبت به سایر گروه‌ها بیشتر گزارش شده است. لازم به ذکر است طبق مطالعه و تحقیق انجام‌شده، آمار مردان مبتلا به سرطان دهان در اثر پاپیلوما ویروس نسبت به زنان بیشتر است.

[۱]. Kimpisi

[۲]. Anilis

[۳]. Ali Yousef Babiker

الهام پوییده۱، دکتر احسان عارفیان۲، دکتر علی‌اصغر دلدار۳، دکتر عباس اخوان سپهی۴

۱- کارشناس ارشد میکروبیولوژی دانشگاه علوم تحقیقات

۲- استادیار بخش ویروس‌شناسی

۳- استادیار گروه ژنتیک دانشگاه مالک اشتر

۴- استاد گروه میکروبیولوژی

پاسخ دهید