لوپ میکروب شناسی (کنترل کیفی و کالیبراسیون)

کنترل کیفی لوپ میکروب شناسی,انواع لوپ,نمودار کنترل کیفی لوپ میکروب شناسی,لوپ آزمایشگاهی چیست,کنترل کیفی در آزمایشگاه میکروب شناسی,sop میکروب شناسی,آنس آزمایشگاهی,کنترل کیفی دیسک های آنتی بیوگرام

دستورالعمل فنی لوپ:
لوپ میکروب‌شناسی از جنس‌های متفاوت ساخته می‌شود و معمول‌ترین آن‌ها پلاتین، نیکل، کروم و پلاستیک می‌باشد. به‌طورکلی لوپ باید فلزی باشد تا به‌سادگی شکل‌پذیر بوده و بر اثر سرد و گرم شدن مکرر خراب نشود. سر لوپ باید به شکل دایره پیچیده شود و در محل تماس شروع دایره و میله نباید فاصله ایجاد شود. لوپ معمولاً برای انتقال سوسپانسیون حاوی میکروب به محیط کشت به کار می‌رود، به‌نحوی‌که بتوان کلنی‌های رشد‌یافته را شمارش کرد. استفاده از لوپ استاندارد با حجم معین جهت شمارش کلنی‌های به‌دست‌آمده از کشت نمونه‌های بالینی به‌ویژه ادرار به‌منظور تشخیص عفونت واقعی ضروری است، لذا آزمایشگاه‌ها همواره باید از لوپ کالیبره جهت کشت نمونه‌های ادراری استفاده نمایند و به کمک آن تعداد کلنی‌های موجود در هر میلی‌لیتر ادرار (Cfu/ml) را محاسبه و گزارش نمایند. ماکزیمم تفاوت قابل‌قبول در شمارش کلنی‌ها با لوپ‌های متفاوت ۱۰% است.

از بین وسایل مورد استفاده در بخش میکروب شناسی لوپ میکروب شناسی از جمله ابزارهای مهم و اصلی بوده و ارزش آن همانند پی پت در آزمایشگاه بیوشیمی و سرولوژی است .بدین معنی که اگر از مقدار برداشت شده توسط لوپ محاسبه دقیق به عمل نیاید در گزارش نتایج آزمایش تاثیر زیادی خواهد داشت . لذا به سبب عدم وجود روش استاندارد جهت کالیبراسیون لوپ و نظر به اهمیت آن در این مقاله سعی شده است که راه کارهای مناسب و عملی برای کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی ارائه گردد . در بررسی انجام شده دو روش محاسبه حجم توسط روش اسپکتروفتومتری و روش استفاده از ترازو مورد ارزیابی قرار گرفته اند .

روش بررسی : در این تحقیق حجم برداشت شده توسط دو نوع لوپ مورد مصرف که تحت عنوان لوپ های تجاری در بازار موجود بوده و به عنوان لوپ ۰٫۰۱ و لوپ ۰٫۰۰۱ استفاده میشوند مورد بررسی قرار گرفت و نیز با توجه به اینکه برخی از آزمایشگاه های تشخیص پزشکی لوپ های دست ساز را که با استفاده از پیچیدن سیم به دور دسته فلزی لوپ تهیه می شوند مورد استفاده قرار می دهند این نوع لوپ ها نیز به دو روش اسپکتروفتومتری و توزین مورد ارزیابی قرار گرفتند . همچنین مقدار حجم برداشتی توسط لوپ ها به صورت تخمینی و از طریق ریاضی مورد بررسی قرار گرفت .

الف ) روش اسپکتروفتومتری : در این روش از یک ماده رنگی که دارای جذب نوری در طول موج خاص است استفاده می گردد . معمولا از ماده رنگی اوانس بلو برای این آزمایش استفاده میشود اما با توجه به کمبود و گران بودن ماده مزبور در این بررسی از متیلن بلو که از نظر اقتصادی به صرفه بوده و در اکثر آزمایشگاه ها موجود است استفاده شد .

مواد مصرفی و معرف ها شامل موارد زیر بود :

پودر متیلن بلو – الکل طبی ۹۶% ( اتانول ) – آب مقطر – لوپ های ۰٫۰۱ و ۰٫۰۰۱ و لوپ های دست ساز – لوله آزمایش – پی پت – سمپلر ۲۰ لاندا – اسپکتروفتومتر

ابتدا ۰٫۲ – ۰٫۱ گرم از پودر متیلن بلو را در حلالی که از مخلوط کردن آب مقطر و الکل ۹۶% به نسبت ۵۰ به ۵۰ تهیه شده حل می کنیم . پس از حل شدن کامل متیلن بلو در حلال مزبور ۸ لوله آزمایش انتخاب کرده در لوله اول ۲ میلی لیتر و در بقیه لوله ها ۱ میلی لیتر از حلال ساخته شده را می ریزیم . سپس مقدار ۰٫۰۲ میلی لیتر از محلول متیلن بلو را به کمک سمپلر کالیبره شده به محلول اضافه کرده و پس از مخلوط کردن ۱ میلی لیتر از محلول مزبور را به لوله دوم انتقال می دهیم و این عمل را تا لوله هشتم پی می گیریم ( رقت های سریالی ).پس از تهیه رقت های مزبور جذب نوری هر یک از لوله ها را در طول موج ۶۶۳ نانومتر قرائت کرده و ثبت می کنیم .

با توجه به کاهش تصاعدی رقت لوله ها از کاغذ لگاریتمی برای تهیه منحنی استاندارد استفاده میشود . پس از ترسیم منحنی برای کالیبره کردن لوپ ۱۵-۱۰ لوله برداشته و در هر یک از آنها ۱ میلی لیتر از حلالی که تهیه کرده بودیم می ریزیم و به کمک لوپ از محلول رنگی ( متیلن بلو ) در لوله ها وارد می کنیم . پس از خواندن جذب نوری آنها در طول موج ۶۶۳ نانومتر و به دست آوردن میانگین جذب نوری و انتقال آن بر روی منحنی مقدار حجم برداشته شده توسط لوپ به راحتی به دست می آید .

از آنجا که مقدار کلنی بر اساس CFU/ml ( colong forming unit ) گزارش می گردد اگر ۱ میلی لیتر را که برابر با ۱۰۰۰ لاندا می باشد بر حجم به دست آمده تقسیم کنیم ضریب لوپ مجهول به دست خواهد آمد.

ب ) روش توزین : در این روش ترازوی حساس با دقت ۰٫۰۰۱ گرم مورد نیاز است و از آنجا که وزن و حجم آب مقطر خالص مساوی هستند می توان به کمک لوپ از آب مقطر برداشت کرد و بر روی یک دیسک آنتی بیوگرام قرار داد و با توزین توسط ترازو مقدار حجم برداشتی را محاسبه کرد . در این روش ابتدا دیسک آنتی بیوگرام توزین می شود سپس مقدار افزایش وزن بر اثر برداشت آب مقطر توسط لوپ محاسبه می گردد . اگر این عمل را ۱۵- ۱۰ بار تکرار کرده و میانگین افزایش وزن را ثبت کنیم حجم برداشتی توسط لوپ به دست خواهد آمد.

ج ) روش محاسبه ریاضی : در این روش اگر قطر سیم مورد استفاده در ساخت لوپ را توسط میکرومتر اندازه گیری کرده و قطر داخلی حلقه لوله را توسط کولیس محاسبه کنیم حجم برداشتی از طریق محاسبه حجم استوانه به دست می آید . این روش برای محاسبه مقدار برداشتی توسط لوپ چندان دقیق نیست زیرا حجم برداشتی توسط لوپ در مقایسه با روش های استاندارد حجم بیشتری را نشان می دهد و در عمل از آنجا که کشش سطحی بافت باعث می شود مقدار کمتری از محلول در مرکز لوپ قرار گیرد میزان برداشتی نهایی کمتر خواهد بود .

نتیجه بررسی : مقایسه نتایج حاصل از بررسی ۳ روش فوق نشان می دهد که حجم برداشت شده توسط لوپ هایی که به عنوان لوپ تجاری عرضه میشوند استاندارد نیست برای مثال با لوپ تجاری ۰٫۰۰۱ مقدار برداشتی لوپ ۰٫۶ لاندا می باشد و در مورد لوپ ۰٫۰۱ مقدار برداشتی ۲٫۴ لاندا است . در نهایت ضریب لوپ ۰٫۰۰۱ برابر با ۱۶۶۶٫۶۶ و لوپ ۰٫۰۱ برابر با ۴۱۶٫۶۶ و لوپ دست ساز تقریبا معادل ۳۳۸ است که با مقادیر ادعا شده تفاوت دارند.

نتیجه گیری : با توجه به بررسی های مزبور موارد زیر پیشنهاد میشود :

۱- لوپ هایی که تحت عنوان ۰٫۰۱ و ۰٫۰۰۱ به صورت تجاری به فروش می رسند استاندارد نبوده و هر آزمایشگاه می باید نسبت به کالیبراسیون و تععین ضریب دقیق لوپ مصرفی اقدام کند.

۲- در صورت عدم کالیبراسیون لوپ مصرفی شمارش کلنی در کشت ادرار به صورت تخمینی گزارش شود. ( کمتر از ۱۰۰۰ یا ۱۰۰۰۰-۱۰۰۰ یا بیشتر از ۱۰۰۰۰ )

۳- برای کالیبراسیون لوپ به علت مجهز نبودن اکثر آزمایشگاه ها به ترازوی حساس روش اسپکتروفتومتری پیشنهاد می شود .

۴- حتی المقدور سعی گردد تا لوپ ها به صورت پلاستیکی و یک بار مصرف تهیه شود .

ج) روش رنگ‌سنجی:

  • مقایسه حجم منتقله توسط لوپ با سمپلر استاندارد و وارسی‌شده به روش رنگ‌سنجی: در پنج لوله تمیز و خشک ml3 آب مقطر ریخته و با لوپ مجهول از یک محلول رنگی با رعایت نکات ذکرشده، رنگ موردنظر را به هر یک از لوله‌ها اضافه می‌کنیم. با همین روش نیز با کمک سمپلر هم‌حجم لوپ در پنج لوله حاوی ml3 آب مقطر محلول رنگی فوق را اضافه می‌کنیم. حال با اندازه‌گیری میانگین جذب نوری آن‌ها در طول‌موج مشخص (مثلاً nm630 برای رنگ سبز خوراکی) و استفاده از رابطه زیر حجم لوپ را به دست می‌آوریم.

میانگین جذب لوپ / حجم لوپ= میانگین جذب سمپلر / حجم سمپلر

  • تعیین حجم لوپ با استفاده از ماده رنگی اوانس‌بلو
  • mg20 از پودر اوانس‌بلو تجاری را در ml 10 آب مقطر حل می‌کنیم. غلظت این محلول۱۰۰/gr2/0 است.
  • ۶ لوله آزمایش انتخاب کرده، در لوله اول ml2 و در هر یک از لوله‌های باقیمانده ml1 آب مقطر می‌ریزیم. ۲۰ لاندا از محلول ذخیره اولیه برداشته و در لوله اول حل می‌کنیم و سپس ml1 از لوله اول برداشته و به لوله دوم می‌ریزیم و به همین ترتیب تا لوله ۶ پیش می‌رویم (پاساژ می‌دهیم) و cc1 از لوله ۶ دور می‌ریزیم، سپس OD یا جذب نوری هر ۶ لوله را در طول‌موج nm620 با اسپکتروفتومتر کالیبره می‌خوانیم.
  • جهت تعیین حجم لوپ موردبررسی، به ازای هر محلول ذخیره (۶ محلول) در ۱۰ لوله آزمایش آب مقطر بریزید.( در مجموع ۶۰ لوله آب مقطر).
  • لوپ تحت‌ کنترل را به‌طور کاملاً عمودی وارد محلول ذخیره مربوطه نموده و در لوله آزمایش اول فرو برید. سپس لوپ را (بدون سوزاندن) با کاغذ خشک‌کن کاملاً خشک کنید و این عمل را برای ۱۰ لوله انجام دهید و جذب هر لوله را بعد از مخلوط کردن در طول‌موج nm620 بخوانید (مجموعاً ۶۰ خوانش).
  • میانگین نتایج را به تفکیک محلول ذخیره به دست آورید.
  • بر روی کاغذ میلی‌متری نموداری ترسیم نمایید که محور افقی نشانگر رقت‌های تهیه‌شده و محور عمودی نمایانگر جذب نوری هر رقت باشد.
  • با قرار دادن میانگین جذب هر رقت (که به‌وسیله لوپ کنترلی به‌دست‌آمده) روی محور عمودی می‌توان ضریب رقت لوپ کنترلی را روی محور افقی به دست آورد.
  • تعیین حجم لوپ با متیلن‌بلو: با توجه به کمبود و گران بودن ماده اوانس‌بلو می‌توان از متیلن‌بلو که از نظر اقتصادی مقرون‌به‌صرفه بوده و در همه آزمایش‌ها در دسترس است، استفاده نمود. اساس کار شبیه روش اوانس‌بلو است ولی با دو تفاوت:

۱) طول‌موج خوانش به‌جای ۶۲۰ نانومتر، ۶۶۳ نانومتر می‌باشد.

۲) به‌جای استفاده از آب مقطر برای تهیه محلول ذخیره اولیه و سریال دایلوشن، از آب مقطر و الکل ۹۶% به نسبت ۵۰ به ۵۰ استفاده می‌کنیم؛ یعنی برای ساختن محلول ذخیره اولیه mg20 پودر متیلن‌بلو را در ۱۰ میلی‌لیتر آب مقطر و الکل (cc5 آب مقطر و cc5 الکل) حل می‌کنیم و در ۶ لوله هم از همین محلول استفاده می‌کنیم.

جهت تعداد کلنی در هر میلی‌لیتر ادرار باید تعداد کلنی به دست آمده از کشت را در عکس ضریب رقت لوپ ضرب نمود، مثلاً اگر ضریب رقت لوپ ۱۰۰/۱ بود و تعداد کلنی پلیت ۵۰۰ عدد باشد نتیجه را به‌صورت cfu/ml 50000 گزارش می‌کنند.

کنترل کیفی عدم دقت لوپ:

در ۱۰ لوله تمیز و خشک ۳ میلی‌لیتر آب خالص ریخته و با لوپ موردنظر به هرکدام رنگ اضافه می‌کنیم (دقت شود که فقط حلقه لوپ وارد رنگ و آب شود و به‌صورت عمودی گرفته شود) و با طول‌موج موردنظر برای رنگ موردنظر، جذب نوری لوله‌ها را اندازه گرفته و c.v را محاسبه می‌کنیم. عدم دقت مجاز برای لوپ ۵% می‌باشد. خطای توتال: = %bias+% c.v total error

ماکزیمم خطای توتال مجاز لوپ از ۱۰-۷% می‌باشد.

استریل شدن لوپ:

جهت کنترل استریل شدن لوپ پس از قرار دادن شعله، لوپ را با سوسپانسیون میکروبی تماس داده و پس از قرار دادن در شعله استریل می‌کنیم، سپس لوپ را سرد کرده و در محیط غنی کشیده و روز بعد رشد یا عدم رشد باکتری‌ها را مشاهده می‌کنیم.

تعمیرات و نگهداری:

  • به‌محض مشاهده شکاف یا تغییر قطر سیم لوپ، باید آن را تعویض کرد.
  • بهتر است از لوپ استاندارد و یک‌بار مصرف پلاستیکی استفاده نمود.

ایمنی:

در موقع سترون کردن لوپ باید از قرار دادن سریع لوپ روی شعله به علت ایجاد آئروسل خودداری کرد و ابتدا آن به قسمت قاعده شعله (که پائین‌ترین درجه حرارت را دارد) وارد شده و تدریجاً به نوک شعله انتقال یابد.

 

 

ممکن است شما دوست داشته باشید بیشتر از نویسنده