معماری

کمی لومینسانس (CL) Chemiluminescence or Chemical Light

از زمانیکه انسان برای اولین بار متوجه کمی لومینسانس شد و بر وی مشخص گردید که نور سرد کرم شب تاب با نور داغ آتش تفاوت دارد مدت مدیدی می گذرد ولی تنها در چند سال اخیر این مطلب مورد توجه انسان قرار گرفته است.

کمی لومینسانس انرژی آزاد شده از یک واکنش را بدون دخالت حرارت یا شعله، مستقیما به نور تبدیل می کند واکنش شیمیایی کرم شب تاب بارزترین و جالب ترین نمونه در این زمینه است در واقع برای هرمولکول واکنش گر شیمیایی، این امکان وجود دارد که یک فوتون نور ایجاد کند. کرم شب تاب با تولید ۸۸ فوتون برای هر ۱۰۰ مولکول در یک کوانتوم دارای بازده ۸۸ درصد می باشد.

کمی لومینسانس معمولا تشعشعی از مولکول های انرژی زا است. اساس کمی لومینسانس ایمنواسی همان اصول واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی است با این تفاوت که نشانگر های بکار گرفته شده در این روش موادی از قبیل لومینول، ایزولومینول و یا اکریدینیوم است که از خود فوتون ساطع می کنند. در نتیجه ی واکنش شیمیایی صورت گرفته به روش کمی لومینسانس الکترونها تهییج شده و به مدار بالاتر می روند . انرژی حاصله از برگشت این الکترونها به مدار اولیه موجب ساطع شدن فوتون می گردد که توسط دستگاه لومینومتر قابل اندازه گیری است.

فوتونهای نوری حاصل از واکنش های کمی لومینسانس توسط Photo Multiplier Tube Detector (PMT) ابتدا به پالس الکتریکی تبدیل شده و پس از افزایش سیگنالهای حاصله، به روش دیجیتالی شمارش می گردد. به عبارت ساده تر دستگاه های لومینومتر به روش فوتون سنجی
می توانند غلظت آنالیت مورد نظر را مشخص نمایند.

امروزه تکنولوژی برتر کمی لومینسانس با استفاده از دانش فوتون سنجی به دلیل دقت فوق العاده و حساسیت بسیار بالا در حد زپتا مول (۲۱-۱۰) و همچنین بی خطربودن مواد مصرفی بعنوان روش مرجع در اغلب کشورهای جهان مورد استفاده قرار گرفته و بتدریج جایگزین روش های
ELISA, RIA گردیده است.

نوارهای نوری حاصل از این تکنیک از تشعشعات مولکولی منشاء می گیرند و بنابراین پهن تر و پیچیده تر از نوارهای گرفته شده از طیف اتمی هستند. علاوه بر این کمی لومینسانس می تواند یا در مرحله محلول بودن یا گاز، صورت بگیرد در صورتیکه طیف سنجی تشعشع اتمی یک پدیده مختص به مرحله گازی بوده است.

تکنیک ایمنواسی براساس نوع ماده نشانگر مورد استفاده به گروههای زیر تقسیم می گردند.

  • Radio Immuno Assay (RIA) که در آن از رادیوایزوتوپ (معمولا I125) برای نشان دار کردن آنتی ژن یا آنتی بادی استفاده می شود.
  • Enzyme Immuno Assay (EIA) که در آن از سیستم آنزیم – سوبسترا استفاده می شود.
  • Fluorescence Immuno Assay (FIA)که در آن از یک ماده فلورسانس (طبیعی یا یک رنگ) استفاده می شود.
  • ViroImmuno Assay (VIA) که در آن از یک باکتریوفاژ غیرفعال استفاده می شود.
  • ChemiluminescenceImmuno Assay (CLIA) که در آن از استرهای آکریدینیوم یا لومینول استفاده می شود.

اساس واکنش های ایمنواسی شناسایی آنتی ژن توسط آنتی بادی اختصاصی و واکنش میان آنهاست.

چنانچه آنتی ژن نشان دار شود روش مربوطه را Immuno Assay و در صورتیکه آنتی بادی نشان دار شود آن را تکنیک Immunometric Assay می نامند.

لومینسانس بسته به روش تهییج و مکانیسم انتشار نور حاصله به گروههای مختلف تقسیم می شود. براین اساس در آزمایشگاه تشخیص طبی چهار نوع لومینسانس طبی وجود دارد.

  • کمی لومینسانس : به علت انرژی حاصل از واکنش شیمیایی اتم های تهییج شده و در برگشت به حالت پایه تولید نور می کند.
  • الکترو کمی لومینسانس : بعلت ایجاد انرژی الکتریکی حاصل از واکنش های الکتروشیمیایی اتم ها تهییج می شوند. واکنش الکتروشیمیایی ایجاد شده انرژی لازم جهت تهییج الکترون ها را فراهم کرده و در برگشت به حالت پایه نور ساطع می کند.
  • فلورسانس
  • فسفرسانس

واکنش های کمی لومینسانس را عموما به دو دسته عمده می توان تقسیم نمود:

  • واکنشهای Flash: این نوع واکنش دارای نیمه عمری حدود ۳/۰ تا ۲ ثانیه است. این واکنشها به سرعت حادث شده و به سرعت به نقطه اوج می رسند و پس از حدود۲ تا ۴ ثانیه به کلی از بین می روند. این واکنش ها دارای حساسیت بسیار بالا می باشند. کوتاه بودن زمان ایجاب می کند که این واکنشها در مقابل Detector دستگاه انجام پذیرد تا به محض شروع واکنش دستگاه قادر به خواندن تعداد فوتون آزاد شده باشد.
  • واکنشهای Glow : در این واکنشها نقطه اوج و پیک حدود ۲ تا ۵ دقیقه بعد از شروع واکنش رخ می دهد وواکنش می تواند ۲۰ تا ۳۰ دقیقه به طول انجامد به عبارت دیگر حدود ۲ تا ۷ دقیقه بعد از شروع واکنش اکسیداسیون تعداد فوتونها به حداکثر میزان خود می رسند شدت نور تا حدود ۲۰ تا ۳۰ دقیقه در محیط در حد ثابت باقی می ماند و قابل اندازه گیری است و سپس به تدریج کاهش می یابند.

حساسیت واکنش های Glow کمی پایین تر از نوع  Flash است اما به دلیل اینکه این حساسیت به مراتب بیش از میزان مورد نیاز برای اندازه گیری های متداول در آزمایشگاه های بالینی است لذا نیازی به استفاده از روش Flash با توجه به هزینه گران آن در این نوع آزمایشگاه ها احساس نمی گردد. بدلیل ماهیت واکنشهای Glow این نوع واکنش امکان بازخوانی مجدد را فراهم می کند که کاربرد زیادی در آزمایشگاه های تشخیص طبی دارد حساسیت این روش هزاران بار بیشتر از روش ELISA است که ضمن تامین حساسیت و دقت برای آزمایشگاه های بالینی می تواند از لحاظ اقتصادی نیز مقرون به صرفه باشد.

محدودیت های اصلی روش RIA:

  • مشکل بودن تهیه ترکیبات نشاندار رادیواکتیو
  • قیمت گران دستگاههای اندازه گیری RIA
  • محدوده تشخیص خاص
  • مسایل مربوط به ایمنی
  • محدود بودن حساسیت
  • عدم امکان انجام اتوماتیکتست ها
  • عمر کوتاه معرف های رادیوایزوتوپ

مزایای روش کمی لومینسانس (CLA):

  • محدوده اندازه گیری در طیف وسیع آنالیت ها (هورمون ها، سم شناسی، تومورمارکرها، ویروس شناسی، ژنتیک، میکروب شناسی، اندازه گیری سطح داروها در بدن، بیماری های قلبی و دیابت)
  • نیمه عمر طولانی کیتها همانند ELISA
  • تکرارپذیری بالا به دلیل دقت و حساسیت زیاد
  • در دسترس بودن کیتها و پایداری کونژوگه
  • عدم وجود ترکیبات سمی، تشعشعی و سرطان زا
  • ویژگی زیاد، اختصاصیت بالا و CV پایین
  • اندازه گیری غلظت کم آنالیت ها که قبلا با روش های دیگر قابل شناسایی نبود.
  • کنترل کیفی و کالیبراسیون مناسب وپایدار
  • نداشتن مشکلات و محدودیت های رنگ سنجی همانند ELISA
  • عدم نیاز به منبع نوری و فیلترهای خاص

CLIA به مراتب حساس تر از RIA (1000 برابر) بوده و با استفادهاز این روش امکان اندازه گیری آنالیت تا غلظت ۱۵-۱۰ گرم (یعنی Femtogram) در میلی لیتر وجود دارد.

نشانگرهای کمی لومینسانس:

بعضی از ترکیبات به هنگام اکسیده شدن تولید نور می کند (کمی لومینسانس).

  • استرهای آکریدینیوم قادرند نور تولید کنند بدین ترتیب که ابتدا از طریق واکنش با H2O2 قلیایی (بعنوان یک ماده اکسیدکننده) واسطه هایی با انرژی بالا ایجاد می کنند که سپس به قطعه تحریک شده شکسته شده و نور لحظه ای آبی شدید (کمی لومینسنس نوع Flash) ساطع می کنند که توسط یک لومینومتر قابل شناسایی است.
  • لومینول در حضور یکماده اکسیده H2O2 و یک کاتالیست (یون فلزی) اکسید شده و به یک ماده حدواسط تحریک شده، تبدیل می گردد که به حالت پایه بازگشته و نور آبی ساطع
    می کند که به مدت چند دقیقه تا چند ساعت قابل رویت بوده و توسط لومینو متر قابل آشکارسازی است.

 

پاسخ دهید