خانه > آزمایشگاهی > پرسی پیتاسیون روش الکتروفورز

پرسی پیتاسیون روش الکتروفورز

از زماني كه معلوم شد روش هاي ايمونوديفوزيون ساده يا روش پرسي پيتاسيون به تنهايي قادر نيستند مخلوط هاي بسيار پيچيده پروتئيني را از هم تفكيك كنند ، روش الكتروفورز وارد عرصه آزمايشگاه باليني شد، بدين معني كه با به كارگيري ولتاژ در بستري كه از جنس كاغذ يا آگارز يا ورقه هاي استات سلولز است، امكان تفكيك مخلوط هاي پيچيده پروتئئني فراهم گرديد.
همانطور كه مي دانيم در اصل، حركت ملكول ها در ميدان الكتريكي به شارژ سطحي هر يك وابسته است، در واقع pH محيط، نقش مهمي در تعيين بار الكتريكي آن ملكول ها دارد. در پي يونيزه شدن ملكول هاي پروتييني، آن ها بر حسب اين كه بار سطحي مثبت يا منفي داشته باشند به طرف قطب منفي يا مثبت به حركت در مي آيند.

اين گونه تفكيك شدن هاي مخلوط پيچيده پروتييني، مبنايي برابداع و گسترش روش هاي ايمونولوژيكي گرديد .روش هاي مذكور در زمينه ملكول هاي تفكيك شده، براي شاخص بندي مناسب، به قدرت تجزيه و تحليل بالا نياز دارند.از اين رو روش الكتروفورز پروتيين، براي تفكيك مخلوطي از ملكول ها، به انواع گوناگوني از روش هاي ذيل تعميم پيدا كرد:
ايمونوالكتروفورز
ايمونوفيكساسيون الكتروفورز(IFE)
و غيره

الكتروفورز
در روش مذكور، پروتيين هاي سرم در بستر انتخابي به شكل 5 باند به نام هاي: آلبومين، آلفا يك، آلفا دو، بتا، و گاما ،كه نمايي از وضعيت حركتي آن ها است، ديده ميشوند(شكل 5-11) . البته تركيبات تشكيل دهنده هر يك از اين باندها در تابلو 1-11ص 236 نشان داده شده است.
در ميدان الكتريكي ايجاد شده در بستر ، علاوه بر بار الكتريكي سطح ملكول هاي پروتييني ، عواملي ديگري نظيراندازه، خصوصيات بستر و بافر(pH) مصرفي و دما. بر حركت ملكول هاي پروتييني اثر مي گذارند.

پس از رنگ آميزي باندهاي پروتييني سرم، هر از يك آن ها را مي توان با استفاده از دانسيتومتر به شكل منحني هايي داراي قله مشخص نشان داد(شكل 5-11). بدين وسيله مي توان مقدار يا درصد هر يك از اين بخش ها را مشخص كرد. هر چه شدت رنگ باند بيشتر باشد ارتفاع قله بيشتراست كه اين خود بيانگر غلظت بالاي آن باند خواهد بود.
با استفاده از اين روش الكتروفورزي كه به نام الكتروفورز منطقه اي نيز معروف است، مي توان ملكول هاي پروتييني را رديابي و تعيين مقدار كرد. پس از انجام روش مذكور براي رديابي تركيبات مونوكلونال در سرم يا تعيين نوع آن ها، از روش ايمونوالكتروفورز يا ايمونوفيكساسيون استفاده مي شود.


روش كار
كليات
معمولا براي شروع كار سرم، ادرار، يا مايع مغزي نخاعي فرد و نيز يك نمونه استاندار مناسب را در يك طرف سطح بستر( استات سلولز يا ژل آگارز) قرار مي دهند ، سپس براي تفكيك ملكول هاي پروتييني، جريان الكتريكي را برقرار مي كنند. در اين روش به دليل قليايي بودن pH بافر مصرفي، پروتيين هاي سرم بار منفي پيدا كرده و در ميدان الكتريكي ايجاد شده به طرف قطب مثبت حركت مي كنند و به باندهاي مجزايي تبديل مي شوند.. پس از رنگ آميزي، با مطالعه باند ها ومحل استقرار هر يك، مي توان به خصوصيات يك يك آن ها پي برد. ضمناً مي توان با استفاده از دانسيتومتر، باند هاي رنگ شده را اسكن و به منحني هاي داراي قله(يعني آلبومين، آلفا-يك گلوبولين، آلفا-دو گلوبولين، بتا-گلوبولين،و گاما-گلوبولين) تبديل كرد

منبع:ict.basijeng. ir