معماری
2

انتخاب روش اندازه‌گیری و استاندارد مناسب در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

انتخاب روش اندازه‌گیری و استاندارد مناسب در اندازه‌گیری پروتئین‌ها

مقدمه:

پروتئین‌ها، دسته‌ای بزرگ و ضروری از ماکروملکول‌های سلولی را تشکیل می‌دهند. تعیین مقدار پروتئین نمونه‌های مختلف، در اغلب موارد، یکی از کارهای ضروری، پیش از جداسازی و خالص‌سازی نمونه‌های مختلف می‌باشد. این مرحله، یک مرحله ضروری قبل از ارائه نمونه‌های پروتئینی مختلف برای انجام کروماتوگرافی، الکتروفورز و تفکیک و آنالیزهای بیشتر ایمونو- شیمی می‌باشد. روش‌های متفاوتی در تعیین غلظت محلول‌های پروتئینی به کار گرفته می‌شوند که آنها را می‌توان به دو دسته روش‌های جذبی و رنگ‌سنجی تقسیم‌بندی نمود. هر یک از این روش‌ها دارای مزایا و محدودیت‌هایی بوده و هیچ کدام دارای دقت ۱۰۰ درصد نمی‌باشند. هر یک از این روش‌ها فقط حضور قسمت خاصی مثلا یک اسید آمینه خاص را از محلول پروتئینی تشخیص می‌دهند. از آنجائی که حضور و فراوانی این قسمت‌ها در پروتئین‌های مختلف با یکدیگر فرق می‌کند، برای رفع این مشکل و افزایش دقت بایستی روش مناسبی را انتخاب نمود. در تمامی این روش‌ها از اسپکتروفتومتر استفاده می‌شود .

 

نکاتی که در استفاده از اسپکتروفتومتر باید رعایت شوند:

۱- از وسایل شیشه‌ای کاملا تمیز استفاده شود.

۲- کووت باید کاملا تمیز بوده و استفاده از کووت‌های یکبار مصرف ارجحیت دارد.

۳- برای پایداری طول موج بایستی دستگاه حداقل ۱۰ دقیقه قبل از شروع اندازه گیری‌ها روشن گردد.

۴- هنگامی که غلظت نمونه بالا می‌باشد بایستی ابتدا نمونه را رقیق نموده و سپس ضریب رقت را در محاسبه غلظت نمونه لحاظ نمود.

 

ساده‌ترین روش اندازه گیری غلظت پروتئین در یک محلول، میزان جذب نور UV آن است. اگر پروتئین خالص باشد، غلظت آن را می‌توان از روی OD به دست آمده، محاسبه کرد. اگر پروتئین خالص نباشد، مقدار جذب نوری، تنها امکان تخمین تقریبی غلظت پروتئین را فراهم می‌سازد. این روش برای مقادیر کم پروتئین
(۰٫۰۵-۰٫۱ mg/ml) در محلولی که حاوی سایر مواد جاذب اشعه UV نظیر بعضی بافرها، اسیدهای نوکلئیک و بعضی لیپیدها و یا محلول های سوسپانسیون باشد، مناسب نیست. روش‌های رنگ‌سنجی، پیچیده‌تر بوده، اما حساس‌تر می‌باشند و برای پروتئین‌هایی که به صورت سوسپانسیون هستند، نیز مناسب است. روش‌های بسیاری برای تعیین غلظت پروتئین‌ها وجود دارند. معیارهایی که برای ارزیابی روش مناسب به کار می‌روند، شامل حساسیت کافی، صحت و قابلیت تکرارپذیری می‌باشد. رایج‌ترین روش برای تعیین اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها در آزمایشگاه‌های بیوشیمی پیشرفته احتمالا روش لوری و (یا) برادفورد است.

 

انتخاب روش اندازه‌گیری مناسب:

اندازه‌گیری پروتئین، به منظور بررسی حضور پروتئین در نمونه به کار می‌رود. این نوع آزمایش‌ها بر پایه توانایی اتصال اختصاصی رنگ به پروتئین حتی در مخلوط‌های کمپلکس مانند شیر یا هموژنیت سلول استوارند. برخی روش‌های اندازه‌گیری پروتئین‌ها، کیفی بوده و فقط حضور و یا عدم حضور پروتئین را در نمونه نشان می‌دهند. روش‌های اندازه‌گیری کمی پروتئین‌ها از قبیل بیوره، لوری، برادفورد و … توانایی تشخیص مقادیر مختلف پروتئین در نمونه را دارا می باشند (جدول ۱). محققین فارماکولوژیست ممکن است از اطلاعات و ویژگی‌های روش اندازه‌گیری پروتئین در ترکیب با سایر آزمایش‌ها برای نتیجه یا فعالیت اختصاصی یک دارو که به عنوان یک پروتئین یا داروی حاوی پروتئین عمل می‌نماید، استفاده کنند.

اگر نمونه‌ها حاوی عوامل احیا کننده یا معرف‌های شلاته کننده مس باشند، روش کوماسی بلو، روش انتخابی می‌باشد. چنانچه نمونه‌های مورد نظر برای آنالیز، حاوی یک یا چند دترجنت (تا غلظت ۵ درصد) باشند، روش انتخابی، روش BCA Bbicinchoninic acid assay)) می‌باشد.

گاهی اوقات نمونه‌ها حاوی موادی هستند که آن‌ها را برای اندازه‌گیری با هر روشی نامناسب می‌سازد. روش ارجح در این گونه موارد، خارج کردن ماده مزاحم با روش‌هایی از قبیل دیالیز، نمک‌زدایی (Desalting)، بلوکه سازی شیمیایی (Chemical Blocking) و رسوب پروتئین و محلول‌سازی مجدد آن (Resolubilization) می‌باشد.

بلوکه سازی شیمی، شامل تیمار نمونه با موادی است که مانع تداخل مواد مزاحم با روش مورد نظر برای اندازه‌گیری می‌شوند. رسوب پروتئین‌ها موجب خارج شدن آنها از محلول می‌شود. در این هنگام، بافر تداخل کننده، خارج شده و پروتئین مجددا محلول می‌گردد. در روش تیمار شیمی، که در روش BCA کاربرد دارد، برخلاف روش رسوب پروتئین‌ها، محلول کردن مجدد پروتئین‌های هیدروفوب انجام نمی‌شود.

 

 

1

جدول ۱: مقایسه روش‌های مختلف رایج اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها

 

 

ویژگی‌های کلی اندازه‌گیری‌های بیوشیمیایی:

  • محدوده پاسخ دینامیک و حساسیت:

همه روش‌های اندازه‌گیری دارای محدوده پاسخ دینامیک می‌باشند. محدوده پاسخ دینامیک عبارت است از محدوده‌ای که غلظت‌های نمونه در آن، ایجاد پاسخ‌های افتراقی نمایند.

 

تصویر ۱: مقایسه حساسیت دو روش اندازه‌گیری مختلف

2

در تصویر ۱، روش اندازه‌گیری B (منحنی B) نشان دهنده توانایی ایجاد پاسخهای افتراقی در محدوده مقادیر وسیع‌تری می‌باشد؛ در حالیکه، روش اندازه‌گیری A (منحنی A)، غلظت‌های پایین‌تر پروتئین را که با روش B نمی‌توان آنها را اندازه‌گیری کرد، نشان می‌دهد. در اینجا می‌گوییم که حساسیت روش A، بیشتر از روش B می‌باشد. در نتیجه، روش A ممکن است در مواردی که غلظت پروتئین نمونه پایین است، روش انتخابی باشد. نمونه‌های دارای غلظت بالای پروتئین را می‌توان به وسیله رقیق کردن با این روش (روش A) انجام داد.

 

  • اختصاصیت:

یک روش اندازه‌گیری اختصاصی تنها با ماده مورد اندازه‌گیری و نه هر گونه ماده دیگر، واکنش می‌دهد. هر گونه ماده دیگری که تولید پاسخهای مشابه با ماده مورد نظر برای اندازه‌گیری نماید، ماده «تداخل کننده یا مداخله‌گر» نامیده می‌شود. روش‌های اندازه‌گیری بسیار کمی، ۱۰۰ درصد اختصاصی عمل کرده و اکثر روش‌ها، به برخی مواد مداخله‌گر پاسخ می‌دهند. یک محقق کارآزموده می‌داند که چه موادی با روش اندازه‌گیری تداخل ایجاد کرده و چه مواد مداخله‌گری احتمالا در نمونه حضور دارند.

 

  • بازیافت نمونه:

در برخی موارد، مقدار نمونه موجود، بسیار محدود و کم می‌باشد. در این گونه موارد لازم است که برای کارهای بعدی، نمونه پروتئین را از روش اندازه‌گیری بازیافت نماییم. برای این کار لازم است روشی را انتخاب کنیم که ساختمان پروتئین را تخریب ننماید.

 

  • مقرون به صرفه بودن:

یکی از کارهای ضروری برای انتخاب هر روشی، مقرون به صرفه بودن و در دسترس بودن مواد مورد نیاز برای آن روش می‌باشد. شما باید هزینه تجهیزات، معرفهای شیمیایی و ساعت کاری پرسنل را برای تهیه و ساخت معرفها و مواد شیمیایی و انجام آزمایش را مد نظر قرار دهید.

 

  • ایمنی:

روشی را که بر می‌گزینم باید تا حد امکان دارای کمترین احتمال خطر برای پرسنل و محیط زیست و طبیعت باشد.

 

 

انتخاب استاندارد مناسب در اندازه‌گیری پروتئین‌ها:

در اندازه‌گیری پروتئین‌ها، انتخاب استاندارد نامناسب می‌تواند بزرگترین منبع ایجاد خطا باشد. بهترین انتخاب برای نوع استاندارد پروتئین، نمونه با خلوص بالای پروتئین غالب یافت شده در نمونه می‌باشد. البته این کار همیشه امکان‌پذیر نبوده و از طرفی ضروری هم به نظر نمی‌رسد. در برخی موارد در مراحل اولیه خالص‌سازی یک پروتئین، فراکشنی که حاوی بیشترین مقدار پروتئین می‌باشد به عنوان استاندارد انتخاب می‌نماییم. اگر نمونه با خلوص بالای پروتئین مورد نظر که قرار است به عنوان استاندارد انتخاب کنیم در دسترس و یا مقرون به صرفه نباشد، از نمونه (پروتئینی) استفاده می‌نماییم که منحنی ایجاد پاسخ رنگ آن، مشابه منحنی ایجاد شده در روش اندازه‌گیری پروتئین مورد نظر باشد.

به طور کلی، سرم آلبومین گاوی (BSA)، به دلیل وفور فرم با خلوص بالا و هزینه نسبتا پایین آن، استاندارد مناسبی تلقی می‌شود. اگرچه وجود ایمونوگلبولین‌های متعدد در استاندارد BSA، از معایب آن به شمار می‌رود.

گاما گلبولین گاوی (BGG) نیز در هنگامی که به دنبال تشخیص غلظت آنتی‌بادی‌ها هستیم، استاندارد مناسبی محسوب می‌گردد؛ زیرا منحنی ایجاد پاسخ رنگ آن بسیار شبیه منحنی ایجاد پاسخ رنگ ایجاد شده توسط ایمونوگلبولین G می‌باشد.

در هر روش اندازه‌گیری پروتئین، پروتئین ایده‌آلی که می‌توانیم به عنوان استاندارد انتخاب کنیم، فرم خالص شده همان پروتئین مورد نظر برای اندازه گیری است. در صورت در دسترس نبودن فرم خالص آن پروتئین، پروتئینی ارجح است که رنگ حاصل از واکنش آن، مشابه رنگ حاصل از واکنش پروتئین مورد نظر برای اندازه گیری باشد. انتخاب این نوع پروتئین بیشتر از روی تجربه انجام می‌گیرد. در مواردی که هیچ یک از این دو روش عملی نبوده و یا ضرورتی برای این کار احساس نشود، ممکن است که هر پروتئینی برای انتخاب استاندارد استفاده شود. دو پروتئین رایج که به عنوان استاندارد انتخاب می‌شوند شامل سرم آلبومین و گاماگلبولین گاوی می‌باشند.

 

برای صحت بیشتر محاسبه غلظت پروتئین توتال نمونه مجهول، ضروری است که در هنگام انجام آزمایش، منحنی استاندارد نیز رسم نماییم. این کار به ویژه در روش‌هایی که تولید منحنی‌های استاندارد غیر خطی می‌نمایند باید انجام شود. تصمیم‌گیری در مورد تعداد استانداردها و تعداد دفعات تکرار آنها، به درجه غیر خطی بودن منحنی استاندارد و میزان صحت مورد نیاز در اندازه‌گیری پروتئین، بستگی دارد. به طور کلی، اگر منحنی ایجاد پاسخ رنگ استاندارد، خطی باشد، به تعداد نقاط کمتری نیاز خواهیم داشت. منحنی‌های استاندارد معمولا با استفاده از تکرار هر نقطه به تعداد حداقل دو بار، رسم می‌شوند.

 

رسم منحنی استاندارد:

در تمامی روش‌های رایج تعیین غلظت پروتئین، باید منحنی استاندارد رسم شود. منحنی استاندارد از تعیین میزان جذب نور در غلظت‌های مشخص نمونه استاندارد به دست می‌آید. در اندازه‌گیری غلظت پروتئین‌ها معمولا از سرم آلبومین گاوی (BSA) به عنوان نمونه استاندارد استفاده می‌شود. اگر چه این پروتئین همیشه نمی‌تواند به عنوان یک استاندارد کامل و بی‌نقص عمل کند، اما در عمل، رایج‌ترین استاندارد مورد استفاده می‌باشد. معمولا به منظور جلوگیری از اختلاف در غلظت پروتئین استاندارد، نمونه استاندارد BSA را در محلول های ذخیره با غلظت ۵-۱ میلی گرم در میلی‌لیتر در حجم‌های بالا (۱۰۰-۵۰ میلی‌لیتر) تهیه کرده و به صورت قسمت‌های ۲-۱ میلی‌لیتری در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری می‌نمایند.

 

در تهیه منحنی استاندارد با BSA رعایت نکات زیر الزامی است:

۱- BSA پتانسیل آلودگی به پریون را دارد.

۲- BSA یک پروتئین چسبناک بوده و به ظروف مورد استفاده متصل می‌شود.

۳- در هنگام محلول کردن BSA آن را به آرامی مخلوط نمایید.

۴- در حجم‌های کاری مناسب (معمولا یک میلی‌لیتری) در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شود.

۵- در هنگام استفاده از استاندارد بایستی اجازه داد که محلول BSA کاملا به دمای اتاق برسد.

۶- غلظت‌های مورد نیاز بسته به روش مورد استفاده، متفاوت می‌باشند. در روش‌های حساس‌تر مانند برادفورد باید از طیف غلضتی کوتاهتری (معمولا ۲۵-۰ میکروگرم) به منظور حفظ خطی شدن منحنی استاندارد استفاده شود.

۷- برای تهیه استانداردهای مربوطه باید از همان بافرهای موجود در نمونه استفاده شود.

۸- به منظور دستیابی به نتیجه بهتر و دقیق‌تر، باید از قرار گرفتن جذب نمونه مجهول در بین دو نقطه از جذب‌های استاندارد اطمینان حاصل شود.


 

Refrences:

۱- Bradford MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976: 72; 248-254.

۲- Zor T. and Selinger Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal. Biochem. 1996: 236; 302–۳۰۸٫

۳- Noble J.E. and Bailey M.J.A. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 2009: 463;73–۹۵٫

۴- Glover BP. and McHenry C.S. The DNA Polymerase III oloenzyme – an asymmetric dimeric replicative complex with leading and lagging strand polymerases. Cell. 2001: 105; 924-934.

۵- Knight MI. and Chambers PJ. Problems associated with determining protein concentration. Molecullar Biotechnology. 2003: 23; 19-23.

۶- Gornall AG., Bardawill CJ. and David MM. Determination of serum proteins by means of the Biuret reaction. Journal of Biological Chemistry. 1949: 177; 751.

۷- Layne E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Methods in Enzymology. 1957: 3; 447.

۸- Peterson GL. Determination of total protein. Methods in Enzymology. 1983: 91; 95.

 

مراد رستمی: کارشناس ارشد بیوشیمی بالینی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

معصومه جرفی: کارشناس ارشد میکروب شناسی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز

 

برگرفته از ماهنامه اخبار آزمایشگاهی