سرولوژی و روش های آزمایشگاهی

معمولا میل پیوندی را با ثابت تفكیك در IgE یا IgM پنتامر، هر آنتی‌بادی به‌تنهایی می‌تواند با تعداد قابل توجهی جایگاه مختلف اتصال برقرار كند (از نظر تئوری با حداكثر 10 جایگاه مختلف).

آنتی‌ژن‌های پلی‌والان بیش از یك كپی از یك شاخص را دارند. علیرغم اینكه میل پیوندی هرجایگاه اتصال به آنتی‌ژن برای هریك از اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن‌های پلی‌والان یكسان می‌باشد ولی نیروی اتصال آنتی بادی به آنتی ژن با در نظر گرفتن اتصال تمام جایگاهها به تمام اپی توپهای در دسترس محاسبه میگردد. این نیروی کلی اتصال را میل پیوندی تام [3] گویند و بسیار قویتر ازمیل پیوندی هریك از جایگاهها به تنهایی می‌باشد.

از دیدگاه ریاضی، نیروی میل‌پیوندی تام به ازای هر جایگاه اشغال شده، بصورت تصاعد هندسی (به‌جای تصاعد حسابی) افزایش می‌یابد. بنابراین، یك مولكول IgM با میل پیوندی پائین می‌تواند بطور بسیار محكمی به یك آنتی‌ژن چند ظرفیتی متصل شود، چون تعداد زیادی از واكنش‌های بامیل پیوندی پائین می‌توانند یك واكنش با میل پیوندی تام قوی بوجود آورند.

1-4-1 عواملی كه در واكنش اتصال آنتی‌بادی به آنتی‌ژن دخالت دارند:

1-4-1-1 pH محیط

مناسب‌ ترین pH برای واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌ بادی pH = 7.2 می‌باشد. در pH پائین‌ تر از a7.2 اتصال آنتی‌ بادی به آنتی‌ ژن ضعیف می‌ باشد، بطوریكه در pH = 2.2 كمپلكس آنتی‌ژن و آنتی‌بادی كاملا از یكدیگر جدا می‌شوند. از طرف دیگر اتصال آنتی‌ ژن به آنتی‌ بادی در pH بالا تا حدود a8.6 نیز امكان پذیر است. لازم به تذكر است كه IgD نسبت به اسیدها بسیار حساس است و در محیط اسیدی دناتوره می‌شود.

1-4-1-2 قدرت یونی محیط (μ)

واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی در محیطی كه فاقد الكترولیت‌ها باشد مانند آب مقطر صورت نمی‌گیرد. قدرت یونی محیط در حقیقت مولاریته نمكهای محلولی است كه آنتی‌ژن و آنتی‌بادی در آن محلول قرار دارند. چنانكه غلظت نمك زیاد باشد باعث رسوب آنتی‌بادی و آنتی‌ژن پروتئینی می‌شود. معمولا سرم فیزیولوژی a0.15 مولار و یا تامپون فسفات نمكی PBS با قدرت یونی a0.02 مولار فسفات در pH=7.2 برای رقیق كردن سرم بیمار و مشاهده واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی بسیار مناسب است.

1-4-1-3 نسبت غلظت آنتی‌ژن و آنتی‌بادی:

واكنش‌های چند ظرفیتی بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی، از نظر بیولوژیك حائز اهمیت هستند، زیرا بسیاری از اعمال اجرایی آنتی‌بادیها زمانی به اندازه مطلوب تحریك می‌شوند كه دو یا چند مولكول آنتی‌بادی در كنار هم قرار گیرند و به یك آنتی‌ژن چندظرفیتی متصل شوند.

اگر یك آنتی‌ژن چندظرفیتی با آنتی‌بادی اختصاصی خود در یك لولة آزمایش مخلوط شود، این دو به یكدیگر اتصال پیدا كرده و كمپلكس‌های ایمنی را بوجود می‌آورند. در غلظت‌های مناسب كه منطقه تعادل  نامیده می‌شود آنتی‌بادی و آنتی‌ژن شبكه‌ای با اتصالات متقاطع وسیع تشكیل می‌دهند كه در آن مولكول‌ها با پیوندهای غیر كووالان به همدیگر متصل می‌شوند، به‌گونه‌ای كه تمام و یا اكثر مولكولهای آنتی‌ژن و آنتی‌بادی بصورت توده‌های بزرگی از كمپلكس‌ها در می‌آیند.

تجزیه كمپلكس‌های ایمنی به توده‌های كوچكتر هم از طریق افزایش غلظت آنتی‌ژن صورت می‌گیرد كه در آن مولكول‌های آنتی‌ژن آزاد، جای آنتی‌ژن اتصال یافته به جایگاههای اتصالی آنتی‌ژن را می‌گیرند (ناحیة فزونی آنتی‌ژن)  و هم از طریق افزایش غلظت آنتی‌بادی صورت می‌گیرد كه در آن مولكولهای آنتی‌بادی آزاد به‌جای آنتی‌بادیهای اتصال یافته به شاخص‌های آنتی‌ژنی قرار می‌گیرند (ناحیة فزونی آنتی‌بادی)

1-4-1-4 تأثیر مواد احیا كننده:

ایمونوگلوبولین‌ های IgE، IgD و IgM نسبت به مواد احیا كننده مانند 2- مركاپتواتانل و دی‌تیوتریتول (DTT) حساسیت بیشتری نسبت یه IgG و IgA دارند.

بنابراین در بعضی آزمایشهای آنتی‌ژن – آنتی‌ بادی چنانچه تشخیص و اندازه‌ گیری IgG از IgM موردنظر باشد، با افزودن مقدار معینی از یك ماده احیا كننده به‌ سرم، IgM تجزیه شده، ولی IgG سالم مانده و اندازه‌گیری می‌شود. البته مشخص است كه در غلظت‌های بالای مواد احیا كننده، تمام كلاسهای ایمونوگلوبولین تجزیه می‌شوند.

1-4-1-5 درجه حرارت:

بنظر می‌ رسد كه درجه حرارت تأثیر چندانی بر روی عكس‌ العمل‌ های آنتی‌ ژن و آنتی‌ بادی ندارد ولی با این وجود در درجه حرارت 37°c ، واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی سریعتر قابل رؤیت هستند.

در درجات حرارت پائین حتی در صفر درجه سانتیگراد نیز واكنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی صورت می‌گیرد.

در حرارت بالاتر از 56°c بمدت نیم ساعت ابتدا IgD, IgE (همچنین سیستم كمپلمان) فعالیت بیولوژیكی خود را از دست می‌دهند.

در درجه حرارتهای بالاتر از 70°c، سایر كلاسهای ایمونوگلوبولین نیز ممكن است دناتوره شوند و به آنتی‌ژن متصل نشوند.

در بعضی بیماریها، ایمونوگلوبولین خاص در سرم پیدا می‌ شود كه در درجه حرارت كمتر از 37°c رسوب می‌كند. به این دسته از Igها اصطلاحا كرایوایمونوگلوبولین  می‌ گویند و از كلاس IgM و گاهی IgG و بندرت IgA می‌باشند. از طرف دیگر بعضی از ایمونوگلوبولین‌ ها در گرمای حدود 60 تا 70 درجه سانتیگراد، نامحلول و بطور برگشت‌پذیر رسوب می‌كنند. این دسته از پروتئین‌ها را پیروگلوبولین می‌گویند.

1-4-1-6 زمان:

اتصال مولكولهای آنتی‌بادی به آنتی‌ژن معمولا بسرعت و در عرض چند ثانیه صورت می‌گیرد ولی برای تشكیل كمپلكس و دیدن واكنش مدت‌زمانی وقت لازم است و این زمان برای هر آزمایش باتوجه به نوع آنتی‌ژن و كلاس آنتی‌بادی متفاوت است. بطور كلی چنانكه آنتی‌ بادی از كلاس IgM و مولكولهای آنتی‌ ژن درشت باشند، زمان لازم برای دیده شدن كمپلكس آنتی‌ ژن و آنتی‌ بادی كوتاهتر از كلاس IgG است، مانند تعیین گروه خونی ABO در مقایسه با سیستم Rh.

1-4-1-7 عوامل مداخله‌گر موجود در سرم:

گاهی موادی كه بصورت طبیعی در سرم حضور دارند مانع بعضی از واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی می‌شوند. بعضی از مواد شناخته شده عبارتند از: اینترفرون، كمپلمان، بتالیزین‌ها و یا موادی كه توسط میكروبهای فلور طبیعی بدن ترشح و وارد خون می‌شوند.

1-5 انواع واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی

بوسیلة آزمایشهای سرولوژیك می‌توان یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مجهول را شناسایی و مقدار آن را اندازه‌گیری نمود. وقتی كه آنتی‌ژن و آنتی‌بادی ضدآن با یكدیگر مخلوط می‌شوند، براساس فرم یا ساختمان مولكولهای آنتی‌ژن، كمپلكس آنتی‌بادی و آنتی‌ژن به شكلهای مختلفی تشكیل می‌شود و رسوب می‌كنند. بنابراین براساس شكل مولكولهای آنتی‌ژن، واكنش‌های آنتی‌ژن – آنتی‌بادی را به سه دسته تقسیم می‌نمایند.

1-5-1 واكنش‌های رسوبی

در این واكنش‌ها آنتی‌ژن بصورت مولكولهای محلول است مانند پروتئین‌های سرم یا مواد ترشح شده از میكروب‌ها

1-5-2 واكنش‌های آگلوتیناسیون

اگر آنتی‌ژن بصورت ذرات غیرمحلول مانند باكتریها باشد، واكنش‌ را آگلوتیناسیون می‌نامند (اگر آنتی‌ژن گلبول قرمز باشد، واكنش را هماگلوتیناسیون می‌گویند)

1-5-3 واكنش‌های فلوكولاسیون

وقتی كه آنتی‌ژن بصورت ذرات كلوئیدی باشد مانند كاردیولیپین قلب گاو، واكنش را فلوكولاسیون می‌نامند.

1-6 آنتی‌بادی مونوكلونال

در سال 1984، كهلرومیلشتاین همراه با یرن بخاطر فراهم آوردن و تهیه آنتی‌بادی مونوكلونال، جایزة نوبل را دریافت نمودند. امروزه می‌دانیم كه آنتی‌سرم از كلون‌های سلولهای مختلفی بوجود می‌آید و درنتیجه كلاس، زیر كلاس یا ایزوتایپ آنتی‌بادی‌های تولید شده، ویژگیها، تیتر و میل تركیبی آنها متفاوت می‌باشد. در یك آنتی‌سرم ممكن است آنتی‌بادیهای مختلفی علیه آنتی‌ژن‌های متفاوت كه دارای خصوصیات متفاوتی هستند وجود داشته باشند.

بنابراین آنتی‌سرم، بخاطر پلی‌كلونال بودن، برای تعیین ساختمان دقیق و تفاوت آنتی‌ژنیك بین مولكولها در سطح هر اپی‌تپ مناسب نمی‌باشد. همچنین مصرف درمانی آن نیز بسیار محدود می‌باشد. برعكس، مونوكلونال آنتی‌بادی با افینتی یا میل تركیبی زیاد علیه یك شاخص آنتی‌ژنیك ایجاد می‌شود و فقط مختص آن ناحیه می‌باشد.

مونوكلونال آنتی‌بادی كه از یك كلون بدست بیاید همگی خصوصیات كاملا یكسانی داشته و می‌توان آنها را به مقدار زیاد تهیه نمود. این آنتی‌بادیها در درمان و تحقیقات به مقدار بسیار زیادی مصرف دارند.

سلولهای معمولی را نمی‌توان در خارج از محیط زنده بمدت طولانی نگهداری نمود. برای رفع این اشكال، در مطالعات ژنتیك سلولی، از چندین سال پیش از سلولهای پیوندی كه از تركیب دو نوع سلول غیرمشابه تشكیل می‌شود استفاده می‌نمودند.

برای تهیه منوكلونال آنتی‌بادی، سلولهای تولید كننده آنتی‌بادی را با سلولهای انتخابی فناناپذیری كه دائما رشد می‌كنند (توموری) به كمك مواد خاص ادغام و پیوند می‌زنند. تحت این شرایط، سلولها بطور تصادفی باهم ادغام شده كه مخلوطی از سلولهای پیوندی و غیرپیوندی حاصل می‌گردد.

سلولهای مایلوما سلولهای فناناپذیری هستند كه برای تهیه منوكلونال آنتی‌بادی بكار می‌روند. این سلولها در حقیقت یك تومور مونوكلونال پلاسما سل‌های ترشح كنندة آنتی‌بادی می‌باشند. در سال 1975، كهلرومیلشتاین گزارش دادند كه سلولی پیوندی بوجود آورده‌اند كه در محیط كشت بطور مداوم رشد می‌نماید و آنتی‌بادی با خصوصیات واحدی تولید می‌نمایند. در سال 1976 این دانشمندان نشان دادند كه با پیوند این دو نوع سلول می‌توان سلول پیوندی جدیدی ایجاد نمود كه خصوصیات هر دو سلول والد را دارا باشند.

بعنوان مثال، این سلول هیبرید، فناناپذیری را از سلول توموری مایلوما و ترشح آنتی‌ بادی اختصاصی را از سلولهای B طحال به ارث می‌برد. به این نوع سلولهای پیوندی هیبریدوما می‌گویند. برای جدا كردن سلولهای هیبریدوما، از محیط كشت انتخابی استفاده می‌شود بطوریكه فقط سلولهای هیبرید می‌توانند در این محیط رشد نمایند، ولی سلولهای مایلوما بصورت آزاد و یا باهم ادغام شده و همچنین سلولهای طحال آزاد و یا بهم پیوند شده قادر به رشد در این محیط انتخابی نبوده و بزودی از بین می‌روند. در این مرحله، سلولهای پیوندی زنده مخلوطی از سلولهایی هستند كه همگی قادر به تولید آنتی‌بادی نمی‌باشند. بعلاوه، از سلولهایی كه قادر به سنتز آنتی‌بادی هستند فقط تعداد كمی قادر به تولید آنتی‌بادی اختصاصی علیه آنتی‌ژن خاص می‌باشند.

درنتیجه، باید ابتدا با آزمایش خاص از كشت سلولی، سلولها را در دیشهای كشت 96 خانه‌ای تقسیم نموده و تحت اثر محیط كشت اختصاصی قرار می‌دهند بطوریكه فقط سلولهای هیبریدوما رشد نمایند. سپس سوپرناتانت این سلولها را برای حضور آنتی‌بادی اختصاصی آزمایش می‌نمایند. باید توجه داشت كه كشت‌های مثبت ممكن است شامل سلولهایی باشند كه هم‌ آنتی‌بادی اختصاصی و هم غیر اختصاصی ترشح می‌كنند. برای جداكردن این سلولها از یكدیگر، باید از كشت خیلی رقیق سلولی استفاده نمود. بطوریكه در هر خانه دیش بطور تقریبی، فقط یك سلول رشد نماید. درنتیجه در هر خانه دیش همه سلولهای خاصله از یك سلول پایه مشتق شده‌اند كه همگی مونوكلونال بوده و یك نوع مولكول آنتی‌بادی ترشح می‌نمایند. این مولكول‌ مونوكلونال فقط به یك محل آنتی‌ژنیك در مولكول آنتی ‌ژن متصل می‌شوند و می‌توان آنها را برای مصارف گوناگون تحقیقی، تشخیصی و درمانی بكار برد.

تشخیص بالینی آنتی‌ژن‌های محلول بصورت بسیار دقیق، تشخیص باكتریها، ویروس‌ها و پارازیت‌های بیماریزا به‌نحو اختصاصی تشخیص آنتی‌ژن‌های سطح سلولهای متفاوت، تهیه مجموعة تستی برای مصارف آزمایشگاهی، كاربرد در تصویربرداری اختصاصی، درمان عفونت‌های میكروبی، ویروس و انگلی، درمان تومورها و استفاده در تهیه واكسن‌ها از جمله مصارف آنتی‌بادی‌های مونوكلونال می‌باشد.

منبع خبر: olum-az-90.mihanblog.com

ممکن است شما دوست داشته باشید بیشتر از نویسنده