معماری

آزمایش MTHFR PCR

نام اختصاری: MTHFR PCR

سایر نام ها: ء)

MTHFR C677T Mutation Analysis, Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) PCR, MTHFR Mutation Detection by PCR, 5,10 Methylenetetrahydrofolate Reductase, C677T point mutation, A223V Gene Mutation, Methylenetetrahydrofolate reductase C677T Point Mutation, MTHFR Deficiency thermolabile type reductase C677T point mutation

بخش انجام دهنده: بیولوژی مولکولی (Department of Molecular Biology)

نوع نمونه قابل اندازه گیری: خون محیطی

حجم نمونه مورد نیاز: 5 ml

شرایط نمونه گیری:

  1. نیاز به ناشتایی نمی باشد.
  2. نمونه گیری باید در شرایط استریل انجام شود.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. از ظرف های مخصوص و یکبار مصرف برای جمع آوری نمونه استفاده شود.
  2. برای جمع آوری خون از لوله های استریل حاوی ماده ضد انعقاد EDTA یا سیترات استفاده شود.
  3. پس از نمونه گیری باید سرنگ و سر سرنگ در یک سطل ایمنی (Safety Box) جمع آوری گردیده و سپس سوزانده شود.
  4. پس از گرفتن نمونه خون باید لوله حاوی نمونه سانتریفیوژ شود و در ادامه پس از دور ریختن پلاسما، بافی کت طبق دستورالعملِ جداسازیِ بافی کت جدا شده و به حجم های کوچک تقسیم شود و سپس در فریزر قرار گیرد و تا انجام مراحل بعدی که مربوط به استخراج DNA و PCR می باشد، در ºC20- نگهداری شود.
  5. نمونه مناسب باید حاوی یک تا 10 میلیون گلبول سفید در هر 200 میکرولیتر باشد.
  6. محل نمونه گیری از لحاظ خونریزی بررسی شود.
  7. در صورت نمونه گیری در خارج از آزمایشگاه، نمونه باید در شرایط خنک و طی کوتاه ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال شود (خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری کرد ولی برای نگهداری نمونه در زمان های طولانی تر لازم است از روشی که در شماره 4 همین بند توضیح داده شد، تبعیت شود).
  8. سطوح کار باید همواره قبل از شروع و پس از پایان کار با دستمال آغشته به الکل 70% و یا وایتکس10% تمیز شود.

موارد عدم پذیرش نمونه:

  1. جمع آوری نمونه ها در شرایط غیر استریل.
  2. سرم، نمونه های فریز شده، نمونه های منعقد شده یا به شدت همولیز شده.
  3. نمونه های جمع آوری شده در ظروف حاوی مواد ضد انعقاد غیر از EDTA (هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر سبب مهار PCR می شود لذا، از نمونه های هپارینه و نیز نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نمی توان استفاده کرد).

شرایط نگهداری:

  1. طی چند ساعت اولیه پس از نمونه گیری باید بافی کتِ نمونه های مورد استفاده جدا سازی شده و به حجم های مورد نیاز تقسیم شود و در دمای ºC20-  قرار داده شود و از ذوب و فریز مکرر آنها تا زمان انجام مراحل بعدی آزمایش خودداری شود.
  2. جهت حمل و نقل نمونه لازم است نمونه در شرایط خنک حمل شود ولی باید از یخ زدگی آن جلوگیری نمود.
  3. خون کامل را می توان حداکثر تا 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری و به آزمایشگاه منتقل کرد.

کاربردهای بالینی:

ü     آنالیز مستقیم موتاسیون MTHFR C677T در بیماران مبتلا به اختلالات شریان کرونری، نقص میوکارد حاد، بیماری شریان عروق محیطی، سکته مغزی (stroke) و ترومبوآمبولیسم سیاهرگی که سطوح افزایش یافته ای از هموسیستئن یا متیونین غیرطبیعی دارند.

ü     ردیابی جهش MTHFR C677T در خانم هایی با سابقه سقط های مکرر.

ü     سرعت و حساسیت بالا در تشخیص اختصاصی جهش

ü  در دسترس بودن و سادگی نمونه مورد نیاز (5 میلی لیتر خون محیطی جهت انجام این تست کافی است)

اطلاعات تکمیلی:

MTHFR نام اختصاری آنزیم متیلن تترا هیدروفولات ردوکتاز می باشد که نقش محوری در متابولیسم فولات، متیونین و هموسیستئن دارد. هموسیستئن پلاسما یک آمینو اسید بالقوه سمی است که افزایش آن به علت اثرات پاتولوژیک منفی که بر روی آندوتلیوم عروق، آتروژنسیس (رسوب پلاک های چربی در سطح داخلی سرخرگ قلب) و فعالیت فاکتورهای انعقادی V و  VIIIمی گذارد، منجر به افزایش سطح ترومبین، تجمع پلاکت ها و در نتیجه ترومبوز وریدی می شود. هموسیستئین با ایجاد جراحتهای بسیار کوچک در سطح سلولهای آندوتلیال، سبب آغاز فرآیند انعقاد می‌شود و در نتیجه به عنوان مهمترین مارکر بیماریهای عروق کرونر، مغزی و محیطی شناخته شده است. بنابراین با تبدیل این آمینو اسید به متیونین در بدن اثرات سمی آن خنثی می شود.

ژن  MTHFRروی بازوی کوتاه کروموزوم شماره یک قرار دارد. موتاسیون در این ژن سبب می شود که عملکرد این آنزیم کاهش یابد. بیش از 50 واریانت MTHFR وجود دارد اما دو واریانت اصلی، واریانت هایC677T  (جهش در موقعیت نوکلئوتیدی 677 و تبدیل سیتوزین به تیمین) و A1298C (جهش در موقعیت نوکلئوتیدی 1298 و تبدیل آدنین به سیتوزین) هستند، که معمولا در تست های آزمایشگاهی روتین انجام می شود. جهش C677T باعث جا به جا شدن آمینو اسید آلانین در موقعیت 223 توالی آمینو اسیدی آنزیم به آمینو اسید والین می شود و جهش A1298C سبب تبدیل کدون اسید گلوتامیک به کدون آلانین می شود. واریانت C677T با بیماری کاردیوواسکولار زودرس (early cardiovascular disease) و سکته مغزی(stroke)  در ارتباط می باشد و واریانت A1298C با تعدادی از بیماریهای مزمن مثل فایبرومایالجیا (fibromyalgia) و افسردگی(depression)  در ارتباط است.

افراد هموزیگوت ژن C677T در نوزادان با افزایش خطر ابتلاء به نقص لوله عصبی spina bifida)) همراه است. در افراد هتروزیگوت که دارای دو آلل C677T و A1298C می باشند نیز خطر افزایش ابتلا به نقص لوله عصبی وجود دارد. جهش در ژن MTHFR همچنین می تواند با سقط جنین مرتبط باشد. در سقط مکرر فاکتورهای ریسک متعددی دخالت دارند و عوامل ژنتیکی به خصوص فاکتور های ترومبوفیلی (لخته دوستی) به عنوان یکی از دلایل سقط مکرر می توانند مطرح باشند زیرا سلامت جنین ارتباط مستقیم با گردش خون مادر دارد و هر عاملی که باعث اختلال در این ارتباط شود می تواند برای جنین زیان آور باشد. به نظر می رسد که ایجاد لخته نابجا یا ترومبوز می تواند در مویرگ های جفت باعث اختلال در روند تبادلات مواد بین مادر و جنین شده و نهایتاً منجر به سقط گردد.

روش مرجع: PCR

روش ارجح: Real Time PCR

سایر روشها:  ARMS-PCR, PCR–RFLP, allele-specific PCR

مقادیر مرجع: منفی (Negative)

تفسیر:

جهش C677T در ژن MTHFR سبب تولید آنزیم با فعالیت کمتر می‌شود که افزایش سطح هموسیستئن خون را به همراه دارد. افزایش هموسیستئین به سطح بیشتر از 50 میکرومول/ لیتر منجر به ترومبوآمبولی و آترواسکلروز در دوران کودکی شده و در زنان باردار، احتمال ابتلاء جنین به نقص لوله عصبی و سقط جنین را افزایش می دهد. این نقص به صورت اتوزوم مغلوب به ارث می رسد.

پلی مورفیسم‌ C677T در ژن MTHFR را می توان به کمک آزمایش Real Time – PCR ردیابی کرد. در این روش ابتدا قطعه ژن مورد نظر با استفاده از پروب و پرایمرهای اختصاصی تکثیر می‌شود و نتایج بر اساس منحنی های ثبت شده توسط دستگاه به شرح زیر بررسی می شود.

  1. در صورتی که نمونه فقط دارای یک قله در ناحیه مربوط به ژن سالم باشد، یعنی هر دو ژن او طبیعی است و از نظر‌MTHFR C677T منفی است و هموزیگوت سالم محسوب می شود.
  2. در صورتی که نمونه فقط دارای یک قله در ناحیه جهش یافته باشد، یعنی هر دو ژن او جهش یافته است و از نظر‌MTHFR C677T مثبت است و هموزیگوت بیمار محسوب می شود.
  3. در صورتی که نمونه دارای یک قله در ناحیه مربوط به ژن جهش یافته و یک قله در ناحیه مربوط به ژن سالم باشد، یعنی یکی از ژنهای او طبیعی و دیگری معیوب است و از نظر‌MTHFR C677T مثبت است و هتروزیگوت محسوب می شود.

آنزیم MTHFR در افراد هموزیگوت بیمار، 30 درصد عملکرد و در افراد هتروزیگوت 65 درصد عملکرد را در مقایسه با افراد نرمال دارد. این افراد به ویژه هموزیگوت های بیمار به شرط دریافت فولات کافی، دارای سطوح طبیعی هموسیستئین در خون خواهند بود ولی اگر فولات کافی دریافت نکند، میزان هموسیستئین در آنها افزایش یافته و در خطر عواقب مربوط به افزایش هموسیتئین خون قرار می گیرند و لذا انجام تست تشخیصی برای ردیابی جهش و شروع اقدامات درمانی مناسب امری ضروری است.

عوامل مداخله گر :

  1. هپارین در مقادیر بالا در این آزمایش تداخل ایجاد می کند.
  2. نمونه گیری، جداسازی بافی کت و انجام سایر مراحل آزمایش در شرایط غیر استریل می تواند منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب گردد.
  3. برای جلوگیری از ایجاد نتایج مثبت کاذب باید فضاهای مربوط به استخراج DNA، آماده سازی مواد مورد نیاز واکنش و فضای افزودن نمونه DNA به لوله PCR از هم جدا باشند.

توضیحات:

در این تست نیازی به استفاده از کنترل داخلی نمی باشد زیرا هر فرد حامل ژن طبیعی یا جهش یافته MTHFR است و در صورت هتروزیگوت بودن نیز حامل هر دوی آنها خواهد بود. بنابراین همیشه باید نتیجه آزمایش حداقل برای یکی از انواع طبیعی یا جهش یافته ژن مثبت باشد. در صورتی که فرد برای هر دو نوع طبیعی و جهش یافته منفی باشد، آزمایش باید تکرار گردد.

پاسخ دهید