معماری
آزمایش

آزمایش HER-2 PCR

سرطان پستان متداولترین نوع سرطان در زنان است. بطوریکه نشان داده شده از هر 9 الی 11 زن یک نفر به سرطان پستان مبتلا می شود که این نسبت با افزایش سن افزایش می یابد. مانند دیگر تومورها ،چندین تغییر ژنتیکی در سرطان پستان شناسایی شده اند که در رشد کنترل نشده سلول تومور دخیل هستند. در این میان،HER-2  یکی از ژنهای دخیل در سرطان پستان است.

نام اختصاری: HER-2 PCR  

سایر نام ها:

ERBB2، Proto-Oncogene Neu or Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری:

نمونه مورد نیاز می تواند یکی از موارد ذیل باشد:

سرم یا پلاسما، بافت

حجم نمونه مورد نیاز:  سرم یا  پلاسما ml 1، بافت mg 25

شرایط نمونه گیری:

  1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
  2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
  2. برای جمع آوری خون یا پلاسما از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد استفاده شود.
  3. ماده ضد انعقاد مورد نیاز برای جمع آوری خون یا پلاسما می تواند EDTA یا سیترات باشد.
  4. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
  5. پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از جدا سازی سرم یا پلاسما، بلافاصله نمونه در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20 – نگهداری شود.
  6. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
  7. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و سرد و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود.
  8. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس 10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

  1. نمونه گیری نادرست و در شرایط غیر استریل.
  2. قرار دادن نمونه در درجه حرارت بالا و ذوب و فریز مکرر نمونه.
  1. در این آزمایش از نمونه های هپارینه نمی توان استفاده کرد (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود). همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نیست.

شرایط نگهداری:

  1. سرم یا پلاسما باید طی چند ساعت اولیه پس از خون گیری جدا سازی شده و تا زمان انجام  آزمایش، در دمای ºC 20 – نگهداری شود. سایر نمونه های مورد استفاده نیز باید طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری در دمای ºC 20 – قرار داده شده و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
    1. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط سرد حمل شود.
    2. در صورت نبود شرایط برای انتقال نمونه در 24 ساعت اولیه، نمونه را در oC 20 – فریز نمایید.

کاربردهای بالینی:

ارزیابی دقیق وضعیت HER-2 بیماران، می تواند در کنترل بهتر بیماری و درمان بیماران مبتلا به سرطان پستان بسیار مؤثر باشد.

اطلاعات تکمیلی:

رسپتورهای خانواده فاکتور رشد اپیدرمی Human Epidermal Growth Factor) ( شامل HER-1، HER-2، HER-3 و
HER-4 می باشند که نقش اساسی در بیماریزایی چندین سرطان انسانی ایفا می کنند. رسپتورهای خانواده HER  رشد ، بقا و تمایز سلول را تنظیم می کنند. این رسپتورها از سه قسمت تشکیل شده اند که شامل یک جایگاه اتصال به لیگاند خارج سلولی غنی از سیستئن، یک ناحیه لیپوفیلیک بین  غشایی(ترانس ممبران) و یک ناحیه داخل سلولی با فعالیت تیروزین کینازی می باشد. رسپتور HER-2 یک گلیکوپروتئین بین غشایی با 1255 آمینواسید و 185 کیلو دالتون وزن بوده که ژن آن بر روی بازوی بلند کروموزوم 17 انسان واقع شده است.

رسپتورهای خانواده HER به صورت منومر در سطح سلول وجود دارند. به محض اتصال لیگاند به دمین خارج سلولی، پروتئین HER دیمریزه شده و دمین داخل سلولی آن ترانس فسفریله می شود. لیگاندی که بطور مستقیم توانایی فعال کردن رسپتور HER-2 را داشته باشد، شناسایی نشده و این رسپتور به محض اتصال به رسپتورهای دیگر این خانواده( از جمله HER-1 وHER-3 )، که درنتیجه اتصال به لیگاند فعال شده اند، فعال می شود.

همودایمریزاسیون )اتصال  HER-2 به ( HER-2 و هترودایمریزاسیون )اتصالHER-2  به ( HER-3  به اتوفسفوریلیشن تیروزین دمین سیتوپلاسمی منجر شده که سبب فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی شامل MAPK[1]،  PI3K[2] و PKC[3] می شود که در نتیجه آن سلول ها تمایز و تکثیر می یابند. هترودایمر HER2-HER3  قویترین محرک مسیر سیگنالینگ داخل سلولی و مهمترین تنظیم کننده رشد و بقای سلول است. دایمرزاسیون HER-2 سبب تجزیه شدن فاکتور مهار کننده سیکل سلولی (P27) شده منجر به پیشرفت سیکل رشد سلول می شود.

سلول های نرمال 2 کپی از ژن HER-2 دارند در حالیکه  سلول های توموری پستان می توانند 50-25 کپی از ژن HER-2 را دارا باشند که منجر به افزایش 100-40 برابری این پروتئین و ارائه 2 میلیون رسپتور HER-2 در سطح سلول توموری
می شود. مطالعات نشان داد که تکثیر و  بیان بیش از اندازه ژن HER-2 در سرطان های دیگر از جمله معده، مری، تخمدان، و اندومتر نیز دیده می شود.

روش مرجع: IHC (Immunohistochemistry)

روش ارجح: Real-time polymerease chain reaction (PCR)  Detection of DNA amplification based on

سایر روشها:Fluorescence in situ hybridization(FISH) ،Chromogenic in situ hybridization(CISH)  ،

Silver in situ hybridization(SISH)

مقادیر طبیعی:  برابر با ژن رفرانس(Reference gene)

مقادیر مرجع:

مطالعات انجام شده در سراسر جهان نشان داد که تکثیر و بیان بیش از اندازه HER-2 با چندین سرطان در انسان مرتبط است که این میزان در بیماران مبتلا به سرطان پستان 30-15%، سرطان معده 30-10 % و در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان30-20% گزارش شده است. در مطالعات انجام شده در ایران، تکثیر و بیان بیش از اندازه HER-2 با روش های مختلف در بیماران مبتلا به سرطان پستان 50-23 % گزارش شده است.

میزان تکثیر و بیان  HER-2 با اندازه تومور، مرحله پاتولوژیک بیماری، متاستاز گره لنفاوی، آنوپلئویدی و فاکتورهای افزایش دهنده تکثیر سلول های توموری در ارتباط است. مطالعات انجام شده در 704 بیمار مبتلا به سرطان پستان نشان داد که عود بیماری در زنانی با تکثیرو بیان بیش از اندازه HER- 2 5/9، برابر بیشتر از زنانی است که بیان HER-2  در آنها نرمال می باشد. بیمارانی با بیان  بیش از اندازه HER-2 دوره زندگی کوتاهتری دارند و میزان تکثیر و افزایش HER-2 با میزان پاسخ بیمار به شیمی درمانی در ارتباط است. امروزه رژیم درمانی بیماران مبتلا به سرطان پستان، با توجه به وضعیت ژن HER-2 انتخاب می شود. آنتی استروژن ها از قبیل Tamoxifen به طور گسترده ای در درمان بیماران مبتلا به سرطان پستان که از نظر استروژن رسپتور مثبت هستند بکار می رود. بیماران دریافت کننده Tamoxifen که سطح بالایی از HER-2 و AIB-1 را بیان می کنند اغلب به Tamoxifen مقاوم هستند.

موسسه American Society of Clinical Oncology(ASCO) و دانشگاه College of American Pathologists(CAP) دو روشIHC و FISH را جهت بررسی وضعیت HER-2 مورد تایید قرار داده اند. براساس روش IHC بیان بیش از اندازه پروتئین HER-2 بصورت +3، بینابینی +2 وموارد منفی +1 گزارش می شود که موارد بینابینی باید با روش FISH مورد بررسی قرار گیرد. با توجه به زمان بر بودن و گران بودن، زمان فیکساسیون، نوع ماده فیکس کننده، تکرار پذیری پایین و شرایط آماده سازی نمونه، روش FISH و IHC با مشکلاتی مواجه هستند. مطالعات نشان داد که آنالیز مولکولی مثل Real-time PCR  یک تکنیک موثر، سریع ، تکرار پذیر ، مقرون به صرفه و قابل استاندارد سازی است که توانایی آنالیز همزمان چندین نمونه را دارد و می تواند بعنوان روش جایگزین مورد استفاده قرار گیرد. در این تکنیک، ژن HER-2 بصورت همزمان با ژن های رفرانس تکثیر می یابند. این ژنها تغییرات کمی در تعداد کپی را در سلولهای سرطانی نشان می دهند. با مقایسه نسبت HER-2  به ژن رفرانس  با استفاده از تکنیک Real-time PCR می توان تکثیر HER-2 را مورد ارزیابی قرار داد.

عوامل مداخله گر :

  • هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
  • نمونه گیری و جداسازی پلاسما یا سرم در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
  • فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR، برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید از هم جدا باشند.

توضیحات:

  • تکثیرHER-2 DNA در تمامی افراد سالم مثبت می شود اما تکثیر بیش از اندازه آن سبب بروز مشکل در بیماران می شود که میزان آن باید نسبت به ژن رفرانس سنجیده شود.
  • تست Real-time polymerease chain reaction (PCR) بدلیل سریع بودن، مقرون به صرفه بودن و تکرارپذیری بالای آن تست بهتری نسبت به IHC می باشد.

پاسخ دهید