خانه > آزمایشگاهی > پرسی پیتاسیون روش هاي ايمونوديفوزيون

پرسی پیتاسیون روش هاي ايمونوديفوزيون

در ايمونوديفوزيون ملكلول هاي آنتي ژن و يا آنتي بادي طي روند انتشار ساده در داخل يك بستر انتخابي ( مثلاً داخل محيط آبكي و يا داخل ژل آگارز) به حركت در مي ايند .حال اگر عوامل ذكر شده اختصاصي هم باشند در محل برخورد كمپلكسي تشكيل مي شود كه غير محلول مي باشد . واكنشي كه به اين ترتيب صورت پذيرفته به واكنش ايمونوپرسي پيتاسيون و كمپلكس هاي تشكيل شده به خطوط يا ياند هاي رسوبي معروف هستند.اين باند هاي رسوبي معمولا در داخل بستر انتخابي و در محلي كه اين پديده اتفاق افتاده بدون حركت باقي مي مانند

شيوه هاي ايمونوديفوزيون را بر حسب جهت حركت و تعداد عوامل واكنش كننده به چند دسته تقسيم مي شوند از جمله:

Double immunodiffusion
Radial immunodiffusion

حال اگر روند حركت عوامل شركت كننده در واكنش به وسيله نيروي الكتريكي افزايش يابد، ايمونوالكتروفورز شكل مي گيرد.
عوامل موثر در شكل گيري ايمونوپرسي پيتاسيون
تشكيل رسوب در داخل محلول
اتصال تصادفي آنتي ژن هاي چند ظرفيتي محلول با آنتي بادي دو ظرفيتي و اختصاصي خود منجر به تشكيل شبكه اي از كمپلكس هاي آنتي ژن-آنتي بادي در داخل محيط آبكي(محلول) مي شود .لذا هر چه اندازه اين كمپلكس ها در طول واكنش بيشتر مي شود از محلوليت آن كاسته مي شود بدين سبب آن ها بعد از مدتي در داخل محلول رسوب مي كنند. واكنش مذكور را مي توان به شكل يك منحني رسوبي نشان داد(شكل 3-11).

تشكيل رسوب در محيط نيمه جامد
مي توان با انتشار دادن آنتي ژن هاي محلول و آنتي بادي ها در محيط نيمه جامد ژل (نظير ژل آگار و يا آگارز) كمپلكس هاي آنتي ژن –آنتي بادي را به وجود آورد . آگار را از جلبك هاي دريايي استخراج مي نمايند و آگارز، نوع خالص شده ي آگار مي باشد.عوامل مختلفي نظير غلظت آنتي ژن و آنتي بادي ، اندازه ملكولي، شكل ملكولي، دما، چگالي بر شدت واكنش تاثير گذار هستند.
بعد از اين كه آنتي ژن و آنتي بادي در داخل ژل به يكديگر برخورد كردند ، اگر اختصاصي هم باشند به يكديگر متصل شده و در همان محل در منطقه تعادل(اكي والان) تشكيل رسوبي قابل رويت مي دهند .علت استفاده از آگارز خنثي بودن و شفاف بودن اين تركيب است.ُ

روش هاي Double immunodiffusion
كليات
ايمونوديفوزيون دوگانه كه نام ديگر آن اوچترلوني مي باشد روشي است نيمه كمَي كه در محيط نيمه جامد انجام مي شود و مبناي آن حركت آنتي ژن و آنتي ادي اختصاصي به طرف هم و ايجاد رسوبي ثابت و بدون حركت ناشي از تشكيل كمپلكس آنتي ژن و آنتي بادي در بستر ژلي است . به رسوب تشكيل شده خط يا باند رسوبي مي گويند(شكل 2-11).با اين روش مي توان اپي توپ آنتي ژن هاي نامعلوم را با يكديگر مقايسه كرد، بدين معني كه اگر دو آنتي ژن مصرفي از نظر اپي توپ ها با هم مشابه ويا نيمه مشابه و يا غير مشابه باشند شكل خطوط رسوبي آن ها با هم متفاوت خواهد بود.

روش كار
در اين روش در حفرات تعبيه شده در ژل مقدار معيني آنتي سرم و آنتي ژن نامعلوم ريخته مي شود .بهتر است آنتي ژن در حفرات كناري و آنتي سرم در حفره مركزي ريخته شود .در طول مدت انكوباسيون كه مي تواند 24 تا 48 ساعت باشد آنتي ژن ها و آنتي بادي ها در داخل ژل نفوذ كرده و در محل برخورد آن ها رسوب سفيد رنگ ديده مي شود

ارزيابي نتايج

اگر آنتي بادي با آنتي ژن هايي كه اپي توپ مشترك ندارند واكنش دهد، دو خط رسوبي تشکیل شده نسبت به هم به شکل علامت ضربدر دیده می شوندکه این حالت بیانگر مشابه نبودن این دو آنتی ژن نسبت به آنتی بادی مورد آزمايش است (عدم تشابه) (شكل بالا ).
اگر مثلاً Ag1 يا Ag2 در يك اپي توپ عمومي با هم مشترك باشند و آنتي بادي مورد آزمايش نيز با اين اپي توپ واكنش دهد، دو خط رسوبي تشکیل شده اصطلاحاً به حالت مهميز ديده مي شوند. اين شكل ازرسوب،صرفاً بيانگرواكنش متقاطع و وجود ارتباط سرولوژيك بين دو آنتي ژن مورد اشاره نسبت به آنتي بادي وسط است و نه يكسان بودن این آنتي ژن ها (تشابه نسبي )(شكل وسط).
اگرآنتي بادي مورد آزمايش با Ag1 و Ag2 واكنش داده باشد. فقط در فاصله ی بين حفره وسط و این حفره ها دو خط رسوبي با انتهاي به هم پيوسته، ظاهر می شود. این شکل از رسوب بيانگر حضور شاخص هاي آنتي ژني شبيه هم، در این دو آنتی ژن است (تشابه كامل آنتي ژني) (شكل پايين).
كاربرد باليني
از روش فوق مي توان براي تعيين حضور آنتي ژن ، بررسي تشابه يا عدم تشابه آنتي ژن استفاده كرد مثلا بررسي زير كلاس هاي ايمونوگلوبوليني .

Radial immunodiffusion(RID)
راديال ايمونوديفوزيون مشابه روش ايمونوديفوزيون دوگانه است يعني مبناي آن واكنش آنتي ژن و آنتي بادي در داخل ژل است با اين تفاوت كه از قبل در داخل ژل آنتي سرم اختصاصي ريخته مي شود وموقع انجام آزمايش آنتي ژن را در داخل حفراتي مي ريزند كه درژل تعبيه شده است ، با نفوذ آنتي ژن در داخل ژل، غلظت آنتي ژن به آنتي بادي به تدريج تغيير كرده و به حدي مي رسد كه نقطه اكي والان نام دارد .
در منطقه اكي والان رسوب به شكل حلقه اي سفيد رنگ ديده مي شود.لازم به ياآوري است، مجذور قطر حلقه رسوبي نسبت مستقيم با غلظت آنتي ژن مورد آزمايش دارد(شكل ذيل) بدين سبب اين روش كمَي است و با آن مي توان غلظت پروتيين هايي نظير IgG, IgA, IgG, و نيز پروتيين هايي نظير‍ C4 C3, ‍ و فاكتورB را اندازه گيري كرد .
روش كار
براي اندازه گيري اجزاي فوق، مقدار معيني از نمونه سرمي فرد بيمار را ، به همراه پروتيين استاندارد در داخل حفرات معين، در داخل ژل، مي ريزند. لازم به يادآوري است از قبل در داخل ژل آنتي سرم اختصاصي مونواسپسيفيك ريخته مي شود . مثلا اگر قرار باشد IgG فرد يا بيمار اندازه گيري شود، ژل حاوي anti IgG و اگر قرار باشد C3 فرد يا بيمار اندازه گيري شود ژل حاوي antiC3 خواهد بود.
در زمان انكوباسيون، با نفوذ نمونه مجهول (نمونه بيمار)و استاندارد (نمونه هاي كنترل) از حفرات به داخل ژل، در محل برخورد با آنتي سرم اختصاصي، كمپلكس ها در منطقه اكي والان، به شكل حلقه سفيد رنگ ديده مي شوند. قطر حلقه هاي رسوبي مربوط به نمونه مجهول و نمونه استاندارد را مي توان با خط كش و بر حسب ميلي متر اندازه گيري كرد. با داشتن قطر حلقه هاي رسوبي مربوط به نمونه استاندارد و با داشتن غلظت هر يك از آن ها مي توان منحني استاندارد رسم كرد(شكل) سپس از روي آن ها، غلظت آنتي ژن مورد نظر را اندازه گيري نمود.

كاربرد باليني
كاربرد باليني شامل:
رديابي و اندازه گيري پروتيين ها در سرم و يا ساير مايعات بدن.
اندازه گيري C3,C4, C5 هنگام افزايش عفونت.
اندازه گيري ايمونوگلوبولين ها در موارد مشكوك به هيپر يا هيپوگاما گلوبولينميا.

گر چه مبناي روش راديال ايمونوديفوزيون، اندازه گيري آنتي ژن ها به طور كمَي است، ولي مي توان با بر عكس كردن روش اجرا، آنتي بادي ها را نيز اندازه گيري كرد . بدين منظور در داخل ژل به جاي آنتي بادي، آنتي ژن ريخته مي شود.

منبع:ict.basijeng. ir