معماری

کاربرد PCR در بیوتکنولوژی

زیست فناوری (بیوتکنولوژی) از جمله واژه‌های پر سرو صدای سال های اخیر است. این واژه را درست یا نادرست به مفهوم همه چیز برای مردم به کار می‌برند. زیست‌فناوری را در یک تعریف کلی به کارگیری اندامگان یا ارگانیسم یا فرایندهای زیستی در صنایع تولیدی یا خدماتی دانسته‌اند. تعریف ساده این پدیده نوین عبارت است از: دانشی که کاربرد یکپارچه زیست شیمی، میکروب شناسی و فناوری های تولید را در سیستم های زیستی به دلیل استفاده‌ای که در سرشت بین رشته‌ای علوم دارند مطالعه می‌کنند. در تعریف دیگر، زیست فناوری را چنین تشریح کرده‌اند:
فنونی که از موجودات زنده برای ساخت یا تغییر محصولات، ارتقا کیفی گیاهان یا حیوانات و تغییر صفات میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه استفاده می‌کند.
زیست فناوری دارای دو جزء است: یک جزء آن در پی دستیابی به بهترین کاتالیزور برای یک فرایند یا عملکرد ویژه است و جزء دیگر، سیستم یا واکنش‌گری است که کاتالیزورها در آن عمل می‌کنند.

واژه بیوتکنولوژی (زیست فناوری) نخستین بار در سال ۱۹۱۹ توسط  Karl Ereky به مفهوم کاربرد علوم زیستی و اثر متقابل آن ها در فناوری های ساخت بشر به کار برده شد.
به طور کلی زیست فناوری یکی از محورهای اساسی توسعه در بسیاری از کشورها قلمداد شده و در تنظیم راهکارها و برنامه های ملی، توجه جدی به آن معطوف شده است.
بیوتکنولوژی، دانشی برگرفته از گرایش های مختلف در شاخه های علوم زیستی است که در ارتباط با به کارگیری ارگانیزم های زنده، اندامک های آن ها، مولکول ها و فـرایـنـدهـای زیـسـتـی جـهـت بـهـبـود و تـوسعه خدمات پزشکی، داروسازی، صنعتی، شیمیایی و کشاورزی است.

بیوتکنولوژی‌پزشکی‌
کـاربـرد بـیـوتـکـنـولـوژی‌در پـزشـکـی‌بـه‌وسـعـت عـلـم‌پزشکی‌بوده‌و حتی‌این‌علم‌با سرعت‌روزافزون‌بر وسعت‌و دامنه‌علم ‌پزشکی‌می‌افزاید.
از مهم‌ترین‌کاربردهای‌بیوتکنولوژی‌در پزشکی‌می‌توان‌به‌موارد زیر اشاره‌کرد:
تـأثـیـر دگـرگـون‌کـنـنـده در امـر پیشگیری‌ازبیماری های‌میکروبی‌، بیماری‌های ‌ژنتیکی‌، بیماری های‌تغذیه‌ای‌و متابولیسمی‌و بیماری های‌روحی ‌روانی‌و…
تـأثـیـر دگرگون کننده در امر درمان‌بیماری های‌عفونی‌، ژنتیکی‌، سوءتغذیه‌و متابولیسم‌و نازائی‌
تأثیر دگرگون‌کننده در پزشکی‌قانونی
تأثیر دگرگون‌کننده در پزشکی‌زیبائی‌
عناوین‌مطرح‌دربیوتکنولوژی‌پزشکی‌که‌هرکدام‌نیاز به‌توصیف‌کامل‌دارند به طور عـمـده  عـبارتند از: ژن‌درمانی‌، واکسن های ‌نوترکیب‌، بیوانفورماتیک‌، ژنومیکس‌، پـروتـئـومـیـکـس‌، بـیومدسین‌و بیوفارماسوتیکال‌. امروزه‌پیشرفت‌های‌پزشکی‌به‌مدد بـیـوتـکـنـولـوژی‌درحـال‌سـرعـت‌گـرفـتـن‌اسـت. پـزشـکـی‌سـنـتـی‌به تدریج‌جای‌خود را به‌پزشکی‌مولکولی‌خواهد داد. درآینده‌نه‌چندان‌دور مکانیسم‌هیچ‌نوعی از بیماری ها ‌نـاشـنـاخـتـه‌نـخـواهـد مـانـد. پـزشـکـی‌سنتی‌ به طور عمده به دنبال‌علائم‌و نشانه ‌های بیماری‌ها بوده‌و از روی‌آن‌به‌استنتاج‌وجود بیماری‌و عامل‌بیماری‌زا می‌پرداخت‌و در مواردی‌به دلیل‌ناشناخته‌بودن‌عوامل‌بیماری ها، مکـانیسـم‌هـا و سیستم‌های‌کنترلی‌آن ها ،مبارزه‌ تنها برعلیه‌علائم‌و نشانه‌ها صورت‌می‌گرفت‌.
امروزه‌به کمک‌بیوتکنولوژی‌، علم‌ پزشکی ‌درحـال ‌شناخت‌ریشه‌ای‌ترین‌بخش‌از حیات ‌و مـظـــاهـــر آن‌اســـت. بـــا کـشـــف‌کـــامــل‌تــوالــی ‌ژنـوم‌انسـان‌در سـال‌۲۰۰۱، هـم‌‌اکنـون‌دانشمندان ‌بــیــــوتــکــنــــولــــوژیـســـت ‌بـــه دنـبـــال‌شـنـــاســـائـــی ‌ژن هـــای ‌مسئول‌صفت‌های ‌مختلف‌و نیز ژن های ‌مسئول ‌نـواقـص ‌گـونـاگـون‌ انـسـانـی‌ هـسـتند. تا به‌حال‌ژن های ‌مسئول‌ایجاد بیماری‌های ‌بسیاری ‌شامل سـرطـان هـا، بـیـماری‌های ‌قلبی ‌عروقی‌، تنفسی‌، روانی‌و… شناسائی ‌شده‌اند.
بــا شـنــاســائــی‌تــک‌تــک‌ایــن‌ژن هــا و سـپـس‌ شـنــاســائــی‌پـروتئیـن هـای‌حـاصلـه‌از ایـن‌ژن هـا داروهـای‌کـامـلا انـتـخـابـی‌و مـؤثـر برای‌مقابله‌با یــک‌بـیـمــاری‌ســاخـتــه‌مــی‌شــونــد. ایـن‌مـبـارزه‌در سطح  ‌پروتئین‌و فنوتیپ‌است‌، راه‌دیگر مبارزه ‌استفاده‌از ژن‌درمانی‌است‌.
بیمـاری هـای‌ژنتیکـی‌بسیاری‌درحال‌حاضر بـه عنـوان‌کاندید برای‌ژن ‌درمانی‌درنظر گرفته ‌شـــده‌انــد. تـقــریـبــا هــرکــدام‌از مــا تـعــدادی ‌ژن‌ نــاقــص‌دربــدن‌خــود داریــم‌کــه‌بـرخـی‌از آن هـا خـصــوصـیــات‌خــود را در فـنــوتـیــب‌مــا آشـکـار نکرده‌اند و برخی‌دیگر کم‌یا زیاد، خصوصیات ‌خود را در فنوتیپ‌آشکار کرده اند. تقریبا از هر ۱۰ نفر، یک نفر دارای‌اختلالات‌ژنتیکی‌تظاهر یــافـتــه‌اســت و تـقــریـبــا ۵% مـراجعـه‌ کـودکـان‌بـه ‌بـیـمــارسـتــان هــا بــه خــاطــر نـقــص‌در یــک‌تـک ‌ژن‌است.

اطلاعات اولیه 
اگر در یک مدل سازی تعداد زیادی مولکول و متغیر داشته باشیم، ممکن است جهت به دست آوردن مدل بهینه مجبور به انجام آزمایش های اضافی گردیم که اهمیت بسیار کمی در نتایج ما داشته باشد. اما چگونه و به چه روشی می توان بهترین و موثرترین آن ها را مشخص کرد. ابزار مناسب استفاده از PCRو استفاده از  PCA است. در این روش می توان به جای داخل کردن مثلا ۱۰۰ پارامتر، با انتقال مناسب محور دکارتی، آن ها را به ۴ پارامتر کاهش داد بدون آن‌که این کاهش در نتیجه و صحت کار و مدل ارائه شده اختلالی ایجاد کند.
تعداد زیادی دستگاه Real Time PCR موجود است که در شکل ۱، یک نمونه از آن نشان داده شده است.
PCR ‌در امــور جـنــایــی، پـزشکـی مـولکـولـی، بـیــوسـیـسـتـمــاتـیــک گـیـاهـی وجـانـوری و حـتـی مـی‌تـوان در ایجـاد جهـش هـای ژنی و برطرف کردن و انتقال ژن های مخرب و جایگزینی آن ها با ژن سالم از آن ها استفاده کرد.
دستگاه  PCRشامل یک سیستم چرخه دمایی (thermo cycler) است که نمونه ژنوم را به منظور بـاز شـدن رشتـه هـای DNA بـه دمـای ۹۵ درجـه می‌رساند، بعد دما به ۴۵ درجه می رسد تا آنزیم پــلــیــمــــراز زنــجــیــــره هـــای از هـــم بـــاز شـــده را همانند‌سازی کند و بعد در دمای ۷۰ درجه انیل می شود. این چرخه دمایی موجب تکثیر متناوب توالی خاصی از DNA می شود که پرایمر خاص آن در محلول وجود دارد.
در این روش نمونه ای از DNA را که دارای توالی مورد نظر است به مخلوط واکنش اضافه می کنیم. با تکرار چرخه همانند سازی چهار نسخه تولید می شود و به همین ترتیب فرایند به صورت نمایی (exponential) تعداد نسخه ها را در هر بار همانند سازی دو برابر می کند و بعد از ۳۰ ساعت بیش از یک میلیون نسخه از هر مولکول تولید می شود.

تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند. از سال ۱۹۸۰ به بعد  به طور عمده از روش PCR در آزمایشگاه‌های زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود. PCR در دهه ۸۰ میلادی توسط کری مولیس اختراع شد.
کشف  PCRانقلابی در علوم تشخیص کلینیکی بیماری ها، پزشکی، علوم جنایی و پلیسی، میکروبیولوژی و بسیاری صنایع دیگر ایجاد کرد که به خاطر آن جایزه نوبل به مبتکر آن اهدا شد. هم اکنون بیشتر مارکرهای مولکولی بر پایه  PCRهستند. مارکرهایی از قبیل  SSR,SNP,AFLP و … بر پایه  PCR هستند.
الـبـتــه الان دیـگــر ایــن روش مــاننـد گـذشتـه نیسـت و یـک روش پیـش پـا افتـاده در آزمایشگاه‌های مولکولی است . امروزه روش های آن ارتقا یافته و مدل های زیادی از آن انجام می شود و طرز کار آن با پایه همانند سازی تک رشته  DNA است. معمولا اول زنـجـیره را باز می کنند و توالی های خاصی را به عنوان پرایمر طراحی می کنند که اختصاصی آن ژن یا توالی است که می خواهیم بررسی کنیم و بعدا آن را تکثیر کرده و توسط الکتروفورز در مقابل یک کنترل می سنجند. یکی از روش های خوب این   مدل real time PCR است که حتی می توان به صورت کمی و دقیق، هدف مورد نظر را اندازه گرفت.
PCR یکی از سه تکنیک تشخیص مستقیم پاتوژن های میکروبی در نمونه های بالینی اســت. دو روش دیـگــر عـبــارتـنــد از : اپـیـدمـیـولـوژی مـولـکـولـی و بـررسـی اکـتـشـافـی اسید‌نوکلئیک.
مزایای روش PCR عبارتند از: بررسی یک روزه، ارزان بودن نسبی، آسانی انجام و اختصاصی بودن فوق العاده این روش.
PCR مخفف Polymerase Chain Reaction یا واکنش های زنجیره ای پلیمراز است و به طور ساده تکثیر قطعات  DNA با گرم و سرد کردن، متناوب است.  PCR، تکنیکی است که به واسطه آن می توان از یک رشته  DNAیا از یک رشته  RNA،تعداد زیادی رشته DNA به دست آورد به شرطی که دو انتهای رشته DNAکه قصد تکثیرش را داریم کاملا شناخته شده باشد. با این روش می توان یک ژن را به اندازه ای تکثیر کرد تا بتوان با استفاده از روش‌هایی مانند الکتروفورز مشاهده کرد. شما یک تار مو را از فاصله ۶ متری نمی توانید ببینید اما یک دسته میلیاردی از مو کنار هم به خوبی مشاهده می شوند. اصل  PCRهم بر این مبنا استوار است. برای تکثیر یک قطعه خاص، ابتدا یک پرایمر از DNA موردنظر، طراحی می شود و با استفاده از PCR تکثیر می شود.

مراحل  PCR

مرحله دناتوراسیون DNA: ‌در مرحله اول برای مدت کوتاهی (۳۰ ثانیه) قطعات DNA را در درجه حرارت ۹۴ درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: ‌این قطعات معمولا از ۲۵ – ۱۸ باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و  در حدود ۳۰ ثانیه در دمای ۶۵ – ۳۰ درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.

مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: ‌در این مـرحلـه، با دخالت آنزیم DNA پلیمراز بر روی رشـتــه DNA الـگــو و سـنـتــز DNA بــا اسـتـفـاده از نـوکـلـئـوتـیـد تـری فـسـفـات‌هـایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA هـمیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.

ادامه PCR بعد از چرخه اول 
بعد از این ۳ مرحله، چرخه اول تمام می‌شود و چـرخـه ‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از ۲۰ چرخه ، ژن مورد نظر دارای بـــیــــــش از ۱مـــیـــلـــیـــــون خـــــواهـــــد بـــــود کـــــه در  جـدول ۱‌، افـزایـش تعـداد DNA نشان داده شده است. بنابراین روش PCR روشی کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

کاربردهای مهم  PCR

‌تهیـه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظـر: ‌گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR،‌ ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر کرد.

‌بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: ‌با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژن‌های مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.

‌تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و به کار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آن، می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه و بعد از رسیدن تخمک به حالت ۱۰ سلولی، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد. اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آن‌ها است.

‌تشخیـص عامل یک بیماری ناشناخته: ‌فرض کنید بیمار شما به یک بیماری  نا‌شناخته گرفتار است و شما احتمال می دهید که عامل بیماری ویروس  است. این ویروس را نمی شود در آزمایشگاه کشت داد بنابراین با روش  PCRمی توان احتمال این ویروس را در عرض ۱ ساعت  کنترل  کرد. یعنی نمونه ای از بدن بیمار و همچنین قطعه‌ای از ژن این ویروس   را که پرایمر نام دارد  به دستگاه می دهیم. اگر حتی فقط ۱ عدد از این ویروس در نمونه بیمار باشد دستگاه از ژن آن میلیارد ها کپی تهیه می کند. سپس می توان این حجم زیاد ژن را در صفحه فیلم فلورسنت حاصل از الکتروفروز مشاهده کرد. اگر باند های  DNAروی ژن دیده شد مطمئن می شوید که بیمار ناقل این ویروس است.

‌تعیین جنسیت جنین:  به طور معمول چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و به وسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR به وسیله الکتروفورز و به طور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماری ها
کشت میکروب ها که جهت تشخیص بیماری‌های عفونی در بیشتر آزمایشگاه ها به کار می‌رود زمان ‌بر بوده و همچنین باعث افزایش تعداد میکروب ‌های بیماری زا و غیر‌بیماری‌زا در شرایط آزمایشگاهی می شود. امروزه در برخی آزمایشگاه ها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه ‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماری زا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می ‌شوند. با استفاده از این پرایمرها می ‌توان تشخیص داد که آیا  مثلا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟
از دیگر موارد استفاده از PCR می توان، مطالعه نسبت خویشاوندی در تفحص شهدا، تشخیص بیماری های ژنتیکی در اثر ازدواج های فامیلی، تعیین هویت، تعیین سن و قد، جـرم شنـاسـی از طـریـق آثار باقیمانده از قاتل، تکثیر ژن برای ایجاد آنزیم، تشخیص سرطان‌ها و ایجاد جهش های هدف دار را نام برد.

مواد لازم  PCR

۱٫ بافر  PCR: شرایط یونی ph مناسب را برای واکنش PCR فراهم می کند. بافر به صورت x10 ساخته می شود. این بافر دارای گلیسیرول برای سنگینی کار و دارای رنگ برای مشهود سازی DNA است.

۲٫ دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات: که به صورت مخلوطی از چهار باز در بازار وجوددارد تا کنار هم چیده شوند و رشته مکمل را ایجاد کنند .

۳٫ آغازگرها primer : پرایمرها قطعات سنتز شده ای از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه مورد نظر الگوهای هدف ساخته می شوند که معمولا با طول ۳۰۱۵ نوکلئوتید هستند که به DNA الگو متصل می شوند. طول پرایمرها بسیار مهم است و هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند.
پرایمرها دو عمل انجام می دهند. اول این که محل ژنی  را که باید تکثیر شود مشخص می‌کنند و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند. باید توجه داشت دو پرایمر دارای نقطه ذوب نزدیک به هم باشند. پرایمر مورد نظر توسط کامپیوتر انتخاب می شود.
۴٫  Tag DNA polymerase: یک آنزیم مقاوم به دما است که همانند سازی DNA را انجام می‌دهد. آنزیم Tag پلیمراز باعث می شود به راحتی واکنش  PCR به طور اتوماتیک انجام شود  .
۵٫  ۲Mgclکلرید منیزیم نقش کوفاکتوری در فعالیت آنزیم Tag دارد. اثر متقابل رشته DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزایـش مـی دهـد. غلظـت کلـریـدمنیـزیـم اثـر زیـادی بـرروی اختصاصی شدن و  در نهایت بازده واکنش PCR دارد. غلظت زیاد آن اثر بازدارندگی برروی فعالیت آنزیم تگ DNA پلی مراز دارد و مقدار محصول نهایی را کاهش می دهد.
۶٫ دی ان آ الگو Template   DNA : بسته به هدف آزمایش از منابع مورد نیاز با استفاده از یکی از روش های مرسوم استخراج می شود. معمولا به ازای هر واکنش ۵% واحد یا ۱% میکرو لیتر استفاده می شود .
۷٫ لوله های واکنش : لوله های کوچک ۵% میلی لیتر
۸٫ سمپلر و سر سمپلرهای یکبار مصرف مخصوص آن ها که برای برداشتن مقادیر بسیار کم استفاده می شود.
۹٫ دستگاه چرخش حرارتی
۱۰٫ میکرو فیوژ
۱۱٫ روغن معدنی  mineral oil: یک قطره روی مخلوط واکنش اضافه می شود تا از تبخیر نمونه در دستگاه چرخش حرارتی  thermal  cycler جلوگیری می شود. معمولا ۵۰ تا ۶۰ میکرولیتر به محلول واکنش ۱۰۰ میکرولیتری اضافه می شود .

مشکل PCR و راه حل آن
اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد، و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل، امروزه از ظروف یک بار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکول های موجود در آن ها، تا حد ممکن غیر فعال می‌شوند.
یـکــی از روش‌هــای پـیـشـنهـادی انجـام PCR داخـلــی یـا Nested PCR اسـت. از ایـن روش بـا استفـاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر مــی‌دهـنــد و سـپــس قـطـعــه‌ای دیـگــر در داخـل DNAهــای تـکـثـیــر شــده PCR مــی‌شــود. بــدیــن صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد.

 

پاسخ دهید