معماری
محاسبه SD و رسم نمودار کنترل کیفی آزمایش های انعقادی

روش‌های آزمایشگاهی و استاندارد‌های بین‌المللی در تشخیص اختلالات انعقادی

رویکرد عملی در تشخیص آزمایشگاهی و ملکولی کمبود فاکتور سیزده

خلاصه

کمبود فاکتور سیزده، اختلالی خونریزی دهنده با شیوع بسیار پایین بوده که تخمین زده می‌شود شیوع آن حدود 1 نفر در هر 2 میلیون نفر باشد. تمامی آزمایش‌های معمول انعقادی مانند؛ زمان خونروی (BT)، زمان پروترومبین (PT)، زمان ترومبوپلاستین نسبی فعال شده (APTT) و تعداد پلاکت در کمبود فاکتور سیزده طبیعی بوده و این موضوع، تشخیص این اختلال انعقادی را دشوار می‌سازد. معاینه بالینی مناسب، بررسی سوابق خانوادگی و همچنین رویکرد آزمایشگاهی مناسب منجر به تشخیص به موقع کمبود فاکتور سیزده شده و از تشخیص نادرست بیماری و عواقب ناشی از آن جلوگیری می‌کند، لذا در این مطالعه یک رویکرد آزمایشگاهی مناسب برای تشخیص کمبود فاکتور سیزده ارائه می‌گردد.

کلمات کلیدی: کمبود فاکتور سیزده، اختلالات خونریزی‌دهنده نادر، تشخیص آزمایشگاهی

 

نقش فاکتور سیزده در انعقاد

فاکتور سیزده انعقادی یک پیش آنزیم بوده و عملکردهای مختلفی دارد. این فاکتور علاوه بر نقش تأثیرگذار در حفظ تعادل انعقادی، در حفظ بارداری، بهبود زخم و رگ‌زایی نیز نقش دارد (7-1). عملکرد مهم انعقادی فاکتور سیزده فعال (FXIIIa)، پایدار کردن لخته و حفاظت از فیبرین تازه شکل گرفته در برابر سیستم فیبرینولیتیکی می‌باشد (8). علاوه بر ایجاد اتصالات عرضی بین رشته‌های سست فیبرین، این فاکتور انعقادی با پیوندهای کووالانسی به پروتئین‌های دیگر پلاسما که در ایجاد لخته و فیبرینولیز نقش دارند مثل فیبرین و پلاسمینوژن متصل شده و امکان اتصال آنها را به یکدیگر فراهم می‌سازد (8-4).

محاسبه SD و رسم نمودار کنترل کیفی آزمایش های انعقادی

فاکتور سیزده پلاسمایی (pFXIII) متشکل از دو زیرواحد پیش آنزیم A و دو زیر واحد حامل/ حفاظت‌کننده‌ی B می‌باشد که بصورت غیرکوالانسی به هم متصل شده و ساختار تترامری (FXIII-A2B2) را تشکیل می‌دهند (9-8). شکل داخل سلولی فاکتور سیزده (cFXIII) بصورت همودایمر متشکل از دو زیرواحد A می‌باشد که در سیتوپلاسم پلاکت، منوسیت و سلول‌های مشتق از منوسیت قرار داشته و در عملکردهای مختلف سلولی از جمله؛ فعال‌سازی پلاکت، نقل و انتقال مواد در سلول‌های مشتق از منوسیت، فاگوسیتوز و یا بیان ژن‌های مختلف نقش دارد (2،10). فعال‌سازی هر دو شکل دایمریک و تترامریک فاکتور سیزده به وسیله‌ فعالیت هماهنگ ترومبین و یون کلسیم صورت می‌گیرد. پس از هیدرولیز پیوند پپتیدی بین آرژینین 37 و گلیسین 38 در زیرواحد A، پپتید فعال‌سازی از انتهای N ملکول جدا شده و در پلاسما آزاد می‌شود. در حضور یون کلسیم، ترومبین باعث برش پروتئولیتیکی زیرواحد A شده و در پی آن پیوند بین زیرواحد A و B فاکتور سیزده تضعیف شده و در نهایت زیرواحد B جدا می‌شود.

با تغییر در ساختار کونفورماسیونی دایمر A، سیستئین به عنوان جایگاه فعال پروتئین که در توالی Tyr-Gly-Gln-Cys-Trp قرار داشته و در مولکول اولیه در دومین هسته اصلی کاتالیزوری پوشیده شده بود، آشکار شده و برای واکنش با سوبسترای خود در دسترس قرار می‌گیرد. نکته‌ قابل‌توجه این است که فعال‌سازی کامل ترانس‌گلوتامینازی فاکتور سیزده فعال بوسیله‌ آزادسازی پپتید فعال‌سازی از یکی از دو زیرواحد A از دایمر A2 می‌تواند صورت گیرد (12 و11، 9-7). در نتیجه جدا شدن زیرواحد B در طی فعال‌سازی، لخته فیبرین نهایی فاقد زیرواحد B بوده، و این در حالی است که هنوز بیش از 90٪ پروتئین FXIII-A در شبکه‌ی فیبرینی وجود دارد. (8) .

اولین اتصال عرضی ایجاد شده بوسیله فاکتور سیزده فعال در فیبرین بین دایمر زنجیره‌ گاما (γ) بوده که این اتصال بین لیزین موجود در 406γ یک زنجیره‌ی γ و باقی‌مانده‌های گلوتامین در جایگاه‌های 398γ یا 399γ از زنجیره‌ی γ دیگر از دو مولکول فیبرین مجاور در جهت طولی تشکیل می‌شود. در نتیجه اتصال طولی ناهمسوی دو مولکول فیبرینوژن بین نواحی D، دایمریزاسیون دو مولکول فیبرینوژن به صورت سریع در 5 تا 10 دقیقه طول می‌کشد (11-4).

اگرچه اتصال عرضی زنجیره‌ی آلفا (α) از زنجیره‌ی γ کندتر است، ولی باعث افزایش بیشتر استحکام لخته فیبرینی می‌شود. تعدادی از باقیمانده‌های زنجیره‌ی α همانند لیزین (229،219،208 Lys) و گلوتامین (221،237،328،366Glu) که در اتصالات عرضی زنجیره‌ی α درگیر هستند، منجر به شکل‌گیری پلیمری با جرم مولکولی بالا می‌شوند. جهت‌گیری اتصالات عرضی زنجیره‌ی α بصورت عمودی بر رشته‌های طولی می‌باشد. اتصالات عرضی زنجیره‌ی α قوی‌ترین شبکه برای محافظت از لخته فیبرینی در جریان خون با فشار بالا بوده و از تخریب لخته توسط پلاسمین جلوگیری می‌کند. به طور کلی، تمام این اتصالات عرضی ایجاد شده توسط FXIIIa به طور چشمگیری خصوصیات ویسکوالاستیک[1] لخته فیبرینی را تغییر داده و پس از آن لخته‌ نسبت به لخته‌ی اولیه فاقد اتصالات عرضی مقاوم‌تر می‌شود. از سوی دیگر پایداری لخته فیبرین در برابر سیستم فیبرینولیز توسط عملکرد فاکتور سیزده افزایش می‌یابد. علاوه بر این، -α2 آنتی پلاسمین[2] که مهارکننده طبیعی پلاسمین است بلافاصله پس از پلیمریزه شدن فیبرین بوسیله‌ی FXIIIa به زنجیره‌ی α فیبرین متصل می‌شود. علاوه بر این، اتصالات عرضی فیبرین اتصال پلاسمینوژن به فیبرین را کاهش داده و به این ترتیب فعال‌سازی پلاسمینوژن توسط فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی (TPA) را کاهش می‌دهد. نقش فاکتور سیزده پلاکتی کاملاً مشخص نیست اما مشخص شده است که پس از فعال شدن پلاکت، cFXIII ممکن است استحکام لخته فیبرینی را بالا ببرد. پلیمریزه شدن فیبرین نیز بر روی سطح پلاکت فعال تسریع می‌شود. به طور کلی با توجه به نقش FXIII-A تظاهرات خونریزی دهنده در بیماران مبتلا به کمبود این زیرواحد در مقایسه با بیماران دچار کمبود یا نقص FXIII-B شدیدتر است، بنابراین این موضوع ممکن است نشان‌دهنده‌ی نقش مهم cFXIII در انعقاد باشند (3، 8).

 

کمبود فاکتور سیزده

کمبود فاکتور سیزده اختلالی خونریزی‌دهنده با توارث اتوزوم مغلوب و بسیار نادر می‌باشد که تخمین زده می‌شود بروز آن حدود 1 نفر در هر 2 میلیون نفر در جمعیت عمومی باشد. کمبود این فاکتور منجر به نقص در ایجاد اتصالات عرضی کووالانس بین رشته‌های فیبرین شده و در پی آن باعث تشکیل لخته ضعیف و ناپایدار می‌شود (14-12). در کمبود فاکتور سیزده، لخته ممکن است به طور طبیعی تشکیل شود اما بعد از 24 تا 48 ساعت، به دلیل اتصالات عرضی ضعیف و یا عدم وجود اتصالات عرضی بین رشته‌های فیبرین، لخته‌ی سست و ناپایدار تخریب شده و خونریزی بروز می‌کند. کمبود فاکتور سیزده می‌تواند به علت جهش در ژن زیرواحد (FXIII-A) A و یا زیرواحد (FXIII-B) B رخ دهد، با این وجود، اختلالات مربوط به ژن زیرواحد A شایع‌تر است (2-3). بیماران مبتلا به کمبود شدید فاکتور سیزده معمولاً دارای سطح پلاسمایی کمتر از 1٪ فاکتور سیزده بوده و بنابراین دارای تمایل بالقوه‌ برای بروز خونریزی شدید می‌باشند. تظاهرات بالینی کمبود فاکتور سیزده شامل بهبود تأخیری زخم، سقط مکرر، خونریزی‌های شدید خودبخودی و خونریزی داخل جمجمه‌ای به عنوان علت اصلی مرگ‌و‌میر در این بیماران می‌باشد (5-4و2).

 

تشخیص کمبود فاکتور سیزده

تست‌های آزمایشگاهی معمول انعقادی مانند زمان خونروی ([3]BT)، زمان پروترومبین ([4]PT)، زمان ترومبوپلاستین نسبی فعال شده([5]APTT) و تعداد پلاکت در کمبود فاکتور سیزده طبیعی بوده و بنابراین، تشخیص اولیه ‌این بیماری در بیماران بر پایه‌ آزمون حلالیت لخته در اوره 5 مولار و یا مونوکلریک استیک اسید ([6]MCA) 1٪ می‌باشد. همچنین می‌توان تشخیص دقیق کمبود فاکتور سیزده را با اندازه‌گیری فعالیت و سنجش سطوح آنتی‌ژنی فاکتور سیزده انجام داده و با بررسی ملکولی و جهش عامل بیماری در ژن زیرواحد A یا B، کمبود فاکتور سیزده را تأیید کرد (5-4).

 

جمع‌آوری خون

آزمایش‌های معمول انعقادی

برای آزمایش‌های معمول انعقادی، خون از ورید در محل چین آرنج توسط سرنگ با سرسوزن[7] شماره 19-21 گرفته می‌شود. سرسوزن کوچک‌تر ممکن است نتایج حاصل از آزمایش‌های انعقادی را به علت ایجاد همولیز تحت‌تأثیر قرار دهد. بر اساس برخی توصیه‌ها، 5 میلی‌لیتر اول خون نباید برای آزمایش‌های انعقادی استفاده شود. پیشتر لوله‌های شیشه‌ای برای جمع‌آوری نمونه خون استفاده می‌شدند. سپس، این لوله‌ها برای جلوگیری از فعالسازی سیستم انعقاد، سیلیکونه شدند. امروزه، استفاده از لوله‌های پلاستیکی، به دلیل مقاومت آنها در برابر سرعت بالای سانتریفوژ و نیز به خاطر ایمن‌تر بودن آن برای کارکنان آزمایشگاه نسبت به لوله شیشه‌ای افزایش یافته ‌است. پس از جمع‌آوری خون، نمونه باید فوراً با ضدانعقاد سیترات سدیم مخلوط شود. نسبت مناسب ضد‌انعقاد به خون 1به 9 می‌باشد. پس از افزودن ضدانعقاد، لوله چهار تا شش بار سروته می‌شود تا خون و ضد انعقاد به خوبی با هم مخلوط شده و از تشکیل لخته جلوگیری شود. سیترات به سرعت به کلسیم موجود در خون متصل شده و از لخته شدن خون جلوگیری می‌کند. اگرچه دو غلظت مختلف سیترات سدیم دهیدراته شامل سیترات سدیم 2/3٪ (105 تا 109 میلی مولار) و 8/3٪ (129میلی مولار) می‌تواند مورد استفاده قرار گیرد، اما غلظت 2/3٪ سیترات سدیم برای آزمایش‌های انعقادی ارجح بوده و توسط کمیته استانداردهای بین‌المللی در ترومبوز و هموستاز ([8]ISTH) و کمیته ملی استانداردهای آزمایشگاه بالینی ([9]NCCLS) توصیه شده‌است. یکی از مزایای سیترات سدیم 2/3٪ نسبت به سیترات سدیم 8/3٪ این است که اسمولالیته‌ی مشابهی با پلاسما دارد. مزیت دیگر سیترات سدیم 2/3٪ این است که آزمایش‌هایی که اساس آنها بر پایه‌ی لخته شدن می‌باشد، در این غلظت به صورت کاذب طولانی نمی‌شوند، در حالیکه در سیترات سدیم 8/3٪ این طولانی شدن کاذب ممکن است دیده ‌شود. علت این موضوع آن است که غلظت اضافی سیترات باعث خنثی شدن کلسیم درون معرف موردنیاز برای لخته‌شدن می‌شود. این در حالی است که این چنین طولانی شدن کاذب در لخته شدن خون پس از افزودن کلسیم برون‌زا، در سیترات سدیم 2/3٪ مشاهده نمی‌شود. اگر نسبت خون به ضدانعقاد کمتر از مقدار معین باشد، این امر ممکن است باعث طولانی‌ شدن نتایج آزمایش‌های انعقادی شود که در این صورت APTT بیشتر از PT تحت‌تأثیر قرار می‌گیرد. در پلی‌سیتمی که مقدار پلاسما کاهش می‌یابد، سیترات اضافی باعث خنثی شدن کلسیم موجود در معرف شده و باعث افزایش زمان هر دو آزمایش PT و APTT می‌شود. از آنجایی که حضور فسفولیپیدهای پلاکت منجر به کوتاه شدن کاذب زمان در آزمایش‌های انعقادی می‌شود، پلاسمای فقیر از پلاکت (PPP[10]) برای تست‌های انعقادی استفاده می‌شود. بدین منظور، خون به مدت 15 دقیقه یا بیشتر در 1500 گرادیان (g) برای به دست آوردن PPP سانتریفوژ می‌شود. تعداد پلاکت در PPP باید کمتر از 10،000 در میکرولیتر باشد. سانتریفیوژ کردن باسرعت بیش از g1500 ممکن است منجر به فعال شدن پلاکت‌ها و لیز شدن گلبول‌های قرمز گشته و در نتیجه می‌تواند با کوتاه شدن آزمون APTT همراه باشد.

 

ذخیره‌سازی و نگهداری نمونه خون

هرچند روش استاندارد برای ذخیره‌سازی نمونه خون جهت آزمایش‌های انعقادی مشخص نشده است اما خون کامل جهت انجام آزمایش‌های انعقادی معمول، تا 6 ساعت در دمای اتاق ([11]RT) می‌تواند ذخیره شود. در بین آزمایش‌های معمول انعقادی، APTT حساسیت بیشتری نسبت به تغییرات دما و شرایط ذخیره‌سازی نمونه دارد. با توجه به استانداردهای NCCLS و مؤسسه استاندارد آزمایشگاه و بالین ([12]CLSI) نمونه خون کامل[13]، نباید جهت انجام تست APTT بیش از 4 ساعت و برای انجام تست PT بیش از 24 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه سانتیگراد نگهداری شود. در یک بررسی مشخص شد که نمونه‌ی خون کامل و پلاسما به ترتیب می‌توانند تا 12 و 24 ساعت برای آزمایش APTT و PT در دمای اتاق یا 4 درجه ذخیره شوند. این مطالعه مشخص کرد که ذخیره‌سازی خون به مدت 24 ساعت در 4 درجه منجر به طولانی شدن آزمایش PT می‌شود. پلاسمای منجمدشده باید به سرعت در حمام آب با دمای 37 درجه سانتیگراد قبل از انجام آزمایش ذوب شود. در صورت نگهداری کردن نمونه‌ برای بیش از زمان یاد شده آزمایش‌های انعقادی طولانی‌تر خواهند شد.

جدول 1 شرایط مختلف ذخیره‌سازی نمونه خون قبل از انجام آزمایش‌های انعقادی را نشان می‌دهد.

نوع نمونه شرایط نگهداری
خون کامل ·        بر اساس استانداردهای NCCLS1 و CLSI2به مدت 24 ساعت در دمای اتاق و تا 4 ساعت در 4 درجه برای آزمایش PT و تا 4 ساعت در دمای اتاق و نیز تا 4 ساعت در 4 درجه برای آزمایش APTTقابل نگهداری می‌باشد.·        تا 24 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه برای آزمایش PT قابل نگهداری می‌باشد.

·        تا 12 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه برای آزمایش APTT قابل نگهداری می‌باشد.

پلاسما ·        تا 24 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه برای آزمایش PT قابل نگهداری می‌باشد.·        تا 12 ساعت در دمای اتاق یا 4 درجه برای آزمایش APTT قابل نگهداری می‌باشد.

·        تا 2 هفته در 20- درجه برای هر دو آزمایش PT و PTT قابل نگهداری می‌باشد.

·        در 70- برای مدت طولانی قابل نگهداری می‌باشد.

 

1) National Committee for Clinical Laboratory Standard, 2) Clinical Laboratory Standard Institute,

 

عوامل مداخله‌گر در آزمایش‌های انعقادی

برخی از فاکتورهای موجود در پلاسما می‌‌توانند آزمایش‌های انعقادی را تحت‌تأثیر قرار دهد، به عنوان مثال افزایش چربی خون منجر به افزایش سطح فاکتور VII فعال می‌شود و ممکن است فعالیت برخی از فاکتورهای انعقادی مانند II ,VII IX،X و XIIa را کاهش دهد. حدود 3٪ از تمام نمونه‌های ارجاعی به آزمایشگاه بالینی دارای همولیز می‌باشند که این موضوع می‌تواند از مکانیسم‌های بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، فیزیکی و یا شیمیایی باشد. همولیز نمونه‌‌ خون در آزمایشگاه با طولانی شدن آزمایش PT و کوتاه شدن آزمون APTT همراه است. با این وجود، هیچ همبستگی مستقیمی بین شدت همولیز و مقدار تغییرات در آزمایش‌های انعقادی مشاهده نشده است.

در آزمایش‌های معمول انعقادی، تغییرات شبانه‌روزی[14] اهمیتی نداشته، با این وجود تغییرات اندک صورت گرفته باید مدنظر قرار گیرد، به عنوان مثال، APTT در عصر کوتاه‌تر از صبح می‌باشد که ممکن است این موضوع به دلیل تفاوت در فعالیت‌های فیزیکی در این دو زمان‌ باشد. ورزش شدید باعث کاهش APTT می‌گردد ولی بر آزمایش PT تأثیری نمی‌گذارد. مهم‌ترین دلیل برای این تغییر در آزمایش APTT، افزایش سطح فاکتور VIII در اثر فعالیت فیزیکی می‌باشد.

 

متغیرها در سنجش آزمایشگاهی کمبود فاکتور سیزده

تمام مراحل آزمایشگاهی از جمله مراحل قبل از انجام، حین و پس از انجام آزمایش به یک اندازه برای ارائه‌ گزارش صحیح و دقیق نتیجه‌ی آزمایش مهم هستند. در حال حاضر با توسعه تجهیزات آزمایشگاهی، معرفی سیستم‌های اتوماتیک جدید در آزمایشگاه بالینی و بهبود برنامه‌های کنترل کیفیت داخلی و خارجی، کاهش قابل‌توجهی در میزان خطاهای آزمایشگاهی مشاهده می‌شود. با این حال، هنوز هم متغیرهای بسیاری وجود دارند که می‌توانند بر روی گزارش دقیق نتایج آزمایشگاهی تأثیر بگذارند. این متغیرها به طور عمده در مراحل پیش از آنالیز و پس از آنالیز که به ناچار باید به صورت دستی انجام شوند، دیده می‌شوند. پیامد بسیاری از اشتباهات ممکن است که اهمیت کمتری داشته باشد، برای مثال تکرار آزمایش‌ها ممکن است باعث آزار رساندن به بیمار بخصوص کودکان شده و یا باعث تأخیر در گزارش‌دهی نتایج آزمایشگاهی گردد. در مقابل، بسیاری از اشتباهات ممکن است منجر به عواقب غیرقابل جبران، مانند تشخیص اشتباه بیماری، درمان نامناسب و یا عمل جراحی غیرضروری شوند.

 

متغیرهای پیش از آنالیز

شرایط پره‌آنالیتیک ممکن است مربوط به حالت‌های فیزیولوژیکی بیمار مانند ورزش، استرس، تغییرات هورمونی، تغییرات شبانه‌روزی و تأثیر رژیم غذایی باشد و یا می‌تواند با عوامل بیرونی در ارتباط باشد. تخمین زده می‌شود که خطاهای پیش از آنالیز بیش از 6 % خطاهایی را که منجر به نتیجه‌ی نادرست در نتایج آزمایش‌های انعقادی می‌شود را تشکیل می‌دهند. مشخص شده است که خطاهای پیش از آنالیز حدوداً در 1٪ از نمونه‌های ارجاعی به آزمایشگاه خون‌شناسی مشاهده شده است. جمع‌آوری اشتباه نمونه از فردی دیگر و یا برچسب‌گذاری اشتباه نمونه، به عنوان شایع‌ترین خطا در مرحله پیش از آنالیز معرفی شده است. شناسایی و رد نمونه‌ی لخته، نمونه‌ی ناکافی و نمونه‌ی رقیق شده در یک آزمایشگاه انعقاد که می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود، بسیار مهم است. برخلاف لخته‌ قابل مشاهده، شناسایی نمونه‌های واجد لخته‌های بسیار ریز به ویژه برای کارکنان بی‌تجربه مشکل می‌باشد. چنین خطاهایی که عمدتاً از جمع‌آوری، جابه‌جایی و یا پردازش نامناسب نمونه‌ منشأ می‌گیرند ممکن است از بی‌تجربگی پرسنل و یا فشار کاری زیاد در آزمایشگاه باشد. تقریباً تمام آزمایش‌های انعقادی نیاز به الزامات خاص در مراحل جمع‌آوری، پردازش و ذخیره‌سازی نمونه دارند. پیشنهاد شده است که به منظور جلوگیری از آلودگی نمونه‌‌های آزمایش‌های انعقادی، نمونه‌ی خون برای تست‌های انعقادی قبل از آزمایش‌های دیگر که حاوی ضد انعقادهایی مانند EDTA و هپارین یا فعال کننده لخته مانند ترومبین هستند، توسط این عوامل جمع‌آوری شوند. برای سنجش لخته شدن فاکتور سیزده، همانند هر آزمایش انعقادی دیگر نمونه باید در اوایل صبح (7.00 تا 9.00) در یک محیط آرام جمع‌آوری شود. خون وریدی باید با ملایمت و سریعاً با استفاده از یک سرنگ و یا سیستم جمع‌آوری خلأ با سرسوزن کوچک‌تر از 21 جمع‌آوری شود. با این حال باید در نظر گرفت که یک سرسوزن 22 یا 23 ممکن است برای نوزادان موردنیاز باشد. استفاده از تورنیکت معمولاً نتایج اکثر آزمایش‌های اختلالات خونریزی‌دهنده را تحت‌تأثیر قرار نمی‌دهد، اما پیشنهاد شده است که از فشار بیش از حد اجتناب کرده و تا حد امکان از آن استفاده نشود. نمونه‌ی جمع‌آوری شده از خطوط ورید مرکزی می‌تواند تا حدی لخته، همولیز، فعال و همچنین با سالین رقیق شده و یا آلوده به هپارین شود، بنابراین به کار بردن روشی برای شستشوی نمونه و یا اوت کردن حجم ابتدایی خون ضروری است. سطوح داخلی لوله‌های استفاده شده برای جمع‌آوری خون باید خنثی بوده و نباید باعث فعال‌سازی تماسی آبشار انعقادی شوند. ضدانعقاد مناسب برای تست حلالیت لخته در روش فاکتور سیزده تری‌سدیم‌سیترات 105-109 میلی‌مولار بوده که همچنین به عنوان 2/3٪ هم شناخته می‌شود. پس از نمونه‌برداری، نمونه‌ی خون باید به طور کامل با ضدانعقاد، بوسیله‌ی پنج بار برگرداندن آرام لوله مخلوط شود. از تکان دادن شدید لوله که ممکن است منجر به همولیز در شرایط آزمایشگاهی و یا فعال‌سازی فاکتور انعقادی شود، باید اجتناب کرد. نمونه‌ها باید به اندازه‌ی مناسب پر شده و از کمتر یا بیشتر پر کردن لوله اجتناب کرد و باید در نظر داشت که نسبت خون به ضد انعقاد باید 9 به یک باشد (با مخلوط کردن یک حجم از تری‌سیترات سدیم و نه حجم از نمونه‌ی خون). علامتی برای نشان دادن حجم موردنیاز نمونه ممکن است که بر روی لوله وجود داشته باشد و حداقل باید 90% از این حجم با نمونه پر شود. پر کردن کمتر از مقدار خواسته شده نمونه منجر به رقیق‌سازی قابل‌توجهی در آن شده و در پی آن منجر به کاهش در برآورد نتیجه‌ی تست کمی نظیر سطح لخته شدن فاکتور سیزده می‌شود. حجم ضدانعقاد باید در موارد با هماتوکریت بیشتر از 55٪ تنظیم شود. برای تهیه‌ی پلاسمای فقیر از پلاکت با تعداد پلاکت باقیمانده کمتر از 109× 10 بر لیتر، نمونه باید به مدت حداقل 10 دقیقه در g2000 (یا 1500-1200) سانتریفوژ شود. دمای 25-18 درجه سانتیگراد برای سانتریفوژ قابل قبول است. نمونه را می‌توان برای مدت زمان طولانی در دمای 24- درجه سانتیگراد یا کمتر تا 3 ماه یا در 74- درجه سانتیگراد تا 18 ماه ذخیره‌سازی کرد بدون اینکه تغییر قابل‌توجهی در نتایج سنجش فاکتور سیزده مشاهده شود. نمونه‌های یخ‌زده باید قبل از انجام تست به سرعت در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 5-3 دقیقه ذوب شده و دماهای پایین‌تر به خاطر احتمال ایجاد رسوب کرایو[15] قابل قبول نیستند. با توجه به نیمه عمر طولانی فاکتور سیزده از موارد دریافت‌کننده‌ی درمان پیشگیری کننده‌ی فاکتور سیزده باید حداقل بعد از سه هفته از آخرین درمان نمونه گرفته شود.

 

متغیرهای آنالیتیکی

با توجه به مطالعه‌ی NEQAS UK(انعقاد خون)، طیف وسیعی از روش‌ها برای تست حلالیت لخته با ترکیبی از کلسیم، ترومبین یا ترومبوپلاستین به عنوان عوامل لخته‌کننده، و اوره، استیک اسید، مونوکلرواستیک اسید به عنوان عوامل لیزکننده استفاده می‌شوند. علاوه بر این استفاده از 9 منبع مختلف ترومبین با غلظت در محدوده‌ی 17-6/0 واحد بر میلی‌لیتر در روش‌های مختلف تست حلالیت لخته گزارش شده است. اطلاعات آنها نشان داده که تمام روش‌های حلالیت لخته استفاده شده ممکن است به اندازه کافی برای تشخیص کمبود شدید فاکتور سیزده حساس باشند، اما تنوع زیادی در حساسیت معرف‌های مختلف مورد استفاده در مورد بیماران دارای کمبود شدید فاکتور سیزده دریافت کننده‌ی درمان پیشگیری کننده با سطوح قابل تشخیص از فاکتور سیزده وجود دارد. استفاده از روش ترومبین به تنهایی به عنوان عامل لخته‌کننده و استیک اسید به عنوان لیزکننده حساسیت بیشتری به کاهش ملایم تا متوسط سطح فاکتور سیزده چه در درمان پیشگیری کننده و یا کمبود اکتسابی فاکتور سیزده دارد. پیشنهاد شده است که روش کلسیم/ اوره به غلظت 5-1 میلی‌لیتر در واحد فاکتور سیزده حساس باشد، در حالی که روش ترومبین/ استیک اسید حداقل به غلظت 10 دسی‌لیتر در واحد حساس باشد. گزارش شده است که روش کلسیم/ استیک اسید و ترومبین/ اوره حساسیت متوسطی را در تشخیص مقدار فاکتور سیزده دارند.

 

متغیرهای پست‌آنالیتیک

خطاهای پرسنلی به عنوان شایع‌ترین خطاهای این سطح شناسایی شده است، اما این خطاها را با بررسی نتایج قبل از چاپ می‌توان به حداقل رساند. نتایج غیرطبیعی و غیرمنتظره که با فنوتیپ بالینی بیمار تطابق نداشته ترجیحاً باید تکرار شده و با نتایج قبلی آزمون در دسترس چک شود.

 

پیشنهادات

هرچند ممکن است که حذف همه‌ی خطاها، هدفی غیرقابل دسترس در آزمایشگاه انعقاد باشد، اما این امکان وجود دارد که آنها را به حداقل رسانده و تمام اشتباهات قبل از گزارش نتایج اشتباه که می‌توانند نتیجه سوء برای بیماران داشته باشند را شناسایی و اصلاح کرد. استراتژی‌های مختلفی برای غلبه بر این نوع خطاها مانند آموزش مناسب و منظم کارکنان در مورد انواع و منابع خطا، فراهم کردن یک سیستم استاندارد مدیریت کیفیت، تعامل بین آزمایشگاه و بخش‌ها و همچنین استفاده از سیستم اتوماسیون در هر مرحله، تا آنجا که ممکن است، وجود دارد.

References:

  1. Komaromi I, Bagoly Z, Muszbek L. Factor XIII: novel structural and functional aspects. J Thromb Haemost. 2011;9(1):9-20.
  2. Hoppe B. Fibrinogen and factor XIII at the intersection of coagulation, fibrinolysis and inflammation. Thromb Haemost. 2014;112(6):649-58.
  3. Bagoly Z, Koncz Z, Hársfalvi J, Muszbek L. Factor XIII, clot structure, thrombosis. Thromb Res. 2012;129(3):382-7.
  4. Lorand L. Factor XIII and the clotting of fibrinogen: from basic research to medicine. J Thromb Haemost. 2005;3(7):1337-48.
  5. Kohler HP. Interaction between FXIII and fibrinogen. Blood. 2013;121(11):1931-2.
  6. Hsu P, Zantek ND, Meijer P, Hayward C, Brody J, Zhang X, et al., editors. Factor XIII Assays and associated problems for laboratory diagnosis of factor XIII deficiency: an analysis of International Proficiency testing results. Semin Thromb Hemost; 2014.
  7. Naderi M, Dorgalaleh A, Tabibian S, Alizadeh S, Eshghi P, Solaimani G. Current understanding in diagnosis and management of factor XIII deficiency. Iranian journal of pediatric hematology and oncology. 2013;3(4):164.
  8. Ariëns RA, Lai T-S, Weisel JW, Greenberg CS, Grant PJ. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 2002;100(3):743-54.
  9. Bagoly Z, Katona É, Muszbek L. Factor XIII and inflammatory cells. Thromb Res. 2012;129:S77-S81.
  10. Lawrie A, Green L, Mackie I, Liesner R, Machin S, Peyvandi F. Factor XIII–an under diagnosed deficiency–are we using the right assays? J Thromb Haemost. 2010;8(11):2478-82.
  11. Kohler H, Ichinose A, Seitz R, Ariens R, Muszbek L. Diagnosis and classification of factor XIII deficiencies. J Thromb Haemost. 2011;9(7):1404-6.
  12. Schroeder V, Handrková H, Dodt J, Kohler HP. Free factor XIII activation peptide affects factor XIII function. Br J Haematol. 2014.
  13. Muszbek L, Bereczky Z, Bagoly Z, Komáromi I, Katona É. Factor XIII: a coagulation factor with multiple plasmatic and cellular functions. Physiol Rev. 2011;91(3):931-72.
  14. Naderi M, Eshghi P, Cohan N, MIRI‐MOGHADDAM E, Yaghmaee M, Karimi M. Successful delivery in patients with FXIII deficiency receiving prophylaxis: report of 17 cases in Iran. Haemophilia. 2012;18(5):773-6.
  15. Naderi M, Zarei T, Haghpanah S, Eshghi P, Miri-Moghaddam E, Karimi M. Intracranial hemorrhage pattern in the patients with factor XIII deficiency. Ann Hematol. 2014;93(4):693-7.
  16. Naderi M, Dorgalaleh A, Alizadeh S, Kashani Khatib Z, Tabibian S, Kazemi A, et al. Polymorphism of thrombin‐activatable fibrinolysis inhibitor and risk of intracranial haemorrhage in factor XIII deficiency. Haemophilia. 2014;20(1):e89-e92.
  17. Eshghi P, Mahjour S, Naderi M, Dehbozorgian J, Karimi M. Long‐term prophylaxis in patients with factor XIII deficiency complicated by intracranial haemorrhage in Iran. Haemophilia. 2010;16(2):383-5.
  18. Levy JH, Greenberg C. Biology of Factor XIII and clinical manifestations of Factor XIII deficiency. Transfusion (Paris). 2013;53(5):1120-31.
  19. Greenberg CS, Dobson JV, Miraglia CC. Regulation of plasma factor XIII binding to fibrin in vitro. Blood. 1985;66(5):1028-34.
  20. Nishida Y, Ikematsu S, Fukutake K, Fujimaki M, Fukutake K, Kakishita E. A new rapid and simple assay for factor XIII activity using dansylcadaverine incorporation and gel filtration. Thromb Res. 1984;36(2):123-31.
  21. Dvilansky A, Britten AF, Loewy AG. Factor XIII assay by an isotope method. Br J Haematol. 1970;18(4):399-410.
  22. Schwartz ML, Pizzo SV, Hill RL, McKee PA. Human Factor XIII from Plasma and Platelets MOLECULAR WEIGHTS, SUBUNIT STRUCTURES, PROTEOLYTIC ACTIVATION, AND CROSS-LINKING OF FIBRINOGEN AND FIBRIN. J Biol Chem. 1973;248(4):1395-407.
  23. Favaloro EJ, Funk DMA, Lippi G. Pre-analytical variables in coagulation testing associated with diagnostic errors in hemostasis. Lab Medicine. 2012;43(2):1-10.
  24. Kratz A, Stanganelli N, Van Cott EM. A comparison of glass and plastic blood collection tubes for routine and specialized coagulation assays: a comprehensive study. Arch Pathol Lab Med. 2006;130(1):39-44.
  25. Castellone D. How to deliver quality results in the coagulation laboratory: commonly asked questions. Lab Medicine. 2004;35(4):208-13.
  26. Cengiz M, Ulker P, Meiselman HJ, Baskurt OK. Influence of tourniquet application on venous blood sampling for serum chemistry, hematological parameters, leukocyte activation and erythrocyte mechanical properties. Clin Chem Lab Med. 2009;47(6):769-76.
  27. Kitchen S, McCraw A, Committee WLS. Diagnosis of hemophilia and other bleeding disorders. A laboratory manual World Federation of Hemophilia. 2000:53-6.
  28. Preston F, Lippi G, Favaloro E, Jayandharan G, Edison E, Srivastava A. Quality issues in laboratory haemostasis. Haemophilia. 2010;16(s5):93-9.
  29. Potgieter JJ, Pool R, Prinsloo A, Botha EM, Olorunju S. The impact of collection tube fill volume on international normalized ratio: peer reviewed original article. Medical Technology SA. 2010;24(1):11-6.
  30. Lippi G, Salvagno GL, Montagnana M, Lima-Oliveira G, Guidi GC, Favaloro EJ, editors. Quality standards for sample collection in coagulation testing. Semin Thromb Hemost; 2012.
  31. Lawrence JB. Preanalytical variables in the coagulation laboratory. Lab Medicine. 2003;34(1):49-57.
  32. Organization WH. WHO guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. 2010.
  33. Narayanan S. Preanalytical aspects of coagulation testing. HAEMATOLOGICA-PAVIA THEN ROMA-. 1995;80:1-.
  34. Design E. Interference of blood cell lysis on routine coagulation testing. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:181-4.
  35. Salvagno G, Lippi G, Montagnana M, Franchini M, Poli G, Guidi G. Influence of temperature and time before centrifugation of specimens for routine coagulation testing. Int J Lab Hematol. 2009;31(4):462-7.
  36. Mackie I, Cooper P, Lawrie A, Kitchen S, Gray E, Laffan M. Guidelines on the laboratory aspects of assays used in haemostasis and thrombosis. Int J Lab Hematol. 2013;35(1):1-13.
  37. Laga AC, Cheves TA, Sweeney JD. The effect of specimen hemolysis on coagulation test results. Am J Clin Pathol. 2006;126(5):748-55.
  38. Korsan‐Bengtsen K, Wilhelmsen L, Tibblin G. Blood coagulation and fibrinolysis in relation to degree of physical activity during work and leisure time. Acta Med Scand. 1973;193(1‐6):73-7.
  39. Bourey RE, Santoro SA. Interactions of exercise, coagulation, platelets, and fibrinolysis—a brief review. Med Sci Sports Exerc. 1988;20(5):439-46.
  40. Blombäck M, Konkle B, MANCO‐JOHNSON M, Bremme K, Hellgren M, Kaaja R. Preanalytical conditions that affect coagulation testing, including hormonal status and therapy. J Thromb Haemost. 2007;5(4):855-8.
[1] -Viscoelastic

[2] -Alpha 2-antiplasmin

 

[3] – Bleeding Time

[4] – Prothrombin Time

[5] – Activated Partial Prothrombin Time

[6] – Mono Chloro Acetic Asid

[7] – Gauge

[8] -International Society on Thrombosis and Haemostasis

[9] -National Committee for Clinical Laboratory Standards

 

[10] – Poor Platelet Plasma

[11] -Room Trmprerature

[12] – Clinical and Laboratory Standards Institute

[13] -Whole blood

[14] -diurnal variation

[15] -Cryoprecipitation

 

اکبر درگلاله ، شادی طبیبیان، یداله فرشی، مریم‌سادات حسینی، فاطمه روشن ضمیر، شعبان علیزاد

  • کارشناس ارشد هماتولوژی و بانک خون، گروه هماتولوژی و بانک خون دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، ایران
  • دانشجوی دکترای تخصصی هماتولوژی و بانک خون، گروه هماتولوژی و بانک خون دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، ایران
  • استادیار، دکترای تخصصی هماتولوژی و بانک خون، گروه هماتولوژی دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، ایران

نویسنده مسئول:

  • اکبر درگلاله، گروه هماتولوژی و بانک خون دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران

 

پاسخ دهید