خانه > آزمایشگاهی > واکنش مولکولی گیاهان عالی به تنش خشکی

واکنش مولکولی گیاهان عالی به تنش خشکی

گیاهان

 

حالت دهیدراسیون در گیاهان بعنوان یک واکنش حفاظتی جهت جلوگیری یا جبران خسارت های وارده به سلول ها عمل می کند. بررسی مسیر سیگنال دهی آبسزیک اسید و مسیرهای القا شونده در گیاه آرابیدوپسیس سهم بسزایی در شناخت مولکولی واکنش گیاهان در مقابل دهیدراسیون داشته است. آب در تمام فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاهان نقش محوری دارد. وضعیت آب در گیاه به وسیله اندازه گیری محتوی پتانسیل و محتوی نسبی آب توصیف می شود. اگر تعادل آب در گیاه به هم بخورد، گیاه وارد مرحله کم آبی شده و دچار تنش آبی می شود که اصطلاحا به آن خشکی می گویند. حرکت مولکول های آب بوسیله شیب پتانسیل آبی در غشای پلاسمایی اندازه گیری می شود که خود تحت تاثیر غلظت مولکول های داخل و خارج سلول قرار دارد.
سلولهای تمام جانداران گیرنده ها، فرستنده ها و تنظیم کننده هایی دارند که به آنها امکان پاسخ و سازگاری در مقابل تغییرات میزان آب را می دهد. دستگاه پاسخ سلولی شامل مواد انتقال دهنده محلول هایی مانند آکواپورین ها، فعال کننده های رونویسی، آنزیم های سنتز کننده محلول های سازگار، تخریب کننده های اکسیژن فعال و پروتئین های محافظ می باشد.
دو مکانیزم عمده برای محدود کردن صدمات دهیدراسیون وجود دارد:
ü      سنتز مولکولهای محافظ در مرحله دهیدراسیون جهت جلوگیری از صدمه
ü      فعال شدن مکانیزم های جبرانی در طی جذب مجدد آب جهت خنثی سازی و جبران صدمات وارده
گونه های گیاهی و سیستم های آزمایشی مورد استفاده در مطالعات مولکولی
واکنش های مولکولی گیاهان عالی در برابر تنش آبی در سیستم ژنتیکی گیاه مدل آرابیدوپسیس، گیاهان بیابانی متحمل به خشکی و در برخی گیاهان اهلی مانند درختان بررسی شده است.
همچنین تحقیقات روی سلول های محافظ در آرابیدوپسیس در زمینه شناخت مولکول های عامل سیگنال دهی تنش آبی موثر بوده است. سلولهای محافظ ابزاری برای شناسایی پیام دهنده های ویژه کلسیمی هستند. اینها پیام دهندگان ثانویه ای هستند که میزان کلسیم، سیگنال دهی فسفوریلاسیون، کانال های یونی ویژه و ترانسپورترها و نیز تشخیص زمان بسته شدن روزنه ها تحت اثر القایی آبسزیک اسید را تنظیم می کند.
بر خلاف آرابیدوپسیس، بذرها و گروه کوچکی از گیاهان آوندی معروف به گیاهان بیابانی قادر به تحمل تلفات آبی بوده و تا زمان فراهم شدن مجدد آب برای رشد در حالت خواب ناشی از خشکی بسر می برند. گیاهان بیابانی مانند Craterostigma plantagineum در تمام بافت ها از جمله بافت کالوس تحمل به خشکی را نشان می دهند.

آبسزیک اسید (ABA)
دهیدراسیون در گیاهان منجر به افزایش میزان ABA می شود، که خود سبب القای بیان ژنهای چندگانه مسئول دفاع در مقابل اثرات سوء کم آبی می گردد.  ABA سبب بسته شدن روزنه ها می شود و بنابراین تلفات آب در جریان تنفس را کاهش می دهد. مسیر بیوسنتزی ABA یک شاخه فرعی از مسیر کاروتنوئیدی بوده و بسیاری از آنزیمهای مسیر بیوسنتزی ABA، بر اثر وقوع دهیدراسیون تنظیم می شوند.
از تیمار مصنوعی گیاه با ABA برای شبیه سازی نحوه پاسخ به دهیدراسیون استفاده شده است. جستجو برای موتانت ها از طریق تست های جوانه زنی بذر یا در میان گیاهانی که به دهیدراسیون خفیف متحمل هستند، منجر به شناسایی موتانت هایی برای ABA از جمله موتانت های بیوسنتز ABA، موتانت های بسیار حساس ABA و موتانت های غیر حساس ABA شده است. کلونینگ ژنهای متناظر با این موتانت ها باعث شناسایی یک سری ترکیبات پیام دهنده وجود ABA شده است.
احساس تنش آبی
کم آبی خیلی سریع، قبل از بروز علائمی مانند پژمردگی یا کاهش معنی دار مقدار نسبی آب توسط گیاه احساس می شود.  در مسیرهای سیگنال دهی کلاسیک، محرکهای محیطی توسط مولکول های گیرنده حس می شوند. در مورد کم آبی در گیاهان، اگر حالت عکس العمل بین گیرنده و لیگاند وجود داشته باشد هنوز معلوم نیست. در باکتریها و برخی یوکاریوت ها مانند مخمر گونه های بسیار سازگاری وجود دارد که دارای حسگرها، انتقال دهنده ها و تنظیم کننده هایی هستند که به آنها امکان کاهش عواقب کم آبی را می دهند.
هیستیدین کینازها
هیستیدین کینازها تغییرات محیطی را حس کرده و سبب اتوفسفریلاسیون یک زنجیره هیستیدین و انتقال فسفات به زنجیره آسپارتیک موجود در مولکول گیرنده می شوند. یک مولکول هیستیدین کیناز موسوم به Sln1 که بعنوان حسگر عمل می کند در مخمر شناسایی شده است. هیستیدین کینازها در گیاهان بعنوان گیرنده برای هورمون های اتیلن و سیتوکنین عمل می کنند. هیستیدین کیناز AtHK1 در آرابیدوپسیس در واکنش به دهیدراسیون دخالت دارند. AtHK1 قادر به واکنش با مسیر پروتئین کیناز شبه میتوژنیک (MAP) مخمر در فرودست Sln1 و فعال کردن آن می باشد.
نقش کینازها و فسفاتازها در واکنش به کم آبی
علاوه بر اثرات متقابل گیرنده-لیگاند و پروتئین-DNA، تغییر پروتئین ها نیز از دیگر مکانیسم های کنترل تنش می باشد. فسفریلاسیون مکانیسمی برای تغییرات پس از ترجمه است که فعالیت فاکتورهای متصل شونده به DNA و گروهی از مولکول های حد واسط را تغییر می دهد. درک اختصاصی بودن این واکنش ها برای مقابله با تنش مشکل است، زیرا یوکاریوت ها دارای تعداد زیادی ژن هستند که آنزیم های فسفریله و دفسفریله کننده را رمز می کنند. ژنوم آرابیدوپسیس حدود 120 پروتئین فسفاتاز و 90 MAP کیناز را رمز میکند.
سیستم سیگنال دهی MAP کیناز
اولین مرحله انتقال سیگنال وجود تنش کم آبی در سلول های گیاهی، با دخالت مسیرهای MAP کیناز صورت می گیرد. تغییر در سیالیت غشای پلاسمایی سبب تغییر ساختاری در گیرنده ای می شود که در فعال کردن کیناز فرودستی نقش دارد. در یونجه MAP کیناز فعال شده بر اثر تنش SAMK است که بوسیله تماس، سرما و دهیدراسیون فعال می شود. این کیناز توسط ABA فعال نمی شود، بنابراین در مسیری مستقل از ABA و یا در مسیرهای فرادستی عمل می کند. کاهش سیالیت غشای پلاسمایی عامل تحریک کننده برای فعال شدن SAMK است. در آرابیدوپسیس میزان MAP کینازهای ATMPK4 و ATMPK6 و mRNA های متناظر آنها، پس از وقوع تنش بدون تغییر می ماند ولی فعالیت این آنزیم ها تحت تاثیر تنش دهیدراسیون به سرعت افزایش می یابد. بنابراین مسیر سیگنال دهی MAP کیناز نقش مهمی در واکنش به تنش دهیدراسیون در سطح مولکولی ایفا می کند.
فسفاتازها
علاوه بر کینازها، فسفاتازها نیز جزو عوامل تغییر دهنده ضروری در زنجیره های تنظیمی تنش هستند. نقش فسفاتازها در انتقال سیگنال تنش دهیدراسیون، با استفاده از موتانت های غیر حساس به ABA در آرابیدوپسیس (abi1, abi2) روشن شده است. این موتانت ها فنوتیپ های چندگانه ای از خود بروز می دهند که بر خواب بذر، تنظیم باز و بسته شدن روزنه ها و انتقال سیگنال در طی تنش آبی، تاثیر می گذارند. هر دو ژن موتانت، پروتئین فسفاتازهای هومولوگی )تیپ 2C (Ser/Thr را رمز می کنند که متحمل جایگزینی اسید آمینه مشابهی در موقعیت متناظر شده اند. این امر موجب کاهش فعالیت فسفاتازها و تولید فنوتیپ نول غالب می شود. در فنوتیپ حامل آلل های بازدارنده نول درون ژنی (abi1-1, abi2-1)، خواب بذر طولانی تر و حساسیت (وابسته به ABA) به توقف جوانه زنی و بسته شدن روزنه ها بیشتر است. بنابراین ABI1 و ABI2 بعنوان تنظیم کننده های منفی در مسیر انتقال سیگنال ABA عمل می کنند.
مقایسه نتایج حاصل از تحقیقات در زمینه MAP کینازها و فسفاتازها این فرضیه را پیشنهاد می کند که MAP کینازها سیگنال هایی صادر می کنند که متابولیسم سلولی را در جهت سنتز ترکیبات تقلیل دهنده و رفع کننده اثر تنش کم آبی هدایت می کند، و فسفاتازها این واکنش به تنش را سرکوب می کنند.
سیگنال دهی کلسیم
در غلظت های سیتوزولی کلسیم، تغییر متناوب غلظت آن مرحله مهمی برای فعال سازی زنجیره سیگنال دهی ویژه ای است که نحوه واکنش فیزیولوژیکی فرودست را تعیین می کند. مدت زمان، شدت و محل تغییر غلظت یونهای کلسیم در سلول، عامل تعیین کننده اختصاصی بودن آن است. تغییر در سیالیت غشای سلولی سبب تغییر فعالیت کانالهای یونی کلسیم و بدنبال آن تغییر غلظت یون کلسیم در سیتوزول می شود. افزایش غلظت یون کلسیم در سیتوزول یکی از واکنشهای اولیه به تنش خشکی می باشد. تناوب تشکیل یونهای موقت کلسیم، در باز و بسته شدن روزنه ها نقش دارد. کینازهای شبه کالمودولین وابسته به یون کلسیم (CDPK) گروهی از پروتئین های متصل شونده به یون کلسیم هستند که نقش آنها ترکیب مولکول متصل شونده به کلسیم با یک بخش کینازی است. بعضی از این CDPKها تحت تاثیر تنش دهیدراسیون تحریک می شوند.
پروتئین های هتروتری مری G
پروتئین های هتروتری مری G از سه زیر واحد Gα، Gβ و Gγ تشکیل شده اند. این پروتئین ها با بخش گیرنده متصل به لیگاند در غشای سیتوزولی واکنش نشان داده و یک مولکول GTP واقع بر Gα، جایگزین یک نوکلئوتید GDP می شود. سپس پروتئین به زیرواحد منومری α و دیمر βγ شکسته می شود، این دو جزء باعث فعال شدن مولکول های فرودست نظیر فسفو لیپاز C یا D می شوند. سیستم سیگنال دهی ABA در سلول های محافظ نیاز به پروتئین G دارد. در موتانت های آرابیدوپسیس حامل آلل Gα (GPA1)، ABA نمی تواند از بسته شدن روزنه ها جلوگیری کند.
سیگنال دهی فسفو لیپیدی
فعال شدن فسفولیپاز تولید اسید فسفاتیدیک می کند که بعنوان یک مولکول پیامبر ثانویه جهت فعال سازی اهداف فرودست عمل می کند. سیگنال اسید فسفاتیدیک بوسیله دو مسیر که فسفولیپاز C (PLC) و D (PLD) در آنها شرکت دارند ایجاد می شود. PLD سبب شکسته شدن فسفولیپیدها به گروهی با سر قطبی و نیز اسید فسفاتیدیک می شود. تنش کم آبی منجر به یک واکنش در دو سطح فعالیت آنزیم PLD و رونویسی از ژن PLD می شود. فعالیت این آنزیم توسط ABA القا نمی شود. نشان دهنده این است که سیگنال ABA یا از طریق مسیر دیگری اجرا می شود یا اینکه در فرودست تر وارد مسیر سیگنال دهی فسفولیپیدی می شود.
مسیر دیگر سیگنال دهی فسفولیپیدی که در واکنش به تنش نقش دارد، مسیر فسفولیپاز C (PLC) است. وظیفه PLC تبدیل فسفاتیدیل اینوزیتول 4،5- بی فسفات به اینوزیتول 1،4،5- تری فسفات و دی اسیل گلیسیرول (DAG) می باشد. اینوزیتول 1،4،5- تری فسفات باعث آزاد شدن کلسیم در سیوزول می شود، در حالی که دی اسیل گلیسیرول توسط DAG کیناز تبدیل به پیامبر ثانویه ای مانند اسید فسفاتیدیک می شود. PLC عامل اصلی تولید اسید فسفاتیدیک بلافاصله پس از وقوع تنش اسمزی می باشد. PLC مسیر مستقل از ABA را نیز فعال می کند زیرا بازدارنده های PLC از بیان ژنهای هدف که توسط تنش دهیدراسیون و نه ABA القا می شوند جلوگیری می کند.

کنترل تنش از طریق رونویسی
یکی از نقش های زنجیره انتقال سیگنال دهیدراسیون، فعال شده مجموعه ای از فاکتورهای رونویسی است که هرکدام یک سری از ژنهای هدف مانند ژنهای لازم برای سنتز مولکولهای حفاظتی را فعال می کنند. تنش دهیدراسیون سبب القای بیان شدید چندین ژن از جمله مهمترین آنها که ژن ”وافر در اواخر دوره جنین زایی (lea)“ می باشد. برای بررسی نحوه بیان ژنهای القا شونده توسط تنش دهیدراسیون ناحیه پروموتر اهمیت زیادی دارد.
عنصر پاسخ به ABA
عنصر پروموتری عامل بیان پاسخ به ABA و تنش دهیدراسیون اولین بار در ژن lea برنج شناسایی شد. عنصر پاسخ به ABA (ABRE) دارای توالی مرکزی PyACGTGGC است و یکی از زیر گروه های عناصر جعبه G می باشد. چندین فاکتور رونویسی bZIP که به گروه A bZIPها تقسیم بندی شده اند در سیستم سیگنال دهی ABA آرابیدوپسیس نقش دارند. این دسته از پروتئین ها را به اصطلاح “ فاکتورهای متصل شونده به عنصر پاسخ به ABA (ABF)” یا “پروتئین های متصل شونده به عنصر پاسخ به ABA (AREB)”می گویند. علاوه بر ABREها عناصر دیگری معروف به عناصر جفت شونده (CE) به عنوان عناصر پروموتری تنظیم کننده سیس شناسایی شده اند که در بیان ژن با واسطه گری ABA نقش دارند.
عنصر پاسخ به دهیدراسیون
بررسی مناطق پروموتری سایر ژنهای القا شونده بر اثر دهیدراسیون به کشف عنصر پاسخ به دهیدراسیون (DRE) انجامید. این توالی که به تکرار C (CRT) معروف است، در پروموتر ژنهای عامل واکنش به تنش سرما شناسایی شده است. فاکتورهای متصل شونده به CRT/DRE در مخمر شامل CBF و DREB هستند که مشخصه بارز آنها وجود حوزه AP2 می باشد. این حوزه یک توالی 60 اسید آمینه ای متصل شونده به DNA است که در فرآورده ژن “ هویت اندام گل (APETALA2)” دیده شده است. CBF1، CBF2 و CBF3 در سطح رونویسی فقط بوسیله سرما القا می شوند. اما CBF4 بوسیله دهیدراسیون و ABA القا می شود.
حوزه SAP
با نقشه یابی پروموتر یکی از ژنهای شبه lea که توسط دهیدراسیون القا می شود (CDeT27-45) وجود یک عنصر جدید دیگر برای بیان ژن در هنگام بروز تنش ABA ضروری است. با استفاده از روش همسانه سازی منوهیبریدی مخمر، ژن رمز کننده پروتئین حوزه SAP (CpR18) جدا شد. حوزه SAP یک حوزه متصل شونده به DNA است که می تواند به مناطق ضمیمه ای ماتریکس متصل شود. این مناطق بر خلاف پروموتر (CDeT27-45) نسبتا غنی از AT است، بنابراین پایانه C زینک فینگر در پروتئین CpR18 پروموتر CDeT27-45 را شناسایی کرده و به آن متصل می شود. حوزهSAP  برای دسترسی سایر فاکتورهای رونویسی به پروموتر CDeT27-45 که نقش آنها تنظیم رونویسی از ژن CDeT27-45 ضروری می باشد.
حوزه های Myb و مارپیچ-حلقه-مارپیچ
انواع مختلفی از فاکتورهای رونویسی Myb توسط تنش دهیدراسیون القا می شوند. ژن AtMyb2 در آرابیدوپسیس بر اثر تنش دهیدراسیون، شوری و ABA القا می شوند. AtMyb2 به پروموتر ژن عامل واکنش به دهیدراسیون (rd22) متصل می شوند. همچنین فاکتور رونویسی مارپیچ-حلقه-مارپیچ القا شونده توسط ABA (AtMYC2) به پروموتر ژن rd22 متصل می شود. بیان فوق العاده این ژنها منجر به حساسیت شدید به ABA و افزایش بیان ژن rd22 می گردد. بنابراین هر دو ژن AtMyb2 و AtMYC2 نقش مهمی در بیان ژن در واکنش به کم آبی دارند.
پروتئین های جور حوزه
انواع پروتئین های زیپر لوسین- جور حوزه (HD-Zip) بر اثر برخی تنش ها از جمله دهیدراسیون القا می شوند. در آرابیدوپسیس رونویسی القایی از ژنهای ATHB-6 و ATHB-7 بر اثر دهیدراسیون کاملا وابسته به ABA می باشد زیرا هیچگونه mRNAیی در موتانت بیوسنتزی ABA وجود ندارد. در C. Plantagineum ژنهای رمز کننده دو پروتئین HD-Zip موسوم به CPHB-1 و CPHB-2 توسط دهیدراسیون القا می شوند.  این پروتئین ها در آزمایش دابل هیبریدی مخمر، قادر به تشکیل همو و هترودیمرها هستند. این نشان دهنده وجود دو مسیر القا شونده توسط ABA است، یکی توسط ABA و دیگری مستقل از آن. واکنش متقابل دابل هیبریدی مخمر نشان می دهد که این مسیرهای مستقل از ABA و وابسته به از طریق پروتئین های HD-Zip با هم در ارتباط هستند.
پروتئین های فعال شونده بر اثر دهیدراسیون
آخرین مرحله در زنجیره سیگنال دهی تنش دهیدراسیون، فعال شدن ژنهای مسوول سنتز ترکیبات دخیل در حفظ ساختارهای سلولی در برابر اثرات مخرب تنش دهیدراسیون است. برای این منظور سه استراتژی در گیاهان متحمل به خشکی وجود دارد:
ü       تجمع محلول های سازگار
ü       ژنهای رمز کننده پروتئین های حفاظتی
ü       واسطه های اکسیژن فعال
تجمع محلول های سازگار
دهیدراسیون منجر به تجمع برخی مواد محلول سازگار می شود. مواد محلول سازگار شامل بتائین ها، اسیدهای آمینه، پلی اول ها، و قندها می باشد. این ترکیبات از طریق افزایش تعداد ذرات در محلول، به نگهداری فشار تورگر در طی دهیدراسیون کمک می کنند. همچنین می توانند میزان سیالیت غشا را حفظ کرده و پروتئین ها را در حالت دهیدراته نگه داشته و سبب پایداری ساختار آنها شوند. در نهایت قندها جایگزین مولکول های آب شده و سیتوزول را به حالت شیشه ای در می آورند. تحمل به دهیدراسیون و خشکی با مقدار بالای الیگوساکاریدها و دی ساکاریدهای احیاء کننده در ارتباط است.
ژنهای رمز کننده پروتئین های حفاظتی
بذور بسیاری از گونه های گیاهی قادر به حفظ بقای طولانی مدت خود در شرایط بدون آب هستند. این امر مستلزم حفظ بخش های زنده جنین است. تعدادی از ژنهای جدا شده از گیاهان بیابانی با ژنهای بیان شونده در بذور در حال رسیدن همولوژی بالایی دارند. این نشان دهنده شباهت نسبی مکانیزم های تحمل به خشکی در موقعیت های مختلف است. مانند ژنهای lea که بیان این ژنها با تنش دهیدراسیون در ارتباط است. به محض وقوع تنش دهیدراسیون، رونوشت های متناظر با این ژنها هم در بذور غیر فعال (خواب) و هم در بافت های رویشی گیاهان متحمل و حساس به خشکی به مقدار زیاد انباشت می شود.
واسطه های اکسیژن فعال (ROI)
یکی از پیامد های تنش دهیدراسیون، افزایش غلظت واسطه های اکسیژن فعال است. واسطه های اکسیژن فعال سبب خسارت غیر قابل جبران به غشاء ها، پروتئین ها، DNA و RNA می شود. البته غلظت های پایین آنها برای سلول ضروری است، زیرا برخی مولکول های ROI در سیستم سیگنال دهی در برابر تنش ضروری می باشند. انباشت ROI توسط سیستم های آنتی اکسیدانت کنترل می شود که شامل عوامل تخریب کننده آنزیمی نظیر سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیدازها و کاتالازها می باشد. رفع سمیت آلدهیدها، مکانیزم دفاعی موثری در برابر خسارت ناشی از دهیدراسیون به واسطه تولید ROI می باشد.
نتیجه گیری
بررسی بیان افتراقی ژن ها و بررسی نحوه الگوی فراگیر بیان ژنها با استفاده از روش های ریز آرایه و درشت آرایه منجر به شناسایی طیف وسیعی از رونوشت ها شده است که بیان آنها در پاسخ به تنش خشکی تغییر می کند. این بررسی ها نشان داد که چند صد ژن تحت تاثیر تنش خشکی قرار می گیرند و فرآورده های آنها می توانند در مسیرهای بیوشیمیایی وارد شوند.
به دو دلیل ارائه یک راه حل ساده برای شناسایی این ژنها امکانپذیر نیست:
تحمل به خشکی یک خصوصیت پلی ژنیک است
گیاهان بیابانی فاقد ژنوم دیپلوئید هستند.

منبع:
plant-biotechnology.blogf