معماری

(ELISA) Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

روشهایی که از آنتی بادی ها بعنوان فاکتورشناساگر بهره می گیرند روش های سنجش ایمنی نام دارند. شناسایی آنالیت اولیه یا آنچه که می خواهیم اندازه بگیریم اولین مرحله در این نوع سنجش است و این عمل توسط Ab صورت می گیرد. به عبارتی در هر سنجش ایمنی واکنش آنتی ژن و آنتی بادی اساس می باشد. در برخی موارد در محدوده معینی از غلظت آنتی ژن و آنتی بادی انجام واکنش منجر به تشکیل رسوب قابل رویت می گردد اما در اغلب موارد قبل و بعد از انجام واکنش آنتی ژن و آنتی بادی تغییر قابل مشاهده ای وجود ندارد لذا وجود سیستم نشانه گذاری ضروری به نظر می رسد. براساس نوع ماده ای که جهت نشانه گذاری بکار برده می شود سنجش های ایمنی رادیواکتیو، سنجش های ایمنی آنزیمی و سنجش های ایمنی فلوئورسانس و … داریم.

در ELISA هم مانند سنجش های ایمنی رادیواکتیو همان واکنش آنتی ژن و
آنتی بادی است با این تفاوت جهت ردیابی واکنش به جای رادیواکتیویته از آنزیم و واکنش آنزیمی کمک گرفته می شود. در این روش جهت ردیابی واکنش، آنتی ژن و یا آنتی بادی را با آنزیم نشان دار می کنند. به عمل نشاندارسازی کونژوگاسیون و به مولکول آنزیم دار، کونژوگه آنزیمی نیز می گویند اگر آنتی ژن کونژوگه شود روش را (Enzyme Immuno Assay) EIA گویند و اگر آنتی بادی کونژوگه گردد روش را (Immuno Enzyme Meteric Assay) IEMA می گویند.

اساس روش در کونژوگاسیون آنتی ژن یا EIA ، رقابت میان آنتی ژن کونژوگه و
آنتی ژن آزاد در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی بادی معین است در اینجا میزان کمپلس آنزیم دار رابطه معکوس دارد.

در کیت های مورد استفاده در آزمایشگاه اغلب آنتی ژن مورد نظر به ته چاهک بکار برده شده متصل یا Coat شده است چون پیوند کوالانس پایدارترین نوع پیوند است غالبا آنتی ژنها با استفاده از پیوند کووالانس به ته چاهک متصل می شوند برای اینکار ابتدا یک لایه کربوکسیل به پلیت اضافه کرده بعد از ۲۴ ساعت انکوباسیون، آن را شستشو داده و سپس آنتی ژن مورد نظر را اضافه می کنند تا به ته چاهک بچسبد، باید متذکر شد که کیت هایی مناسب تر هستند که اتصال آنتی ژن به
ته چاهک با استفاده از پیوند کووالان انجام شده باشد. در مرحله بعدی سرم بیمار را با استفاده از رقیق کننده یا Sample diluent موجود در کیت و به نسبت ذکر شده رقیق نموده و سپس سرم رقیق شده را به چاهک اضافه کرده و انکوبه می کنیم در زمان انکوباسیون در صورت وجود آنتی بادی مورد نظر در سرم، با فاز جامد یا آنتی ژن موجود در ته چاهک واکنش می کند. سپس با استفاده از محلول شستشو Washing Buffer سرم آزاد را از محیط خارج می کنیم تعداد دفعات شستشو و حجم بافر بکار شده با نوع کیت متفاوت خواهد بود. مرحله شستشو از اهمیت خاصی برخوردار است و استفاده از دستگاه ههای واشر اتوماتیک به منظور یکنواخت بودن و دقیق بودن عمل شستشو توصیه می شود. در مرحله بعد کونژوگه موجود در کیت که آنتی هیومن IgG نشان دار شده با آنزیم
می باشد به چاهک اضافه می گردد در اکثر کیت های مورد استفاده آنزیم بکار شده
Horseradish peroxidase می باشد که مجموع آنتی هیومن و آنزیم با فاز جامد ایجاد یک کمپلکس می کند.

پس از انکوباسیون مجددا عمل شستشو انجام می گیرد و سپس محلول سوبسترا که در اکثر کیت ها TMB یا (TetramethyleBenzidine) می باشد اضافه می گردد که باعث ایجاد رنگ آبی شده و پس از اضافه نمودن محلول متوقف کننده که یک نوع اسید می باشد، واکنش پایان یافته و رنگ زرد ایجاد می شود.

در این مرحله وظیفه اسید اضافه شده دناتوره کردن آنزیم و خاتمه واکنش
می باشد، رنگ زرد ایجاد شده را در طول موج ۴۵۰nm در برابر بلانک، استانداردها  و کنترلهای بکار برده شده می خوانیم.

مزایای واکنشهای آنزیمی  ELISA:

  • عدم وجود خطر تشعشع: به هر حال همان میزان تشعشع کم نیز از مواد غیررادیواکتیو خطر بیشتری دارد.
  • قیمت ارزان تر دستگاه ها: قیمت دستگاه های خوانش گر در سیستم های الایزا کمتر از پنجاه درصد قیمت سیستم های خوانش گر رادیواکتیو است.
  • معرف های ارزان: در این روش واکنش آنتی ژن – آنتی بادی با فعالیت آنزیمی پیگیری می شود. خوشبختانه مواد مورد نیاز جهت این پیگیری با توجه به نوع آنزیم های بکار رفته ارزان و در دسترس هستند بعلاوه از پایداری نسبتا بالایی برخوردارند که این نیز از مزایای روش های آنزیمی است.
  • نیمه عمر طولانی کیت های آنزیمی: یکی از محدودیت های اصلی روش های رادیواکتیو، نیمه عمر ایزوتوپ رادیواکتیو است اما حداقل زمان پایداری کلیه اجزاء کیت های آنزیمی حداقل شش ماه، حداکثر بیست و چهار ماه و بطورمتوسط یکسال است که نسبت به نیمه عمر کیت های رادیواکتیودار بسیار قابل ملاحظه می باشد.
  • امکان اتوماسیون : از آنجائیکه آنزیم ها به حالت آزاد و متصل دارای دو نوع فعالیت هستند یا در حالت آزاد فعال و در حالت کمپلکس غیرفعال و یا برعکس، امکان طراحی دستگاه های سنجش اتوماتیک با این شیوه بدون نیاز به جداسازی آنزیم های متصل از آزاد وجود دارد.
  • سرعت خوانش بالا: در دستگاه های گاما کانتر جهت حفظ دقت حداقل سی ثانیه و حداکثر یک دقیقه برای خوانش نتیجه هر آزمون مورد نیاز است ولی در ELISA با استفاده از تکنولوژی فیبر نوری امکان خوانش همزمان کلیه آزمون ها در کمتر از سه ثانیه امکان پذیر است.
  • امکان افزایش حساسیت روش: در بکارگیری رادیواکتیو چون انرژی حاصل از متلاشی شدن هسته های رادیوایزوتوپ یک پارامتر ثابت فیزیکی است امکان افزایش حساسیت تا حد محدودی وجود دارد ولی با استفاده از آنزیم هایی با حساسیت بالا می توان حساسیت روش ELISA را بسیار افزایش داد و بالاترین حساسیت گزارش شده در مقالات ایمنی مربوط به IEMA است نه IRMA .
  • از آنجائیکه آنزیم های متفاوت واکنش آنزیمی متفاوت و قابل ردیابی ایجاد می کنند در یک نمونه می توان با استفاده از دو یاچند کونژوگه آنزیمی و پیگیری فعالیت آنها به طور همزمان چند ماه را مورد سنجش قرار داد.

معایب واکنشهای آنزیمیELISA  :

چون فعالیت رادیواکتیو یک پارامتر ثابت فیزیکی است میزان آن تحت تاثیر شرایط محیطی مانند نور، درجه حرارت، آلودگی و … قرار نمی گیرد اما واکنش آنزیمی تحت تاثیر پارامترهای مختلف قرار می گیرد. لذا ردیابی رادیواکتیویته پایدار و آسان تر از اندازه گیری فعالیت آنزیمی است همچنین اجزاء مختلف موجود در نمونه می توانند واکنش های آنزیمی را تحت تاثیر قرار بدهند.

نکاتی که به هنگام کار با ELISA باید رعایت شود:

  • صحت عمل دستگاه شستشو را روزانه به صورت روتین چک کنید.
  • مطمئن شوید که چاهک ها به هنگام شستشو پر می شوند.
  • از سرریز شدن محلول شستشو و ورود آن به چاهک های مجاور بپرهیزید.
  • در هنگام خالیکردن یا آسپیره کردن محلول شستشو اطمینان حاصل کنید که تمامی آن خارج شود.
  • پس از اتمام مراحل شستشو با برگرداندن پلیت بر روی کاغذ نم گیر (صافی) ذرات باقیمانده را خارج کنید.
  • سمپلرهای بکار برده شده را طبق دستور کارخانه سازنده کالیبره کنید.
  • از تماس نوک سمپلر از دیواره یک چاهک به چاهک دیگر بپرهیزید.
  • ازپاشیدن شدن نمونه ها و محلول ها به اطراف و سایر چاهک ها بپرهیزید.
  • برای هر نمونه یا محلول از نوک سمپلر جدید استفاده کنید.
  • قبل از انجام آزمایش مواد موجود در کیت را به دمای اطاق برسانید.
  • استرپهای استفاده نشده را همراه با نم گیر به داخل کیسه مخصوص برگرداننده و در آن را خوب ببندید.
  • قبل از خواندن OD زیر پلیت را با دستمال مخصوص بدون پرز پاک کنید.
  • در طول انجام آزمایش از خشک شدن کف چاهکها بپرهیزید.
  • از محکم شدن نوک سمپلر ها به سرسمپلر اطمینان حاصل کنید.
  • از ایجاد کف و حباب به هنگام افزودن نمونه ها خودداری کنید چون کف ایجاد شده مانع اتصال صحیح خواهد شد.
  • دمای آزمایش بسیار مهم بوده و ضمنا قبل از آزمایش دمای انکوباتور بکار برده شده را چک و تنظیم کنید زیرا در صورت بالابودن دما مایع موجود در چاهک ها تبخیر شده باعث افزایش OD خوانده شده می شود.
  • پس از اضافه نمودن TMB حتما پلیت باید در تاریکی انکوبه شود.

پاسخ دهید