معماری

آزمايش‌های بيوشيميايي اسپرم

آزمايش‌های بيوشيميايي اسپرم:

اسپرم‌هاي غيرطبيعي دو منشأ دارند:

  • اسپرم هایی كه توليدشان در بيضه‌ها غيرنرمال است.
  • اسپرم‌هايي كه توليد طبيعي دارند اما به دليل اختلالات اپيديديم و يا ترشحات غيرطبيعي غدد ضميمه‌اي دچار اختلال مي‌شوند.

با بررسي ترشحات غدد ضميمه‌اي مي‌توان فعاليت آنها را به شرح زير ارزيابي نمود:

  • اندازه‌گيري اسيد سيتريك، روي، گاماگلوتاميل ترانس پپتيداز و اسيدفسفاتاز براي ارزيابي فعاليت ترشحي پروستات. (روش اندازه‌گيري روي در بخش 1-4-3 آمده است.)
  • اندازه‌گيري فروكتوز و پروستاگلاندين‌ها براي بررسي وزيكول‌هاي سمينال.( روش اندازه‌گيري فروكتوز در بخش 2-4-3 شرح داده شده است.)
  • اندازه‌گيري L كارني‌تين آزاد، گليسروفسفوكولين (GPC) و α گلوكوزيداز براي بررسي فعاليت ترشحي در پلاسماي مني. دو ايزوفورم از اين آنزيم وجود دارد: نوع ماژور كه خنثي است و منشأ آن عمدتاً اپيديديم می‌باشد و نوع مينور كه اسيدي است و منشأ آن عمدتاً پروستات است. روش اندازه گيري α گلوكوزيداز خنثي در بخش 3-4-3 آمده است.

عفونت‌ها ممكن است باعث كاهش ميزان ترشح اين ماركرها شوند. گاه آسيب آنها برگشت‌ ناپذير است به نحوي كه حتي پس از درمان نيز ميزان اين ترشحات پايين مي‌ماند.

نكته: مقدار كل ماركرهاي غدد ضميمه‌اي در مايع مني منعكس كننده كل فعاليت ترشحي اين غدد است. براي بدست آوردن آنها مي‌توان غلظت اين ماركرها را در حجم مايع مني ضرب نمود.

1-4-3 اندازه‌گيري روي در پلاسماي سمينال:

1-1-4-3 مقدمه: براي اندازه‌گيري روي سرم به روش اسپكتروفتومتري كيت‌هاي تجاري موجود است. روشي كه در این جا توضيح داده مي‌شود بر اساس متد Johnson & Eliasson است و حساسيتي برابر mol/Lµ 4 دارد. حجم مايع مني و محلول‌ها را مي‌توان بر اساس اين كه از كووت1 ml يا ml3 استفاده شود تغيير داد.

2-1-4-3 اصول كار:

تركيب

(5-bromo-2-pyridilazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-phenol(5-Br-PAPS)-2

با روي ايجاد كمپلكسي رنگي مي كند كه در nm560 بيشترين جذب نوري را دارد.

5-Br-PAPS + Zn+2 → 5-Br-PAPS-Zn complex

3-1-4-3 معرف‌ها:

  • كيت اندازه‌گيري روي سرم به طور تجاري موجود است و براي انجام آزمايش از معرف رنگزاي A (ويال‌هاي 60 ml × (2و B (ويال 30 ml × 1) استفاده مي‌كنيم.
  • استاندارد روي (100 µmol/L)‌: مقدارg 144 سولفات روي (ZnSO4. 7H20) را در ml50 آب خالص حل كرده و با افزودن ml1 از آن به ml99 آب خالص، آن را رقيق كنيد. اين محلول را در C˚20- فريز نماييد.
  • منحني استاندارد: استاندارد µmol/L 100 فوق را با آب خالص رقيق نمایید تا رقت‌هاي 80، 60، 40 و 20 از آن تهيه شود.
  • معرف رنگي: 4 قسمت از معرف رنگزاي A را با 1 قسمت از معرف رنگزاي B مخلوط کنید. (براي پليت 96 تستي، ml25 مورد نياز است)، اين محلول 2 روز در دماي اتاق و يك هفته در 4˚C پايدار است.
  • نمونه كنترل از پلاسماي مني: طرز تهيه آن در بخش 4-1-4-3 شرح داده شده است.

4-1-4-3 روش كار:

  • مايع مني را پس از آناليز روتين به مدت 10 دقيقه در g1000 سانتريفوژ كنيد. محلول رويي را جدا کنید و تا زمان انجام آزمايش آن را در ˚C20- منجمد نماييد. مقداري از پلاسماي سمينال بيماران مختلف را مخلوط کرده ، از آن به عنوان كنترل استفاده نماييد.
  • براي انجام آزمايش، مقداري از پلاسماي مني بيمار و پلاسماي مني كنترل را ذوب كنید و با ورتكس مخلوط نماييد.
  • در دو لوله ml 5/1مقدار µL 300 آب خالص بریزید و µL 5 پلاسماي سمينال به آن اضافه نماييد. سپس آن را 5 ثانيه با ورتكس مخلوط كنيد.
  • درپليت‌هاي 96 خانه‌اي، مقدار µL 40 از نمونه رقيق شده بيمار (مرحله 3)، بلانك (آب مقطر) و نمونه‌هاي استاندارد را به صورت دوپليكيت بريزيد.
  • مقدار µL 200 معرف رنگي به هر خانه اضافه کرده، 5 دقيقه روي شيكر مخلوط كنيد.
  • با استفاده از بلانك، نتايج را در nm 560 قرائت نماييد.

 

5-1-4-3 محاسبه نتايج:

  • با استفاده از منحني استاندارد، غلظت روي را در نمونه بدست آوريد.
  • اگر نتايج حاصل بيشتر از آخرين حد استاندارد بود، نمونه را بيشتر رقيق كرده ، آزمايش را تكرار كنيد.
  • نتايج حاصل را در ضريب رقت كه عدد 61 است، ضرب نماييد (µL 5 پلاسماي سمينال + µL 300 آب مقطر ضريب 61) تا غلظت روي در پلاسماي سمينال به دست آيد. (mmol/L)
  • نمونه‌ها به صورت دوپليكيت انجام شده است و اختلاف آنها بايد كمتر از 10% باشد، در غير اين صورت آزمايش را بايد تكرار کرد.
  • براي به دست آوردن ميزان روي در كل مايع انزالي، غلظت روي را بايد در حجم مايع مني ضرب نمود.

6-1-4-3 كمترين حد مرجع:

كمترين حد مرجع براي روي در مايع مني µmol 2.4 درهرانزال است.

 

2-4-3 اندازه‌گيري فروكتوز در مايع انزال:

1-2-4-3 مقدمه: اساس روش، متد Karvonen & Malm است كه مديفيه شده است و حساسيتي برابر با /L µmol74 دارد. حجم مايع مني و محلول‌ها را مي‌توان بر اساس اين كه از كووت ml 1 يا ml 3 استفاده شود تغيير داد.

2-2-4-3 اصول كار:

فروكتوز تحت تأثير حرارت و PH پايين با اندول يك كمپلكس رنگي ايجاد مي‌كند.

(اسید+گرما)

<———–Fructose+ indole

كمپلكس رنگي كه بيشترين جذب نوري را در nm 470 دارد.

 

3-4-2-3معرف‌ها:

كيت اندازه‌گيري فروكتوز در مايع مني به صورت تجاري موجود است. از روش زير نيز مي‌توان استفاده نمود:

  • محلول دپروتئينه كننده 1 (ZnSO4 63 µmol/L): مقدار g8/1 از 7 H2O را در ml 100 آب خالص حل كنيد.
  • محلول دپروتئينه كننده 2 (NaoH 1 mol/L): مقدار 0/4gاز NaOH را در ml100 آب خالص حل كنيد.
  • معرف رنگ‌زا (اندولµmol/L 2 درنگهدارنده بنزوات 16 µmol/L): مقدار mg 200 اسيد بنزوئيك را در ml 90 آب خالص حل كرده ، با تكان دادن در بن ماريC˚60 آن را حل كنيد. mg25 اندول را در اين محلول حل نمایید و حجم آن را به ml 100 برسانيد. سپس با كاغذ صافي µm 45/0صاف كرده ، در C˚4 نگهداري كنيد.
  • استاندارد فروكتوز(2/24 mol/L) : مقدار mg40 از D فروكتوز را در ml 100 آب خالص حل نمایید و در C˚4 نگهداري كنيد.
  • منحني استاندارد: استاندارد mol/L 24/2 را با آب خالص رقيق كنید تا چهار استاندارد 12/1، 56/0، 28/0 و 14/0 به دست آيد.
  • نمونه كنترل را مطابق آنچه در بخش 4-2-4-3 خواهد آمد تهيه كنيد.

4-2-4-3 روش كار:

  • مايع مني را پس از آناليز به مدت 10 دقيقه درg 1000 سانتريفوژ كنيد. محلول رويي را جدا کنید و تا زمان آزمايش در C˚20- منجمد نماييد. مقداري از پلاسماي سمينال بيماران مختلف را مخلوط نموده ، از آن به عنوان كنترل استفاده كنيد.
  • مقداري از پلاسماي مني بيمار و نمونه كنترل را هنگام انجام آزمايش ذوب کنید و با ورتكس مخلوط نماييد.
  • در لوله هاي 1/5 ml مقدار 50 µL آب خالص را با 5 µL پلاسماي سمينال اضافه کرده ، مخلوط كنيد.
  • دپروتئينه كردن: به 55 µL از نمونه رقيق شده فوق، 12/5 µL ‌از 63µmol/L ZnSO4 و 12/5 µL از NaOH 0/1 mol/L افزوده و مخلوط كنيد. سپس 15 دقيقه در حرارت اتاق قرار دهید و 5 دقيقه در g8000 سانتريفوژ كنيد.
  • مقدار 50 µL از محلول رويي، آب مقطر و هر يك از استانداردها را به صورت دوپليكيت در لوله‌ها بريزيد.
  • 50 µL معرف اندول به همه لوله‌ها اضافه و مخلوط كنيد.
  • 0/5 mlاسيد كلريدريك غليظ (32% v/v) به هر لوله افزوده، درب آن را ببندید و با دقت مخلوط كنيد.
  • 20 دقيقه در حمام C˚50 حرارت دهيد، سپس مخلوط كنید و در آب يخ به مدت 15 دقيقه قرار دهيد.
  • مقدار 250 µLاز آن را با دقت بردارید و درون چاهك پليت‌هاي 90 تايي بريزيد.
  • درب پليت را بپوشانيد.
  • نتايج را در 470 nmدر مقابل بلانك بخوانيد.

 

5-2-4-3 محاسبه نتايج:

  • با استفاده از منحني استاندارد، غلظت فروكتوز نمونه را به دست آوريد.
  • اگر نتايج حاصل بيشتر از آخرين استاندارد بود، نمونه را بيشتر رقيق كرده ، آزمايش را تكرار كنيد.
  • نتايج حاصل را در ضريب رقت كه عدد 16 است ضرب نماييد (5 µL پلاسماي سمينال + 75 µL آب مقطر ضريب 16) تا غلظت فروكتوز در پلاسماي سمينال به دست آيد.(mmol/L)
  • نمونه‌ها به صورت دوپليكيت انجام شده است ، اختلاف آنها بايد كمتر از 10% باشد، در غير اين صورت بايد آزمايش را تكرار نمود.
  • براي به دست آوردن ميزان فروكتوز در كل مايع انزالي، غلظت فروكتوز را بايد در حجم مايع مني ضرب نمود.

 

6-2-4-3 كمترين حد مرجع:

كمترين حد مرجع براي فروكتوز در مايع مني µmol 13 است.

نكته: كاهش فروكتوز مايع مني نشانه انسداد مجراي انزالي، فقدان مادرزادي و دو طرفه وازدفرانس، انزال رتروگراد و كاهش آندروژن‌هاست.

3-4-3 اندازه‌گيري α گلوكوزيداز خنثي در پلاسماي مني:

1-3-4-3 مقدمه: پلاسماي مني حاوي دو ايزوآنزيم است:

  • α گلوكوزيداز خنثي كه از اپيديديم منشأ مي‌گيرد.
  • ايزوآنزيم‌هاي اسيدي كه در ارتباط با پروستات است.

زماني كه بخواهيم ايزوآنزيم خنثي را اندازه‌گيري كنيم به كمك سديم دو دسيل سولفات (SDS) ‌ايزوآنزيم اسيدي را مهار مي‌كنيم.

روش ارائه شده در زير، حساسيتي معادل 1/9 mU/ml دارد و حجم مايع مني و محلول‌ها را مي‌توان بر اساس اين كه از كووت ml1 يا ml3 استفاده مي‌شود تغيير داد.

2-3-4-3 اصول كار:

گلوکوزيداز باعث تبديل گلوكوپيرانوزيد به پارانيتروفنل می شود كه با افزودن كربنات سديم به رنگ زرد درمي‌آيد.

       α- glucosidase                              Na2co3                                 

P-nitrophenol- α-glucopyranoside ————-P-nitrophenol————-

در طول موج nm 405 نور را جذب مي‌كند.

 

3-3-4-3 معرف‌ها:

كيت اندازه‌گيريα گلوكوزيداز خنثي به صورت تجاري موجود است. فقط از كيت‌هايي كه SDS و كاستانواسپرمين دارند براي آزمايش استفاده كنيد. كاستانواسپرمين باعث افزايش حساسيت تست مي‌گردد. از روش زير نيز مي‌توان براي آزمايش استفاده نمود:

  • بافر شماره 1 (فسفات 0/2 mol/L با (PH=6/8: ‌مقدار 4/56 g از K2HPO4,3H2O را در ml 100 آب مقطر حل كنيد. g72/2 از KH2PO4 را جداگانه در ml 100 آب خالص حل نماييد. حجم‌هاي تقريباً مساوي از دو محلول فوق را مخلوط كنيد تاPH=6 گردد.
  • بافر شماره 2: مقدار g 1 از SDS را در ml 100 بافر شماره 1 حل كنيد. SDSدر C˚4 رسوب مي‌كند اما با گرم شدن مجدداً حل مي‌شود.
  • معرف رنگي شماره 1 (سديم كربنات mol/L 1/0) مقدار g 20/6 از Na2Co3 . H2O را در ml 500 آب حل كنيد.
  • معرف رنگي شماره 2: مقدار g 1/0 از SDS را در ml 100 از معرف شماره يك حل كنيد.
  • سوبستراي پارانيتروفنل گلوكوپيرانوزيد mg/ml (PNPG) 5: مقدار g 1/0 از PNPG را در ml 20 بافر شماره 2 حل نمایید و آن را تا C˚ 50 گرم كنيد و 10 دقيقه هم بزنید تا به خوبي حل شود. البته ممكن است تعدادي كريستال به صورت حل نشده باقي بماند. اين محلول بايد در C˚37 نگهداري شود و براي هر آزمايش محلول تازه تهيه شود.
  • تهيه مهاركننده گلوكوزيداز براي توليد بلانك: مقدار mg 9/18 كاستانواسپرمين را در ml 10 آب خالص حل نمایید و آن را با آب خالص به نسبت 1 به 10 رقيق كنيد تا محلول آماده كار به غلظت mmol/L 1 ايجاد شود. اين محلول را در حجم‌هاي 1 ميلي‌ليتري در C˚20- ذخيره کنید. كاستانواسپرمين مهاركننده گلوكوزيداز است.
  • منحني استاندارد پارانيتروفنل (PNP) mmol/L 5: مقدار mg5/69 از PNP را در ml 100 آب مقطر حل كنيد و در صورت نياز آن را گرم نمایید تا كاملاً ‌حل شود. محلول حاصل را در بطري‌هاي تيره يا پوشيده از آلومينيوم فويل بریزید و در C˚4 نگهداري كنيد. محلول استاندارد هر 3 ماه بايد با محلول تازه عوض شود.
  • تهيه منحني استاندارد: مقدارµL 400 از محلول ذخيره PNP (mmol/L 5) را در يك ظرف 10 ميـــــــلي‌‌ليتري بریزید و با معرف رنگي شماره 2 آن را به ml 10 برسانيد (200 µmol/L). استاندارد حاصل را با معرف رنگي شماره 2 به نحوي رقيق كنيد كه استانداردهاي 160، 120، 80 و 40 نيز به دست آيد.
  • نمونه كنترل را مطابق آنچه در بخش 4-3-4-3 خواهد آمد تهيه كنيد.

 

4-3-4-3 روش كار:

  • مايع مني را 10 دقيقه در g 1000 سانتريفوژ كنید و محــــلول رويي را پس از جدا کردن، در C˚20- نگهداري كنيد. مقداري از پلاسماي مني بيماران مختلف را مخلوط كنید و آن را به عنوان كنترل استفاده نماييد.
  • مقداري از پلاسماي مني بيمار و نمونه كنترل را هنگام انجام آزمايش ذوب کنید و با ورتكس مخلوط نماييد.
  • در لوله‌هاي ml 15، مقدار µL 15 پلاسماي مني و µL 15 آب مقطر را به صورت دوپليكيت بريزيد. نمونه كنترل را هم در چهار لوله بريزيد.
  • به دو لوله كنترل، µL 8 از كاستانواسپرمين mmol/L 1 افزوده ، به عنوان بلانك مني از آن استفاده كنيد.
  • به همه لوله‌ها µL 100 سوبستراي PNPG اضافه کنید و در C˚37 قراردهيد.
  • لوله‌ها را مخلوط كنید و 2 ساعت در C˚37 قرار دهيد.
  • پس از دو ساعت، ml 1 معرف شماره 1 رااضافه و مخلوط كنيد تا انكوباسيون متوقف شود.
  • µL 250 از نمونه‌ها و استانداردها را به پليت‌هاي 96 تايي منتقل كنيد.
  • پليت را طي 60 دقيقه در nm 405 در مقابل بلانك آب مقطر قرائت كنيد.

5-3-4-3 محاسبه نتايج:

  • با استفاده از منحني استاندارد، غلظت PNP را حساب كنيد.
  • اگر نتايج حاصل بيشتر از آخرين حد استاندارد بود، نمونه را بيشتر رقيق كرده ، آزمايش را تكرار كنيد.
  • نتايج را در ضريب رقت 0/6194 ضرب کنید تا فعاليت گلوكوزيداز خنثي به دست آيد (برحسب (IU/L .
  • ميزان فعاليت بلانك كاستانواسپرمين را از نمونه كم كنيد تا ميزان فعاليت اصلاح شده به دست آيد.
  • نمونه‌ها به صورت دوپليكيت انجام شده است و اختلاف آنها بايد كمتر از 10% باشد، در غير اين صورت بايد آزمايش را تكرار نمود.
  • براي به دست آوردن فعاليت گلوكوزيداز در كل مايع انزالي، ميزان فعاليت آن را در حجم مايع انزالي ضرب كنيد (mU).

توجه: يك واحد بين‌المللي (IU) فعاليت گلوكوزيداز عبارت است از توليد µmol 1 محلول PNP در هر دقيقه در حرارت C˚37. در اين آزمايش چون µL 15 پلاسماي سمينال در حجم كلي µL 1115 در طي 120 دقيقه وارد واكنش مي‌شود، لذا ضريب تصحيح عبارت است از:

/120 = 0/6194

 

6-3-4-3 محدوده مرجع:

كمترين حد مرجع براي α گلوكوزيداز خنثي معادل mU 20 در هر انزال است.

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی