معماری

روش برادفورد در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

روش برادفورد در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

در سال ۱۹۷۶ ماریون برادفورد (Marion Bradford) روشی را برای اندازه‌گیری پروتئین‌ها معرفی کرد که بر اساس تغییر ماکزیمم جذب نوری کوماسی بریلیانت بلو G-250 از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر در هنگام اتصال به پروتئین عمل می‌نمود.

اندازه‌گیری پروتئین‌های محلول به این روش ساده، دقیق، سریع و ارزان بوده و از نظر مقدار پروتئین مورد استفاده مانند روش لوری می‌باشد. کوتاه بودن زمان انجام آزمایش به این روش موجب شده است که نمونه‌های با غلظت پروتئین خارج از محدوده، در طی چند دقیقه مجددا به سهولت اندازه‌گیری شوند. این روش همچنین نسبت به بسیاری از عواملی که در روش لوری اختلال ایجاد می‌کنند از خود حساسیت کمتری نشان می‌دهد.

روش برادفورد به عنوان یک روش رایج به ویژه برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌های فراکشن‌های سلولی و ارزیابی غلظت پروتئین در ژل های الکتروفورز می‌باشد.

Ausubel و همکاران در سال ۱۹۹۶ روش برادفورد را به عنوان روش انتخابی اندازه‌گیری دقیق غلظت پروتئین‌ها پیشنهاد نمودند.

کوماسی بریلیانت بلو در فرم کاتیونی، قرمز رنگ، در فرم خنثی، سبز رنگ و در فرم آنیونی دارای رنگ آبی می‌باشد. در شرایط اسیدی، کوماسی بلو به طور غالب پروتونه بوده و به فرم کاتیونیک قرمز رنگ دیده می‌شود. هنگامی که کوماسی بلو به پروتئین متصل می‌شود، به فرم پایدار غیر پروتونه آبی رنگ در می‌آید. رنگ آبی ایجاد شده را می‌توان در طول موج های ۶۱۵-۵۷۵ نانومتر نیز قرائت نمود. در دو سر طیف این طول موج‌ها (۵۷۵ و ۶۱۵ نانومتر) در مقایسه با نتایج به دست آمده با طول موج ۵۹۵ نانومتر، ۱۰ درصد کاهش در میزان جذب نوری خواهیم داشت.

 

 

 

اصول آزمایش:

معرف رنگی کوماسی بلو با اسید آمینه‌های بازی و آروماتیک از قبیل آرژینین، لیزین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین و فنیل‌آلانین موجود در پروتئین‌ها واکنش می‌دهد. در این میان، اتصال کوماسی بلو به آرژینین حائز اهمیت می‌باشد. روشن است که این روش برای اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌های بازی و اسیدی از دقت کمتری برخوردار می‌باشد. مقدار رنگ متصل شده، وابسته به محتوای اسیدهای آمینه بازی پروتئین می‌باشد. بنابراین باید محتوای اسید آمینه‌های بازی در پروتئین استاندارد، با پروتئین مورد نظر برای اندازه‌گیری یکسان باشد. نیروهای واندروالس و هیدروفوبیک نیز در اتصال رنگ به پروتئین دخالت دارند. کوماسی بلو در فرم آنیونیک به آرژینین موجود در پروتئین‌ها متصل می‌شود که در این حالت در طول موج ۵۹۵ نانومتر دارای ماکزیمم جذب نوری می‌باشد.

 

کوماسی بریلیانت بلو در شکل آنیونی خود و اتصال به پروتئین، دارای رنگ آبی و حداکثر جذب نوری در ۵۹۵ نانومتر است؛ در حالی که در شکل غیر متصل، دارای حداکثر جذب نوری در ۴۶۵ نانومتر است. کمپلکس رنگی تشکیل شده با پروتئین به مدت یک ساعت پایدار می‌باشد. تعداد لیگاندهای رنگ کوماسی بلو متصل شده به هر پروتئین تقریبا متناسب با تعداد بارهای مثبت یافت شده در آن پروتئین است. اسیدهای آمینه آزاد، پپتیدها و پروتئین‌های با وزن ملکولی پایین با معرف‌های کوماسی بلو ایجاد رنگ نمی‌کنند. به طور کلی باید جرم پپتید یا پروتئین مورد استفاده با این روش، حداقل ۳۰۰۰ دالتون باشد که در برخی موارد، این یک مزیت محسوب می‌شود. روش اندازه‌گیری پروتئین کوماسی (برادفورد) برای اندازه‌گیری پروتئین‌های دارای وزن ملکولی بالا در صنایع آبجو سازی کاربرد دارد.

حساسیت روش برادفورد برای اندازه‌گیری پروتئین ها ۲۰-۲/۰ میکرو‌گرم در میلی‌لیتر پروتئین بسته به کیفیت رنگ مورد استفاده می‌باشد. اما این روش نمی‌تواند پروتئین‌های رشته‌ای و غشائی را به خوبی محلول نموده و لذا نتایج حاصل با این پروتئین‌ها همراه با خطا خواهند بود.

در غلظت‌های خاصی از پروتئین، تغییر رنگ در ۵۹۵ نانومتر مستقیما متناسب با مقدار پروتئین نمونه می‌باشد. در مقادیر بالاتر پروتئین، تغییرات رنگ دیگر متناسب با مقدار پروتئین نمونه نمی‌باشد.

 

مزایای روش برادفورد:

این روش نسبت به سایر روش‌های اندازه‌گیری پروتئین‌ها، سریعتر و آسان‌تر می‌باشد. تهیه معرف‌های این روش آسان بوده و ایجاد رنگ به سرعت روی داده و پایدار می‌باشد. اندازه‌گیری در دمای اتاق انجام گرفته و وسیله خاصی مورد نیاز نمی‌باشد. پس از افزودن نمونه به لوله‌های حاوی معرف‌ها و ایجاد رنگ آبی مربوطه، پس از زمان کوتاهی انکوباسیون در دمای اتاق در طول موج ۵۹۵ نانومتر، نتایج قرائت می‌شوند. این روش با اغلب نمک‌ها، حلال‌ها، بافرها، تیول‌ها، ترکیبات احیا کننده و عوامل شلاته کننده در نمونه‌های پروتئینی سازگار بوده و تداخل کمتری ایجاد می‌نمایند.

 

دترجنت رایج سدیم دودسیل سولفات (SDS)، که در عمل لیز سلولی، نقش پاره کردن غشا دو لایه لیپیدی را بر عهده دارد، در اغلب پروتئین‌های استخراج شده یافت می‌شود که با روش برادفورد در اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها تداخلی ایجاد نمی‌کند. در حالی که اغلب دترجنت‌ها در غلظت‌های بالا در اندازه‌گیری پروتئین‌ها با این روش تداخل ایجاد می‌نمایند. تداخل ایجاد شده با SDS، دو جنبه مختلف دارد که وابسته به غلظت می‌باشد. برای غلظت‌های SDS پایین‌تر از غلظت میسل شاخص (Critical Micelle Concentration; CMC) (0667/0-00333/0 وزنی/حجمی) در محلول رنگی کوماسی، محل‌های اتصال معرف رنگی به پروتئین بلوکه شده و باعث می‌شود که مقدار پروتئین، کمتر از مقدار واقعی برآورد شود. SDS در غلظت‌های بالاتر از CMC، به طور محکم با فرم خنثی (سبز رنگ) کوماسی بلو متصل شده و موجب گرایش تعادل به سمت تولید فرم آنیونی (آبی رنگ) کوماسی بلو و افزایش میزان جذب نور در طول موج ۵۹۵ نانومتر، مستقل از غلظت پروتئین می‌گردد.

 

با توجه به سادگی و تعداد کم محلول‌های مورد نیاز برای انجام روش برادفورد، روش‌های اتوماتیک برای انجام این آزمایش در بسیاری از آزمایشگاه‌ها گسترش یافته‌اند. بسیاری از محققین و دانشجویان هنوز هم به سادگی و سهولت از روش دستی برادفورد استفاده می‌نمایند.

روش تهیه محلول برادفورد:

معرف این روش با حل کردن ۱۰ میلی‌گرم کوماسی بریلیانت بلو در ۵ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد به دست می‌آید که سپس ۱۰ میلی لیتر اسید ارتوفسفریک ۸۵ درصد به آن اضافه کرده و پس از حل شدن کامل رنگ، حجم را با آب مقطر به ۱۰۰ میلی‌لیتر می‌رسانند. جهت حذف ذرات معلق، محلول حاصل را با کاغذ صافی شماره ۱ واتمن صاف کرده و در ظرف تیره و در داخل یخچال نگهداری می‌کنند. این معرف باید به رنگ قهوه‌ای روشن باشد. ممکن است لازم باشد عمل فیلتر کردن محلول را چند بار به منظور حذف ذرات آبی رنگ معرف، تکرار نمود. این محلول حدود ۸ هفته پایدار بوده، اما استوک رنگ/اتانول برای چندین سال قابل نگهداری است.

 

روش تهیه محلول استاندارد پروتئین (۱۰۰ µg/ml):

جهت تهیه ۱۰ میلی‌لیتر از این محلول، ۱ میلی‌گرم پروتئین آلبومین سرم گاوی در مقداری آب مقطر حل نموده و سپس توسط آب مقطر به حجم ۱۰ میلی‌لیتر رسانده می‌شود. در هر میلی‌لیتر از محلول فوق، ۱۰ میکروگرم پروتئین وجود خواهد داشت.

برخی محققین به جای استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA)، IgG را ترجیح می‌دهند.

درصد ریشه اسید آمینه تیروزین در BSA (از مجموع ۶۰۷ اسید آمینه)، ۵/۳ درصد می‌باشد.

 

تهیه منحنی استاندارد:

برای تعیین پروتئین یک محلول به روش برادفورد، ابتدا باید منحنی استاندارد را رسم کرد.

 

در هر روش اندازه‌گیری پروتئین، پروتئین ایده‌آلی که می‌توانیم به عنوان استاندارد انتخاب کنیم، فرم خالص شده همان پروتئین مورد نظر برای اندازه‌گیری است. در صورت در دسترس نبودن فرم خالص آن پروتئین، پروتئینی ارجح است که رنگ حاصل از واکنش آن، مشابه رنگ حاصل از واکنش پروتئین مورد نظر برای اندازه‌گیری باشد. انتخاب این نوع پروتئین بیشتر از روی تجربه انجام می‌گیرد. در مواردی که هیچ یک از این دو روش عملی نبوده و یا ضرورتی برای این کار احساس نشود، ممکن است که هر پروتئینی برای انتخاب استاندارد استفاده شود. دو پروتئین رایج که به عنوان استاندارد انتخاب می شوند شامل سرم آلبومین گاوی و گاما گلبولین می‌باشند.

برای این منظور باید با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA)، غلظت‌های مختلفی از استاندارد پروتئین (حداقل سه استاندارد در محدوده غلظتی ۲۰ الی ۲۰۰ میکروگرم در میلی‌لیتر) تهیه کرده و جذب نوری هر لوله را در مقابل شاهد (بلانک) به وسیله اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت نمود.

رنگ کوماسی به شدت به کوارتز اتصال می‌یابد، بنابراین باید در این روش از کووت‌های شیشه‌ای یا پلی‌استیرن استفاده شود.

 

ابتدا ۱۱ لوله را انتخاب نموده و پس از شماره‌گذاری، مقادیر داده شده در جدول زیر را از محلول استاندارد و آب مقطر در داخل آنها می‌ریزیم. محتویات هر لوله را به خوبی با هم مخلوط کرده، سپس به هر لوله، مقدار ۵ میلی‌لیتر از معرف برادفورد اضافه نموده و مجددا محتویات هر لوله را به خوبی با هم مخلوط می‌کنیم و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری می‌نماییم.

 

بلانک ۱۰ ۹ ۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱ شماره لوله

                           محلول

۱۰۰۰ ۹۰۰ ۸۰۰ ۷۰۰ ۶۰۰ ۵۰۰ ۴۰۰ ۳۰۰ ۲۰۰ ۱۰۰ محلول استاندارد پروتئین (میکرولیتر)
۱۰۰ ۲۰۰ ۳۰۰ ۴۰۰ ۵۰۰ ۶۰۰ ۷۰۰ ۸۰۰ ۹۰۰ آب مقطر (میکرولیتر)
محتویات هر لوله به خوبی با هم مخلوط شوند.
۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ ۵ معرف برادفورد (میلی‌لیتر)
محتویات هر لوله به خوبی با هم مخلوط شوند و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شوند.

 

ابتدا با استفاده از لوله بلانک، اسپکتروفتومتر را در طول موج ۵۹۵ نانومتر صفر کرده و سپس جذب نوری هر کدام از لوله‌ها را در طول موج فوق قرائت می‌کنیم؛ سپس منحنی استاندارد را رسم می‌نماییم. بدین صورت که میزان جذب نوری را روی خط عمودی و میزان غلظت پروتئین را روی خط افقی قرار می‌دهیم. سپس مقادیر قرائت شده را روی منحنی مشخص کرده و آنها را به هم وصل می‌نماییم.

جهت تعیین مقدار پروتئین نمونه مجهول، در یک لوله مقدار ۱۰۰ میکرولیتر نمونه و ۹۰۰ میکرولیتر آب مقطر ریخته و پس از مخلوط کردن محتویات لوله، ۵ میلی‌لیتر از معرف برادفورد به آن اضافه می‌کنیم. پس از ۵ دقیقه، جذب نوری نمونه را در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت نموده و با استفاده از نمودار استاندارد و ضریب رقت، مقدار پروتئین نمونه مجهول را به دست می‌آوریم.

 

منحنی استاندارد برادفورد در محدوده کوچکی خطی می‌باشد که به طور بارز در محدوده ۱۲۰-۲ میکروگرم در میلی‌لیتر می باشد و معمولا لازم است که قبل از اندازه‌گیری نمونه، آن را رقیق نمود.

 

هنگامی که منحنی‌های استاندارد سرم آلبومین گاوی (BSA) و گاماگلبولین گاوی (BGG) با هم مقایسه می‌شوند، اختلاف در سیگنال تولید شده با روش کوماسی (برادفورد) بیشتر از ۳۰ درصد بوده، در حالی که این اختلاف در روش اصلاح شده لوری کمتر از ۱۵ درصد می‌باشد.

روش اصلاح شده برادفورد:

اغلب غیر خطی بودن‌های روش برادفورد، ناشی از تعادل بین دو فرم مختلف رنگ کوماسی بلو بوده که به پروتئین افزوده می‌گردد. با اندازه‌گیری نسبت جذب نوری در طول موج ۵۹۵ نانومتر به ۴۵۰ نانومتر، روش برادفورد خطی می‌شود. این روش اصلاح شده برادفورد تقریبا ۱۰ مرتبه حساس‌تر از روش رایج برادفورد می‌باشد.

 

Refrences:

۱- Bradford MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976: 72; 248-254.

۲- Fanger B. Adaptation of the Bradford protein assay to membrane-bound proteins by solubilizing in glucopyranoside detergents. Anal Biochem. 1987: 162; 11–۱۷٫

۳- Stoscheck CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology. 1990: 182; 50-69.

۴- Zor T. and Selinger Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal. Biochem. 1996: 236; 302–۳۰۸٫

۵- Noble J.E. and Bailey M.J.A. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 2009: 463;73–۹۵٫

۶- Hwang DS., Yoo HJ., Jun JH., Moon WK. and Cha HJ. Expression of functional recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(6): 352–۳۳۵۹

 

مراد رستمی: کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

معصومه جرفی: کارشناس ارشد میکروب شناسی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی