معماری

آزمایش Sickling Test

HbS ناشی از جابه‏جایی یک اسیدآمینه منفرد (والین به جای گلوتامیک اسید) در موقعیت ششم زنجیرة بتا – گلوبین مولکول هموگلوبین است. حالت هموزیگوت منجر به بیماری سیکل سل می‏شود که با موربیدیتی و مورتالیتی قابل توجهی همراه است .حالت هتروزیگوت موجب سیکل تریت  (صفت داسی شدن) می‏شود که به طور معمول موربیدیتی ناچیزی داشته یا بدون موربیدیتی است. بیماری داسی طیفی از شدت بالینی را نشان می‏دهد که بخشی از آن مرتبط با فعال شدن انعقاد از طریق از دست رفتن عدم تقارن طبیعی فسفولیپید غشاء و نمایان شدن فسفاتیدیل بر سطح سلول است. فسفاتیدیل سرین سطحی، یک جایگاه لنگراندازی  (docking site) برای پروتئین‏های هموستاتیک بوده که منجر به افزایش فعالیت پیش انعقادی (پروکواگولانت) می‏شود.
فقر آهن غلظت متوسط کورپوسکولار داکسی هموگلوبین  S را پایین آورده و منجر به کاهش تمایل به داسی شدن و شدت همولیز می‏شود. در بیماران مبتلا به سیکل­سل‏ تریت احتمال ایسکمی سگمان قدامی چشم در جراحی دکولمان شبکیه وجود دارد.
تمایز بین بتاتالاسمی  HbS– و آنمی سلول داسی همیشه براساس بالینی، هماتولوژی یا الکتروفورز امکان­پذیر نمی‏باشد. افتراق می‏تواند به بهترین وجهی براساس تاریخچه فامیلی یا روش‏های پاتولوژی مولکولی صورت گیرد.
پیشنهاد می‏شود بیمارانی که در غربالگری سلول داسی مثبت می‏شوند تحت بررسی بیشتر با الکتروفورز سلولز استات یا ژل آگار درpH:8.6 ، الکتروفورز ژل سیترات آگار در 6  pH:، مطالعات HbF  و بررسی تاریخچه خانوادگی قرار گیرند.

نام اختصاری: Hb.S

سایر نام ها: غربالگری سلول داسی، تست دی‏تیونایت (Dithionite)؛ تست حلالیت ایتانو (Itano)؛ تست متابی­سولفیت؛ تست حلالیت سلول داسی، تست غربالگری هموگلوبین S، تست سیکل سل، سیکل دکس.

Hemoglobin S Screen, Blood; Hemoglobin Solubility; Sickle Screen; Sickledex; Sickling Test,

بخش مورد انجام: هماتولوژي

نوع نمونه قابل اندازه گیری : خون كامل حاوی ضد انعقاد (EDTA، هپارین، ACD)

حجم نمونه مورد نیاز: 2ml

شرایط نمونه گیری:  نیاز به ناشتایی نمی باشد.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. 2 میلی لیتر خون وریدی در ویالهای با درب بنفش جمع آوری گردد.
  2. پس از نمونه گیری، موضع را از نظر خونریزی بررسی نمایید.
  3. ویال نمونه خون را به آرامی سرو ته کرده تا به خوبی با ماده ضدانعقاد مخلوط گردد.
  4. از سانتریفیوژ نمودن نمونه اجتناب نمایید.
  5. دانستن سن بیمار و سابقه تزریق اخیر خون حائز اهمیت می باشد.
  6. فرمی از تاریخچه بالینی هماپاتولوژی و انکواوژی مولکولی  بیماران را درخواست نموده و مستند نمایید.

موارد عدم پذیرش نمونه:

ü     نمونه لخته شده

ü     هموليز شدید نمونه

ü        نمونه های بدون برچسب یا با برچسب اشتباه

ü      استفاده از ویال های نامناسب و همچنین عدم تناسب خون با ماده ضد انعقاد.

شرایط نگهداری: نمونه را پس از نمونه گیری در یخچال نگاه دارید. پایداری نمونه در دمای یخچال 7 روز می باشد.

اطلاعات تکمیلی:

در بررسی اسمیر خون محیطی، گلبول­های قرمز داسی شده همراه با یافته‏های کلاسیک دیگر شامل شیستوسایت‏ها، گلبول­های قرمز هسته‏دار، لوکوسیتوز، سلول­های تارگت و سایر اختلالات دیگر، بسته به درجه هیپوکسی و مرحله بیماری دیده می‏شوند (مثل اجسام Howell-Jolly در صورت آتروفی طحال). در مبتلایان به سیکل­سل ‏تریت مشاهده معمول اسمیر خون محیطی به نظر نمی‏آید نقشی در شناسایی مطمئن سلول­های غیرطبیعی داشته باشد.

کاربردهای بالینی:

    رديابي هموگلوبين داسي شكل (Sickling)

     ارزيابي كم خوني هموليتيك

     ارزيابي كم خوني ارثي تشخيص داده نشده با اختلالات مورفولوژيك شبه داسي در گسترش خون محيطي

روش مرجع:-

روش ارجح: الكتروفورز Hb

سایر روش ها : آزمایش سیلکلینگ (متابی سولفیت سدیم)، آزمایش انحلال پذیری(دی تیونات یا هیدروسولفیت سدیم)، تست حلالیت ایتانو ، ایمنواسی.

مقادیر طبیعی: در حضور سلول داسی در گستره خون محیطی (منفی)

تفسیر: تست‏های غربالگری برای ردیابی کم خونی سلول داسی و موارد مرتبط با آن که شامل هموگلوبین S (مثل SC، SD، سیکل تالاسمی و غیره) می‏باشند به کار برده می‏شود. تست حلالیت داسی براساس کاهش حلالیت هموگلوبین S در یک بافر فسفات غلیظ همراه با ردیابی استاندارد شدة توربیدیتی حاصله می‏باشد. اگر تست غربالگری داسی مثبت باشد، آنگاه باید مطالعات تأییدی (مثل الکتروفورز هموگلوبین) انجام شوند.

در گستره خون محیطی مبتلایان به بیماری داسی، گلبول های قرمز داسی شکل مشاهده نمی شود، مگر آنکه هیپوکسی وجود داشته باشد. در آزمون سلول داسی ماده ای داکسیژنه کننده ( مانند متابی سولفیت سدیم2%) به خون بیمار می افزایند. چنانچه حداقل 25% هموگلوبین از نوع S باشد، سلولها هلالی یا داسی می شوند و آزمایش مثبت می گردد. اگر داسی نشوند آزمون منفی می گردد. در آزمایش حلالیت (مانند سیکل دکس) دیتیونات به خون بیمار افزوده می شود. بدین ترتیب HbS رسوب می کند. آزمون منفی نشانگر آن است که بیمار فاقد HbS  بوده و یا سطح آن بسیار پایین است. این آزمایشها توانایی افتراق میان بیماری سلول داسی از صفت آن را ندارند. در بیماری سلول داسی 100%-80 % هموگلوبین از نوع S است. اما در صفت آن تنها 40%-20% هموگلوبین از نوع S می باشد.

محدودیت ها و عوامل مداخله گر:

  • استفاده از متابی‏سولفیت یا معرف‏های تست حلالیت داسی که تاریخ مصرف آنها گذشته ممکن است سبب نتایج منفی کاذب شود.
  • انتقال خون در طی 4-3 ماه قبل از انجام آزمون، سلول داسی می تواند سبب نتایج منفی کاذب شود. زیرا هموگلوبین اهداکننده موجب رقیق شدن HbS غیر طبیعی در گیرنده خون می شود.
  • غلظت کم HbS در سلولها (بعد ار انتقال خون یا نوزادان)، نسبت پایین HbS در هر سلول (آلفا تالاسمی و فقر آهن)، آنمی (هموگلوبین کمتر از 8)، غلظت بالای هموگلوبین F (هموگلوبین جنینی) باعث کاهش مقدار HbS در شرایط داخل بدن (invivo) خواهد شد.
  • تخریب حاصل از عوامل احیاء کننده در شرایط آزمایشگاهی (invitro) باعث کاهش مقادیر HbS می گردد.
  • نتیجه آزمون در نوزادان کمتر از سه ماه ممکن است منفی کاذب شود، زیرا حتی در نوزادان مبتلا به سلول داسی مقدار زیادی HbF در گلبول های قرمز، در این سن وجود دارد. HbF داسی نمی شود. پس از سن 6 ماهگی HbS افزایش می یابد و تنها در آن هنگام است که آزمون مثبت خواهد شد.
  • داروهای فنوتیازینی موجب نتایج منفی کاذب می شوند.
  • موارد مثبت کاذب: پلی‏سایتمی، حجم زیاد خون در مقایسه با مقدار معرف، وجود مقادیر زیاد nRBC (گلبول قرمز هسته دار) در گستره خون محیطی، بعضی اشکال هیپرگلوبولینمی مثل میلوم / والدن اشتروم یا کرایوگلوبولینمی (در صورت شک به این موارد باید تست با گلبول قرمز شسته شده تکرار گردد)، هموگلوبین غیرطبیعی (هموگلوبینوپاتی) دیگر شامل HbI، بارت، آلکساندرا، Porto Alegre، Memphis/S و شش واریانتی که جهش ثانویه در ژن βS دارند.
  • برخی از انواع نادر هموگلوبین ها (مانند هموگلوبین C- هارلم، S/O-Arab ، S/New York ، صفت C-Georgetown ) نیز می توانند سلول را داسی شکل نمایند.
  • استفاده از متابی‏سولفیت به مقدار زیاد، منجر به واکنش مثبت کاذب خواهد شد.
  • ممکن است افتراق پویکیلو سایت‏ها از سلول­های داسی واقعی سخت باشد.
  • در شرایط invivo ناهنجاریهای هموگلوبین ناپایدار ( پس از برداشت طحال) هیپرگلبولینمی، هیپرلیپیدمی باعث افزایش مقادیر HbS می گردد.

توضیحات:

  • تست متابی‏سولفیت شامل شناسایی میکروسکوپی گلبول­های قرمز داسی شده است که به علت داکسیژناسیون هموگلوبین، پس از مواجهه با عامل احیاءکننده (متابی­سولفیت سدیم) تشکیل می‏شوند.
  • روش‏های غربالگری داسی از تست حلالیت Itano تکامل یافته‏اند. اساس این تست‏ها بر ردیابی چشمی توربیدیتی ناشی از کاهش حلالیت هموگلوبین S احیاء شده در یک محلول غلیظ بافر فسفات می‏باشد.
  • این آزمون تنها یک آزمایش غربالگری است و حساسیت آن بر حسب روش مورد استفاده آزمایشگاه متغییر است. تشخیص قطعی بیماری یا صفت سلول داسی با الکتروفورز هموگلوبین مشخص می شود که در طی آن HbS را می توان شناسایی و اندازه گیری نمود.
  • ظهور HbS بطور ژنتیکی با تأخیر صورت می‏گیرد و معمولاً تا سه ماهگی به قدری نیست که تست غربالگری را مثبت کند (یعنی حدود 25%) و سطوح ماگزیمم تا 6 ماهگی حاصل نخواهد شد.
  • تست‏های حلالیت و سدیم متابی‏سولفیت بعید است تا 6 ماهگی بطور قابل اعتمادی مثبت شوند. کودکانی که شواهد ابتدایی SS، SC، SD، Sβ+ یا Sβ˚ دارند باید در عرض 8-6 هفته پس از تولد مجدداً تست شوند.

پاسخ دهید