معماری
dna

رمزینه‌گذاری DNA Barcoding) DNA)

رمزینه‌گذاری DNA (Barcoding DNA)

 شناسایی و طبقه‌بندی گونه‌ها از مهمترین بخش‌های آرایه‌بندی[1] و مطالعات زیستی است. آرایه‌بندی شامل دو بخش طبقه‌بندی و نامگذاری است و هدف آن گروه‌بندی موجودات زنده به واحدهای طبیعی می‌باشد که توصیف تنوع زیستی و شناسایی گونه را امکان‌پذیر کرده و در ضمن منعکس کننده روابط خویشاوندی بین گروه‌های مختلف موجودات زنده می‌باشد. هدف متخصصین آرایه‌بندی[2] ایجاد یک نظم قابل قبول در بین گروه‌های ناهمگن موجودات زنده برای سهولت در امر برقراری ارتباط بین گروه‌ها و نیز ایجاد روش‌هایی است که توسط دیگران قابل استفاده و آزمایش باشد. برای نیل به این هدف، دانشمندان راهکارهای مختلفی را مورد استفاده قرار داده‌اند که عموما از این راهکارها تحت عنوان مفاهیم گونه یاد می‌شود. در منابع علمی، تقسیم‌بندی‌های متعددی از مفاهیم گونه ذکر شده است که از بین آنها می‌توان به مفاهیم تئوریک و مفاهیم کاربردی گونه اشاره کرد. مفاهیم کاربردی دارای ارزش شناسایی و کاربردی می‌باشند که از این بین می‌توان به مفهوم گونه مورفولوژیک[3] ، گونه بیولوژیک[4] و مفهوم گونه فیلوژنتیک[5] اشاره کرد. با وجود اینکه مفهوم فیلوژنتیک گونه نیز تحت تاثیر متغیرهای مختلف از قبیل ناحیه یا نواحی ژنومی مورد استفاده برای برآورد روابط خویشاوندی بین گروههای مختلف می‌باشد، بنابراین الگوریتم مورد استفاده برای ترسیم درخت فیلوژنتیک و برخی مؤلفه‌های دیگر قرار می‌گیرد، ولی در مقایسه با راهکارهای دیگر نتایج قابل اعتماد و تکرار پذیرتری را ایجاد می‌نماید. در تاریخ زیست‌شناسی، دانشمندان از داده‌های مختلفی برای شناسایی موجودات زنده استفاده کرده‌اند که از بین آنها می‌توان به داده‌های مورفولوژیک، فیزیولوژیک و بیولوژیک اشاره کرد. نیاز به دانش تخصصی یکی از اصلی‌ترین عوامل محدود کننده در استفاده از داده‌های ریخت‌شناختی برای شناسایی صحیح و دقیق گونه‌ها می‌باشد و در کنار این فاکتور، عوامل ناشی از برخی ویژگی‌های منحصر به فرد موجودات نیز از مشکلات دیگر روش‌های ریخت‌شناختی به شمار می‌رود. با پیشرفت‌های اخیر در زیست‌شناسی مولکولی و توسعه روشهای مولکولی بر پایه DNA، دانشمندان از این روش‌ها برای شناسایی سریع و دقیق بهره جسته‌اند. روش‌های مولکولی شناسایی، عمدتا بر اساس تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و یا تکنیک‌های مبتنی بر این واکنش استوار می‌‌باشند که به صورت رایج در آزمایشگاه‌ها برای شناسایی گونه‌های موجودات با اهمیت اقتصادی بالا در پزشکی، کشاورزی و صنعت مورد استفاده واقع شده‌اند.

dna

از روش‌های مولکولی دیگر می‌توان به تکنیک هیبریداسیون [6]DNA، RFLP2 و AFLP3 اشاره نمود. از روش‌های نوین برای شناسایی گونه، استفاده از اطلاعات توالی DNA است که اهمیت زیادی دارد. با پیشرفت‌های اخیر در فناوری‌های توالی‌یابی از جمله روش پایروسکوئنسینگ، توالی‌یابی نواحی ژنی با سرعت عمل و دقت بالا انجام می‌گیرد. استفاده از داده‌های توالی در شناسایی به‌ویژه برای افراد غیر متخصص در زمینه شناسایی مبتنی بر ریخت‌شناسی از اهمیت فوق‌العاده‌ای برخوردار می‌باشد. اندیشه استفاده از سیستم شناسایی مولکولی استاندارد برای شناسایی گونه‌ها مربوط به دهه 1990 است. در این سال‌ها اختراع روش PCR و تکثیر ژن‌های موجودات زنده و به دنبال آن توسعه تکنیک‌های توالی‌یابی و تعیین توالی قسمت‌های مختلف ژنومی و امکان مقایسه‌ی آنها افق جدیدی برای حل مشکلات فراروی تاکسونومیست‌ها ایجاد کرد. با دسته‌بندی توالی‌ها و مقایسه آنها با استفاده از روش‌های آماری و بیوانفورماتیک، درختچه فیلوژنتیک ترسیم می‌شود و روابط خویشاوندی موجودات زنده تعیین می‌شود. برای این منظور از DNA ژنومی، میتوکندری، کلروپلاست و غیره استفاده می‌گردد. رمزینه‌گذاری DNA یک سیستم شناسایی مبتنی بر استفاده از داده‌های توالی نوکلئوتیدی ترجیحاً یک ژن و یا تعداد معدودی از نواحی ژنی برای شناسایی سریع و دقیق گونه‌های موجودات زنده به شمار می‌رود. به دنبال مشخص شدن موقعیت فیلوژنتیک یک گونه بر اساس داده‌های توالی نوکلئوتیدی روی درختچه فیلوژنتیک و مقایسه توالی گونه هدف با گونه‌های دیگر با درجه تشابه بالا، طراحی رمزینه DNA برای گونه مورد نظر امکان‌پذیر خواهد بود. در واقع رمزینه‌گذاری DNA به شناسایی گونه‌ها با استفاده از داده‌های توالی یک یا تعداد بیشتری از ژن‌ها می‌پردازد. رمزینه‌گذاری DNA، صرفاً آرایه‌بندی نیست بلکه روشی با توان عملیاتی بالا، کارآمد و دقیق برای شناسایی دقیق گونه‌ها در همه شاخه‌ها است که بر اساس آن شناسایی و در نهایت شمارش تمام سازواره‌ها[7] امکان‌پذیر می‌شود. رمزینه‌گذاری DNA از این نظر که از داده‌های توالی برای شناسایی آرایه‌ها استفاده می‌شود با فیلوژنی مولکولی مشابهت دارد، ولی هدف اصلی در فیلوژنی ملکولی، مطالعه و بازسازی روابط خویشاوندی بین موجودات زنده در سطوح مختلف تاکسونومیک (گونه، جنس، خانواده و راسته و …) بر اساس داده‌های توالی می‌باشد و در این راستا هر چه تعداد ژن‌های مورد استفاده بیشتر باشد فهم واقع بینانه‌تری از روابط خویشاوندی در سطح مختلف تاکسونومی حاصل می‌شود، حتی با پیشرفت‌هایی که سالهای اخیر در فناوریهای توالی‌یابی ایجاد شده است، مقایسه توالی‌های ژنومی در مطالعات فیلوژنتیکی دور از انتظار نیست. در حالی‌که هدف اصلی در رمزینه‌گذاری DNA شناسایی مطمئن آرایه‌ها بر اساس داده‌های توالی می‌باشد و این داده‌ها عموما فاقد کارآیی فیلوژنتیک در سطوح بالای تاکسونومی هستند.

اولین قدم برای رمزینه‌گذاری DNA ایجاد توالی رمزینه مرجع برای گونه‌های مختلف موجودات زنده می‌باشد. توالی‌های مرجع در یک کتابخانه جهانی و با قابلیت دسترسی عمومی قرار داده می‌شوند و بدین‌ترتیب از طریق مقایسه و جستجوی توالی رمزینه گونه ناشناخته در کتابخانه جهانی توالی رمزینه‌های مرجع، امکان شناسایی سریع گونه ناشناخته فراهم می‌شود. برای این منظور کنسرسیوم رمزینه‌گذاری موجودات زنده با موسسه و سازمان‌های دولتی و غیر دولتی در کشورهای مختلف همکاری می‌کند و در حال حاضر، این کنسرسیوم به صورت رسمی در حال اجرای پروژه‌های مشترک رمزینه‌گذاری DNA با 50 کشور است. به­طور کلی رمزینه‌گذاری سه بخش عمده را شامل می‌شود:

1) جمع‌آوری، شناسایی و نگهداری نمونه‌های مرجع در مراکز معتبر: شناسایی صحیح و نگهداری نمونه‌هایی که بر اساس آنها توالی رمزینه مرجع ایجاد می‌شود، از اهمیت فوق‌العاده‌ای برخوردار می‌باشد، زیرا شناسایی نادرست منجر به اختصاص برچسب نادرست به توالی رمزینه مرجع شده و شناسایی صحیح هویت جدایه‌های ناشناخته از طریق رمزینه‌گذاریDNA امکان‌پذیر نخواهد شد.

2) استخراج DNA از نمونه‌ها، تکثیر توالی رمزینه و توالی‌یابی: امروزه با استفاده از کیت‌های تجاری، استخراج DNA با سرعت عمل بالا انجام می‌گیرد. تکثیر توالی رمزینه و توالی‌یابی با استفاده از روش‌های استاندارد به صورت روتین صورت می‌گیرد.

3) مدیریت داده‌ها: در نهایت لازم است که توالی رمزینه DNA و اطلاعات مربوط به نمونه‌های مرجع در پایگاه‌های عمومی ارایه شود.

امروزه از توالی کوتاه رمزینه برای ترسیم درخت فیلوژنتیک استفاده می‌شود و اگرچه منعکس کننده روابط خویشاوندی مورد قبولی است، اما ممکن است برخی ملاک‌های آماری باعث ایجاد اختلال‌های درونی گردد. همچنین تخریب DNA در نمونه‌های آرشیو و پردازش مواد زیستی اغلب مانع از حصول قطعات بزرگتر از      bp 200 در روش PCR می‌گردد. از مشکلات دیگر رمزینه‌گذاری می‌توان به عدم استفاده از روش‌های فعلی برای تجزیه و تحلیل جامع نمونه‌های محیطی به علت تنوع بالای توالی اشاره کرد که مستلزم استفاده از مجموعه­ آغازگرهای مجزا برای هر یک از گروه‌های عمده طبقه‌بندی است. عدم وجود یک ژن عمومی یا ژن موجود در تمام دامنه‌های حیاتی از مشکلات دیگری است که برای مرتفع کردن آنها تلاش‌های زیادی صورت می‌گیرد. از طرف دیگر توالی‌های مفید ژنتیکی زیادی در بانک ژن وجود دارند، اما همه توالی‌های موجود اعتبار یکسانی ندارند. توالی‌های قدیمی که به­صورت دستی ایجاد و ثبت می‌شدند نسبت به توالی‌های اخیر همان ژن کوتاه‌تر و دارای دقت کمتری هستند. تکثیر مکرر ژن ممکن است توام با خطاهایی باشد که به واسطه تفاوت در نوع Taq پلی‌مراز یا پروتکل توالی‌یابی به­وجود می‌آیند. همچنین استفاده از توالی‌های مربوط به یک جدایه حاصل از کشت ­معتبر موجود معمولاً ارزش بیشتری از توالی‌های متفرقه دارند. راهکارهای مناسب دیگر برای شناسایی گونه استفاده از ابزار‌هایی است که قادر به اندازه‌گیری پارامترهایی است که قبلاً قابل سنجش نبودند. به­طور کلی بهتر است برای توصیف یک گونه، یک جمعیت در نظر گرفته شود، زیرا هرچه تعداد جدایه بالا و آشیانه اکولوژیک متنوع و مناطق جغرافیایی مختلفی در این خصوص استفاده شود، درک بهتری از میزان رشد، ویژگی‌های ریخت‌شناختی و نوع جهش‌ها در جمعیت مورد مطالعه حاصل خواهد شد.

 

[1] -Taxonomy

[2] -Taxonomists

[3] -Morphological species concept

[4] -Biological species concept

[5] -Phylogenetic species concept

[6] – DNA Hybridization

2- Restriction Fragment Length Plymorphism

3- Amplified Fragment Length Polymorphism

[7] -Organisms

صادق خداویسی، دکتر حمید بدلی، دکتر سهیلا محمودپور، دکتر مهدی ارزنلو

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی