معماری

آزمایش توکسوپلاسما Toxoplasma gondii PCR

توکسوپلاسما گوندی نوعی تک یاخته کوکسیدیایی است که دارای انتشار وسیعی در سراسر جهان بوده و عامل ایجاد بیماری مشترک بین انسان و حیوان می باشد. میزان شیوع عفونت توکسوپلاسمایی در ایران نیز قابل توجه است. آلودگی با توکسوپلاسما در افرادی که از سیستم ایمنی سالمی برخوردارند، معمولاً بدون ظهور علائم بالینی است ولیکن آلودگی به این تک یاخته در دوران بارداری، می تواند منجر به مرگ جنین، زایمان زودرس و توکسوپلاسموز مادرزادی شود.

نام اختصاری: Toxoplasma gondii PCR  

سایر نام ها:

  1. gondii PCR

 

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: بر اساس منبع آلودگی می تواند خون، سرم، مایع آمنیوتیک، مایع نخاع (CSF)، مایع چشمی و یا بافت تازه باشد. برای ردیابی عفونت های مادرزادی توصیه می شود از مایع آمنیوتیک جهت ردیابی DNA توکسوپلاسما استفاده شود.

حجم نمونه مورد نیاز: خون 5 ml ، مایعات بدن 1 ml ، مایع آمنیوتی 5 ml

شرایط نمونه گیری:

  1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
  2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. لازم است نمونه گیری در شرایط استریل و در لوله های جمع کننده یا پلاستیکی استریل صورت گیرد و برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.
  2. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.
  3. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box ) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
  4. از لوله های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
  5. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
  6. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

  1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
  2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
  1. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

  1. نمونه های مورد استفاده باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای یخچال یا ºC 20 – قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
    1. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.

کاربردهای بالینی:

تشخیص زود هنگام عفونت مغزی حاد، چشمی و توکسوپلاسموز مادرزادی جهت انجام اقدامات درمانی به موقع و مناسب.

اطلاعات تکمیلی:

گربه به عنوان مهم ترین عامل انتقال این عفونت به انسان شناخته شده است به همین دلیل به بیماری توکسوپلاسموزیس، عنوان بیماری گربه نیز داده اند. قسمت اصلی زندگی انگل که همان دوره جنسی انگل و ایجاد تخم است، در بدن گربه صورت می گیرد. سپس تخم ها از مدفوع گربه دفع می شوند و به میزبان واسط می رسند. گربه آلوده هر روز صد میلیون انگل را دفع می کند که در شرایط مساعد تا سال ها در خاک زنده می مانند. انسان ها از طریق خوردن مواد غذایی آلوده به مدفوع گربه یا خوردن گوشت دام آلوده مثل گوسفندی که قبلا تخم های انگل را خورده و انگل در ماهیچه یا مغز دام به صورت کیست در آمده، به این بیماری مبتلا می شوند.

خطر اصلی این بیماری، انتقال از مادر به جنین است که می تواند باعث ناهنجاری های مختلف چشمی و مغزی در نوزاد شود. این ارگانیسم در انسان می تواند منجر به ایجاد توکسوپلاسموز نوزادی یا مادرزادی شود. توکسوپلاسموز مادرزادی یکی از علل اصلی کوری و سایر نقایص مادرزادی نظیر مرده زایی، کوریورتینیت (التهاب مشیمیه و شبکیه)، کلسیفیکاسیون داخل مغزی، صدمات حرکتی – روانی و هیدروسفالی یا میکروسفالی می باشد.

روش مرجع:  ایمیونوفلوئورسانس غیر مستقیم (IFA)

روش ارجح:  IFA ، کمی لومینوسانس

سایر روشها:

  1. a) روش های مولکولی نظیر PCR که بر اساس ردیابی DNAی انگل در نمونه بیمار صورت می گیرند
  2. b) روش های پارازیتولوژی که جهت مشاهده انگل به کار می روند
    1. c) روش‌هاى سرولوژى که براى جستجو و تعيين مقدار پادتن‌هاى اختصاصى توکسوپلاسما کاربرد دارند. از میان روش های سرولوژی، آزمون رنگى سابين فلدمن (Sabin-Feldman dye test)و آزمون فلوئورسنت پادتن غيرمستقيم
      (Indirect fluorescent antibody) کاربرد وسيع تری دارند ولیکن آزمايش‌هاى ديگر نظیر ثبوت مکمل
      (Complement Fixation-CF)، آزمايش هماگلوتيناسيون غيرمستقيم (Indirect hemagglutination)، آگلوتيناسيون مستقيم و الايز (Enzyme Linked Immunosorbetn Assay-ELISA) نيز براى تشخيص توکسوپلاسموز استفاده مى‌شوند.

مقادیر طبیعی: DNA ی انگل توکسوپلاسما در نمونه های حاصل از افراد سالم قابل ردیابی نیست حتی اگر این افراد قبلاً در معرض عفونت قرار گرفته باشند.

نکته: میزان DNAی انگل در نمونه مورد آزمایش باید به اندازه ای باشد که پس از تکثیر توسط واکنش PCR قابل ردیابی باشد.

تفسیر:

توکسوپلاسموزیس نوعی عفونت انگلی مشترک بین انسان و حیوانات گرم است که دارای شیوع بالایی در سرا سر دنیا است. به منظور جلوگیری از بروز عوارض متنوع ناشی از عفونت توکسوپلاسمایی نظیر سقط جنین و اختلالات عصبی و بینایی، تشخیص به موقع عفونت و انجام اقدامات درمانی مناسب بسیار حائز اهمیت است.

روش های گوناگونی نظیر کشت انگل، روشهای سرولوژیکی و مولکولی جهت بررسی نمونه های بالینی از نظر آلودگی به عفونت توکسوپلاسمایی مورد استفاده قرار می گیرند. روش جداسازی انگل با استفاده از تلقیح حیوانی یا کشت سلولی بسیار طولانی و زمان بر است و برای تشخیص سریع چندان کارامد نیست. روش های سرولوژیکی در افرادی با ضعف ایمنی نظیر جنین می تواند منجر به ایجاد نتایج غیر قابل اعتماد شود همچنین در بسیاری از موارد قادر به تفکیک عفونت قبلی از عفونت حاد نمی باشد ولیکن، ردیابی ژنوم انگل به وسیله تکنیک PCR به عنوان روشی با حساسیت و ویژگی بالا شناخته شده است.

تکنیک PCR که وجود اسید نوکلئیک توکسوپلاسما را در مایع آمنیوتیک بررسی می کند، دارای حساسیت بسیار بالاتری نسبت به اندازه گیری IgM در مایع آمنیوتیک از طریق آمنیوسنتز می باشد و لذا می تواند به عنوان روشی سریع و مؤثر جهت تشخیص به موقع عفونت در زنان باردار مورد استفاده قرار گیرد.

در تکنیک Real time PCR نواحی اختصاصی از ژنوم انگل تکثیر می یابد و محصول تکثیر یافته از طریق رنگ های فلوئورسنت ردیابی می شود. مشاهده مستقیم شدت فلوئورسانس در طول PCR (یعنی real time)، به ما اجازه می دهد تا بدون نیاز به باز کردن مجدد تیوب ها بعد از اتمام PCR، نتیجه آزمایش را بررسی نموده و از وجود یا عدم وجود DNAی انگل در نمونه مورد آزمایش مطمئن شویم.

عوامل مداخله گر :

  • هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
  • نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
  • برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR از هم جدا باشند.

توضیحات:

  • نتیجه «Undetected»  نشان می دهد که DNAی انگل در نمونه یافت نشده است.
  • تشخیص عفونت با حضور مقادیر قابل تشخیص DNA ی انگل در نمونه مورد آزمایش امکان پذیر است.
  • در صورت عدم ردیابی DNA ی انگل در نمونه بیمار، احتمال آلودگی به عفونت با توکسوپلاسما رد نمی گردد.

نام اختصاری:  Toxo IgG,IgM                               

سایر نام ها: آنتی بادی ضد توکسوپلاسما گوندی، آنتی توکسوپلاسموز، تیتر آنتی بادی توکسوپلاسموز.

Toxoplasma IgG & IgM Antibody Assays, Toxoplasmosis Diagnostic, Toxoplasmosis Antibody Titer, IgM&IgG

بخش انجام دهنده: آنالیز هورمون + ایمونولوژی

نوع نمونه قابل اندازه گیری:  سرم، مایع مغزی نخاعی (CSF)                            

حجم نمونه مورد نیاز:  1ml

شرایط نمونه گیری:

  1. نیاز به ناشتایی یا آمادگی خاصی نمی باشد.
  2. ترجیحاً نمونه گیری طی 14– 10 روز فاز حاد یا نقاهت بیماری انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. مطابق دستورالعمل آزمایشگاه در مورد بیماران مسری، از بیمار نمونه خون وریدی گرفته شود. خون گرفته شده را در ویال های با درب قرمز جمع آوری نمایید.
  2. نمونه گیری باید در مکانی مجزا و در شرایط استریل، همراه با تکنیک های آسپتیک صورت گیرد.
  3. محل خونگیری را از نظر خونریزی بررسی نمایید.
  4. در ظرف دو ساعت سرم را از سلول جدا نموده و تا زمان آزمایش در یخچال قرار دهید.
  5. سرم جدا شده باید شفاف و عاری از فیبرین ، همولیز و یا لیپمیک باشد.
  6. نمونه گیر می بایست شرح حالی از وضعیت بالینی بیمار از وی پرسیده و در صورت لزوم در برگه آزمایش یادداشت نماید.

موارد عدم پذیرش نمونه:

  1. نمونه ای که به طور مکرر ذوب و فریز گردد.
  2. سرم های با همولیز و لیپمیک شدید.
  3. نمونه هایی که در معرض حرارت بالا قرار گرفته باشند.
  4. نمونه هایی به غیر از سرم یا مایع مغزی نخاعی (CSF)
  5. نمونه های بدون برچسب یا با برچسب اشتباه.

شرایط نگهداری:

  1. ترجیحاً پس از جداسازی سرم آن را تا زمان آزمایش در دمای 2-8oC نگاه دارید.
  2. در صورتی که در طی 7 روز آزمایش انجام نشود، آن را در 20oC-   نگاه دارید. پایداری نمونه در این دما 14 روز است.

اطلاعات تكميلي:

Toxoplasma gondii یک انگل پروتوزوایی داخل سلولی اجباری است که انسان و سایر پستانداران را آلوده می‏کند آلودگی با این انگل گسترة جهانی داشته و عفونت‏های انسانی بسیار شایع است. مطالعات سرولوژیک نشان داده‏اند که تقریباً یک سوم تا نیمی از جمعیت آمریکا با این انگل آلوده شده‏اند. اکثر آلودگی‏های انسانی یک سیر مزمن بدون علامت دارند، با این حال عفونت‏های منتشر شدید به خصوص در افراد با نقص ایمنی اتفاق می‏افتد. توکسوپلاسموز در دو موقعیت بالینی دارای اهمیت خاص است، اول عفونت‏های منتقله به جنین و دوم به عنوان شایع­ترین عفونت فرصت‏طلب دستگاه عصبی مرکزی (CNS) در افراد مبتلا به ایدز. این انگل در عفونت‏های مادرزادی می‏تواند سبب هیدروسفالی، عقب‏ماندگی ذهنی و کوریورتینیت شود. توکسوپلاسموز ممکن است یک عارضه تهدیدکننده حیات در پیوند عضو باشد.

T.gondii  در گربه‏ها آندمیک است. اووسیست‏ها (oocyst) می‏توانند به مقدار فراوان از طریق مدفوع گربه دفع شوند (100000 به ازای هر گرم مدفوع) و می‏توانند در محیط تا ماه‏ها زنده بمانند. انسان به علت نگهداری گربه در منزل و یا تماس اتفاقی در محیط به راحتی با اووسیت‏ها مواجهه پیدا می­کند. در اکثر افراد، آنتی‏بادی بدون هیچگونه بیماری بالینی تولید می‏شود و در عفونت‏های علامت‏دار نیز شایع­ترین تظاهر، یک لنفادنیت خود محدود شونده است. ترانسفوزیون خون یک علت نادر توکسوپلاسموز است که این خطر در ترانسفوزیون گلبول­های سفید تا حدودی بیشتر است.

کاربردهای بالینی:

  1. تشخیص توکسوپلاسموز حاد در بیماران دچار سرکوب ایمنی، زنان باردار و نوزادان.
  2. تشخیص ایمنی حاصل از عفونت قبلی (مانند عفونت جنینی)

روش مرجع: ایمیونوفلوئورسانس غیر مستقیم (IFA)                               

  روش ارجح: IFA ، کمی لومینوسانس

سایر روشها: ثبوت مکمل، Enzyme-Linked Fluorescence Assay (ELFA)، ELISA، Multiplex Flow Immunoassay

مقادیر مرجع:

Toxo IgG:

مقادیر مرجع (IU/ml) تفسیر
 9≥ منفی
10 – 11 مشکوک
  12≤ مثبت

 

Toxo IgM:

مقادیر مرجع (IU/ml) تفسیر
 0.55> منفی
0.55 – 0.64 مشکوک
  0.65≤ مثبت

 

سرولوژی: IgG  کمتر از 4 برابر افزایش تیتر یا تیترهای کمتر از 1:16 نشانه عدم عفونت قبلی است. تیترهای 1:16 تا 1:256معمولاً در جمعیت عمومی متداول است و تیترهای بیشتر از 1:256نشان دهندة عفونت اخیر است.

تیتر IgM بیشتر از 1:256 نشان دهندة عفونت اخیر است.

تفسیر: حضور آنتی بادی IgM در سرم نشاندهنده توکسوپلاسموز فعال می باشد اما افزایش تیتر آنتی IgM در بیماران دچار نقص ایمنی مشاهده نمی گردد. علاوه بر این، سطوح افزایش یافته IgM ممکن است از یک عفونت حاد که مدتها پیش ( 1 سال قبل) رخ داده است باقی بماند.

سطوح آنتی بادی IgG به تنهایی نشان دهنده قرار گرفتن در معرض قبلی به توکسوپلاسما (اخیر یا گذشته) است. یک نتیجه مثبت IgG نباید بتنهایی برای تشخیص عفونت اخیر مورد استفاده قرار گیرد. مقادیر آنتی بادی بالارونده IgG به همراه  IgMاز منفی به مثبت نشان دهنده عفونت اخیر توکسوپلاسما گوندی است.

IgG  منفی به همراه IgM منفی نشاندهنده در معرض قرار نگرفتن فرد به ویروس Toxo و عدم ایمنی می باشد. با این وجود یک نتیجه منفی ابتلا به عفونت Toxo و یا پاسخ به واکسیناسیون را رد نمی کند. زیرا ممکن است نمونه گیری قبل از ظهور آنتی بادی در خون گرفته شده باشد.

سطوح IgG نمونه بیماران  در طی مرحله اولیه عفونت حاد (قبل از ظهور آنتی بادی در خون) ممکن است <9 IU/mL باشد. نتیجه مثبت IgG نباید بتنهایی دال بر تشخیص عفونت اخیر باشد. نتایج باید در رابطه با تظاهرات بالینی، تاریخچه بیمار و سایر یافته های آزمایشگاهی باشد.

سطوحIgG برای تشخیص عفونت در اطفال کمتر از6 ماه سن مفید نیست. آنتی بادی IgG در این گروه سنی معمولاً ناشی از انتقال غیر فعال از مادر است .

خصوصیات عملکردی این آزمایش در افراد با نقص سیستم ایمنی مورد ارزیابی قرار نگرفته است و همچنین برای نمونه خون بند ناف و آزمایش نوزادان تعیین نشده است. نمونه هایی که مشکوک تفسیر شده اند ممکن است سطوح بسیار پایین از IgM مثبت داشته باشد. در این موارد نمونه دوم باید 14-10 روز بعد گرفته شده و تست مجدداً انجام شود.

در اغلب موارد ، تست مثبت آنتی بادی IgM باید با استفاده از روش دیگري تأیید گردد، یا با ارسال نمونه به آزمایشگاه مرجعي که به طور اختصاصي آزمایش توکسوپلاسموز را انجام میدهد.

یک تشخیص مشکوک به توکسوپلاسموز حاد باید با شناسایی DNA توکسوپلاسما گوندی با روش PCR  و آنالیز بر روی مایع مغزی نخاعی و یا مایع آمنیوتیک تأیید گردد.

عوامل مداخله گر :

پاسخ‏های سرولوژیک در حضور نقص ایمنی فاقد اطمینان هستند. PCR مثبت نشانه وجود DNA ویروس است ولی PCR منفی وجود بیماری فعال را رد نمی‏کند.

فاکتور روماتوئیدی یا آنتی بادی های ضد هسته ای (Anti nuclear Antibody) موجب نتایج مثبت کاذب می گردند.

سایر عفونتهای فعال مادرزادی می توانند موجب نتایج مثبت کاذب گردند.

نمونه های شدیداً همولیز و لیپمیک در نتایج آزمایش ایجاد تداخل می کنند، همچنین وجود فیلامان های فیبرین می تواند در آزمایش ایجاد تداخل کند.

در بیماران مبتلا به ایدز میزان آنتی بادیهای اختصاصی IgG کم یا متوسط و میزان IgM منفی می باشد.

در اکثر جمعیت‏ها شیوع بالایی از آنتی‏بادی IgG وجود دارد. هر چند که یک تیتر بالای منفرد به نفع عفونت حاد است، ولی تیترها ممکن است در افراد سالم تا سال­ها بالا باقی بمانند.

توضیحات:

  • تست آنتی بادیIgG توکسوپلاسما را مي توان به تنهايي، يا همراه با تست آنتی بادی IgM برای کمک به تأیید وجود عفونت اخیر یا قبلی توکسوپلاسما مورد استفاده قرار داد.
  • افزایش 4 برابری مقادیرToxo-IgG به همراه مقادیر بالای Toxo-IgM  نشاندهنده عفونت فعال (اخیر) می باشد. آنتی بادی Toxo-IgG در حالت بهبود عفونت تا پایان عمر در بدن یافت می شود.در حالی که Toxo-IgM پس از ماهها به تدریج ناپدید می شود.
  • تست آنتی بادی توکسوپلاسما گونديي به طور روتين براي زنان باردار درخواست نميشود، اما ممکن است هنگامی که پزشک می خواهد تعیین كند كه آیا زن قبلا توکسوپلاسموز داشته و هنگامی که او در معرض مدفوع گربه، گوشت خام یا خوب پخته نشده، یا آب یا غذای آلوده قرار گرفته است، درخواست مي شود.
  • هنگامی که تست آنتی بادی منفی است، اما شكو ترديد هنوز هم باقی است، آزمايش ممکن است یک یا چند بار در طول دوران بارداری تکرار شود.
  • تمایز بین عفونت فعال مزمن، غیرفعال و قدیمی ممکن است مبهم باشد.
  • نتایج نمونه خون بند ناف، نوزادان و افراد دچار نقص سیستم ایمنی باید با احتیاط بیشتری تفسیر گردد.
  • آنتیبادی هايIgM  تنها نوع تولید شده توسط جنین است. هنگامی که اين آنتي بادي ها در نوزاد وجود دارند، عفونت مادرزادی را نشان مي دهند.
  • سطح آنتی بادیIgM در افراد دچار نقص ایمنی، با اين كه توکسوپلاسموز فعال دارند، ممکن است پایین تر از حد انتظار باشد.
  • آزمایشات سرولوژیک حساسیت، ایمنی و عفونت اولیهتوکسوپلاسموز را تعیین می کنند.
  • نتایج آزمون باید همراه با علائم بیمار، تاریخچه بالینی، و دیگر یافته های آزمایشگاهی ارزیابی شود.

پاسخ دهید