معماری

نحوه ي نمونه برداري بافتی

پس از گذشت يك ماه از زمان كمپرسيون ، كمپرسيون عصب و طي مراحل تزريق عصاره با متاسيليكات سديم ابتدا رت ها را با فرمالين 10 درصد پرفيوژن قلبي كرده و كليه ي امحاء و احشا حفره ي شكمي و قفسه ي سينه ي جانور را خالي كرده و سپس با ايجاد برش در استخوان جمجمه و نخاع گردني مغز جانور همراه با قسمت كوچكي از نخاع گردني متصل به آن جدا شد . سپس نمونه ها براي كامل كردن عمل تثبيت به داخل شيشه هاي درب دارد محتوي فرمالين 10 درصد خنثي منتقل شده و روي شيشه ها اطلاعات مربوط به شماره ي حيوان و تاريخ نمونه برداري ثبت شد .

 

پاساژ بافتي :

مراحل پاساژ بافتي كه در اين تحقيق انجام شد به ترتيب شامل مراحل زير است :

1- قرار دادن نمونه در فيكساتور

2- آبگيري با الكل

3- شفاف كردن

4- آغشتگي به پارافين

5- قالب گيري

در مرحله ي اول نمونه هاي به مدت يك هفته در محلول فيكساتور نگهداري شده اند تا به طور كامل فيكس شوند و سپس مراحل آبگيري بافت به شرح زير انجام شد :

– قرار دادن نمونه در الكل 70 درصد حداقل 12 ساعت

– قرار دادن نمونه در الكل 80 درصد حداكثر 12 ساعت

– قرار دادن نمونه در الكل 90درصد حداكثر 12 ساعت

– قرار دادن نمونه در الكل 100 درصد حداكثر 12 ساعت

در مرحله ي سوم براي شفاف كردن بافت ، نمونه ها به مدت 4 تا شش ساعت در بوتانول قرار داده شده اند . در مرحله ي چهارم بعد از شفاف سازي ، نمونه ها در داخل پارافين مذاب در درجه ي 60 – 58 درجه ي سانتيگراد قرار گرفتند و براي نفوذ پارافين به بافت 6 ساعت زمان در نظر گرفته شد .

در آخرين مرحله براي قالب گيري از قالبهاي آلومينيومي استفاده شد به اين ترتيب كه ابتدا قالب را روي سطحي صاف گذاشته و در آن پارافين مذاب ريخته و سپس به كمك يك پنس گرم ، نمونه را از داخل آنكوباتور خارج كرده و در وسط قالب به آرامي قرار داده شد .

 

برش گيري :

عمل برش زدن نمونه به وسيله ي ميكروتوم انجام شد. ضخامت برشها 7 ميكرون
در نظر گرفته شد و از بين هر 50 برش يك جفت برش انتخاب شده و به داخل حمام آب گرم منتقل شدند تا چين و چروكهاي آنها كاملاً باز شود.  سپس برشها را روي لام قرار داده و لامها به ترتيب شماره گذاري شدند .

 

رنگ آميزي :

چون يكي از خصوصيات سلولهاي عصبي وجود اجسام نيسل مي باشد و اين اجسام به وسيله ي رنگهاي بازي در بافرهاي خاص رنگ مي گيرند براي رنگ آميزي برشها از رنگ آبي تولوئيدين استفاده شد مراحل انجام شده براي رنگ آميزي به شرح
زير است :

1- قرار دادن لامها در زايلن براي حذف كامل دانه هاي پارافين از نمونه

2- آب دهي برشها با قرار دادن آنها به ترتيب ، در الكل 100% – الكل 90%
الكل 80% – الكل 70% – الكل 50% – آب مقطر (زمان لازم براي هر مرحله
3 تا 5 دقيقه) .

3- وارد كردن لامها در محلول A كه حاوي آبي تولوئيدين مي باشد به مدت 10 دقيقه.

4- شستشوي لامها به وسيله ي محلول تامپون B .

5- عبور دادن نمونه ها از الكل 96 درجه جهت حذف رنگ اضافه و ايجاد كنتراست بهتر .

6- وارد كردن لامها در ظرف حاوي موليبيدات آمونيوم 4% آبكي به مدت 10 دقيقه (اين عمل براي تثبيت رنگ انجام مي شود)

7- شستشوي نمونه ها با آب جاري .

8- رنگ آميزي ماتريكس سلولي به وسيله ي اريتوزين 1 % به مدت 1 تا 2 ثانيه .

9- شستشو با الكل 96 درجه .

10- شفاف كردن نمونه ها با زايلن .

11- چسباندن لامل روي نمونه ها با استفاده از چسب انتلان .

لازم به تذكر است كه محلول A و B شامل تركيبات زير است :

 

اسيد استيك نرمال 1 سي سي

تركيب محلول A :               استات سديم نرمال 1 سي سي

آب مقطر 98 سي سي

آبي تولوئيدين 064/0 گرم

 

 

 

اسيد استيك 1 سي سي

تركيب محلول B:       ‌‌‌‌‌          استات سديم 1 سي سي

آب مقطر 98 سي سي

 

 

در ضمن pH محلول A بايد 65/4 باشد چون اجسام نيسل در اين pH بطور اختصاصي رنگ مي گيرند .

 

عكس برداري از نمونه ها :

پس از رنگ آميزي ، لام هاي مربوط به هر نمونه به ترتيب شماره مرتب و از آنها با دوربين ديجيتال قابل نصب بر روي ميكروسكوپ عكس گرفته شد. از هر برش موجود بر روي لام يك عكس كلي با عدسي شيئي 5 و عدسي چشمي 10 گرفته شد و سپس چهار قطعه عكس به ترتيب از نيمه چپ برش اول و نيمه چپ برش دوم و نيمه راست برش اول و نيمه راست برش دوم با درشت نمايي چشمي 40 گرفته شد .

براي تعيين درشت نمايي كلي عكسها از لام ميكرومتري استفاده شد. به اين ترتيب كه اين لام را زير ميكروسكوپ قرار داده و يك بار با عدسي چشمي 5 و يكبار با عدسي چشمي 40 از آن عكس گرفته شد تا از روي ميزان بزرگ شدن آن ، درشت نمايي عكسها محاسبه شود .

پاسخ دهید