معماری
الایزا ریدر

آشنایی با سیستم الایزا ریدر و خوانش

الایزا ریدر یا خوانشگر الایزا که به اسامی میکروپلیت ریدر و خوانشگر میکروپلیت فتومتریک نیز معروف است ، یک اسپکتروفتومتر تخصصی بوده که به منظور قرائت نتایج تست الیزا طراحی شده است. این وسیله به منظور تعیین حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن های اختصاصی در نمونه ها به کار می‌رود. این تکنیک بر اساس تشخیص یک آنتی‌ژن یا آنتی بادی ها روی یک سطح جامد به صورت مستقیم یا ثانویه به کمک آنتی بادی های نشاندار و ایجاد محصولاتی استوار است که می‌توانند توسط اسپکتروفتومتر خوانده شوند. واژه الایزا ELISA ، اختصاری از کلمات Enzyme-Linked  Immuno  sorbent  Assay است.

کاربرد میکروپلیت ریدر
مــیــکـــروپــلــیـــت ریــدر بــرای خــوانــدن نـتــایــج تست‌های الایزا مورد استفاده قرار می گیرد. این تـکـنـیــک کــاربــردی مـسـتـقـیــم در ایـمـنــولــوژی و سـرولـوژی دارد. از مـیـان کـاربـردهـای دیگر این وسیله به تایید حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن‌های یک عامل عفونی در یک ارگانیزم ، آنتی بادی های یـک واکـسـن یـا اتـوآنـتـی بـادی هـا بـرای مـثال در آرتریت روماتوئید می توان اشاره کرد.

اصول کار
الایـزا ریـدر یـک اسپکتـروفتـومتـر اختصـاصی است. بر خلاف اسپکتروفتومترهای معمولی که قرائت جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج ها تسهیل می کنند ، الایزا ریدر دارای فیلترها یا گریتینگ های انکساری بوده که گستره طول موج ها را محدود کرده و معمولا بین ۴۰۰ تا ۷۵۰ نانومتر  عمل می کنند. برخی از الایزا ریدرها در گستـره مـاوراء بنفـش عمـل کرده و قرائت را در مـحــدوده ۳۴۰ تــا ۷۰۰ نـانـومتـر انجـام مـی دهنـد. سـیـستم نوری موجود در این دستگاه ها توسط تعدادی از کارخانه ها با استفاده از فیبرهای نوری به منظور تامین نور جهت چاهک های حاوی نمونه در میکرو پلیت طراحی می شود. ابتدا یک شعاع نوری از نمونه ای که دارای قطری بین ۱ تا ۳ میلی متر است عبور کرده و سپس یک سیستم آشکار کننده ، نور عبوری از نمونه را آشکار و تقویت می کند. در مرحله بعد ، سیگنال مربوط به جذب نوری نمونه‌ها ثبت شده و سیستم خوانشگر نیز آن را به اطلاعاتی تبدیل می کند که سبب تفسیر نتایج تست می شوند. برخی از الایزا ریدرها با استفاده از سیستم های شعاعی نوری دوتایی کار می کنند.
نمونه های مورد آزمایش در پلیت هایی که به این منظور طراحی شده اند و دارای تعداد خاصی چاهک هستند ، قرار می گیرند. پلیت های ۸ ستونی همراه با ۱۲ ردیف که در مجموع ۹۶ چاهک را تشکیل می دهند ، رایج تر از بقیه هستند. برای کاربردهای اختصاصی تر ، تعداد چاهک ها افزایش می یابد که در برخی موارد تا پلیت های ۳۸۴ چاهکی را نیز شامل می شود. افزایش تعداد چاهک ها به منظور کاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعیت سنسور نوری الایزا ریدر بر اساس نوع کارخانه سازنده متغییر است ؛ به طوری که در برخی موارد ممکن است در بالای پلیت حاوی نمونه و گاهی نیز مستقیما در زیر پلیت قرار گیرد. امروزه میکرو پلیت ریدرها دارای کنترل هایی هستند که به وسیله میکروپروسسورها تنظیم شده اند.

وسایل لازم جهت انجام تکنیک الایزا  
جهت انجام آزمایش الایزا تجهیزات زیر مورد نیاز است:
۱- الایزا ریدر
۲- میکرو پلیت واشر (شستشو دهنده چاهک ها)
۳- سیستم توزیع کننده مایع (در این مورد ممکن است از پیپت ها چند کاناله استفاده شود)
۴- انکوباتور

تجهیزات مورد نیاز در انجام تست های الایزا
مراحل مکانیکی انجام تکنیک الایزا
یک تست الیزا به طور رایج شامل مراحل زیر است:
۱- شستشوی اولیه پلیت که ممکن است با استفاده از میکرو پلیت واشر انجام شود.
۲- استفاده از یک توزیع کننده مایع (دیسپنسر) یا پیپت چند کاناله.
۳- پلیت در انکوباتور قرار داده می شود که دارای دمای کنترل شده بوده و واکنش ها در آن محل انجام می شوند.
بسته به نوع تست ، مراحل ۱ ، ۲ و ۳ ممکن است چـنـدین بار تکرار شوند تا این که معرف‌های اضافه شده ، واکنش ها را کامل کنند.
سـرانـجـام وقـتـی تـمـام مـراحـل انـکوباسیون کامل شد ، پلیت به الایزا ریدر منتقل شده و سپس بـا قـرائـت جـذب نـوری نمونه ها ، نتیجه آن ها مشخص می شود.

مراحل بیوشیمیایی تکنیک الیزا
۱- چــــاهــــک هــــای مــــوجــــود در پــلــیــــت بــــا آنـتــی‌بــادی‌هــا و آنـتــی ژن هــا پــوشـیـده (Coat) می‌شوند.
۲- نـمــونــه هـا ، کـنـتـرل هـا و اسـتـانـداردهـا بـه چاهک‌ها اضافه شده و در دمای اتاق یا ۳۷ درجه سـانتیگـراد بـرای یـک مـدت زمـانی معین ، طبق دستـورالعمـل تست انکوبه می شوند. در طول انکـوباسیون ، بسته به حضور یا عدم حضور و مقدار آنتی ژن یا آنتی بادی موجود در نمونه ، آنتی ژن نمونه به آنتی بادی کوت شده به پلیت یا آنتی بادی موجود در نمونه به آنتی ژن Coat شده در پلیت باند می شود.
۳- پـــس از انـکـوبـاسـیــون ، آنـتــی ژن‌هـا یــا آنـتی‌بـادی‌هــای آزاد ، شـستشـو داده شـده و بـا اسـتـفـــاده از مـیـکــرو پـلـیــت واشــر و یــک بــافــر شستشوی مناسب ، برداشته می شوند.
۴- در مرحله بعد ، یک آنتی بادی ثانویه به نام کونژوگه اضافه شده که حاوی آنزیمی است که به منظور ایجاد یک تغییر رنگی ، با یک سوبسترا واکنش خواهد داد.
۵- ســـپــــس یــــک دوره زمــــانــــی ثــــانــــویــــه از انـکــوبــاسـیـون شـروع مـی شـود کـه در طـی آن ، کـونـژوگـه بـا کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی در چاهک ها پیوند برقرار خواهد کرد.
۶- پس از انکوباسیون ، یک دوره شستشوی جدید انجام می شود که سبب برداشت کونژوگه متصل نشده از چاهک ها خواهد شد.
۷- در مرحله بعد ، سوبسترا اضافه می شود. آنـزیـم بـا سـوبستـرا واکنش خواهد داد و سبب تغییر رنگ محلول خواهد شد. این واکنش نشان خواهد داد که چه مقدار کمپلکس آنتی‌ژن- آنتی بادی در پایان تست وجود خواهد داشت.
۸- وقتی که زمان انکوباسیون کامل می شود، یک معرف برای توقف واکنش آنزیم- سوبسترا به آن اضافه شده که از تغییرات بیشتر در شدت رنگ ایجاد شده، جلوگیری می‌کند. این معرف عموما یک اسید رقیق است.
۹- در پایان ، پلیت بوسیله الایزا ریدر خوانده می شود. نتایج حاصله برای تعیین مقادیر اختصاصی یا حضور آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها در نمونه به کار برده می شوند.
تــوجـه: بـرخـی از چـاهـک هـا بـرای استـانـداردهـا و کنتـرل هـا استفـاده مـی شـونـد. استانداردها برای تعریف نقاط cut-off به کار برده می شوند. استانداردها و کنترل ها مـقـادیر معینی هستند و برای اندازه گیری نتایج تست و ارزیابی اطلاعات در مقابل غلظت‌های مشخصی برای هر کنترل به کار برده می شوند. فرایند توصیف شده در بالا عمومی است ؛ اگرچه بسیاری از تست های الایزا وجود دارند که همراه با مراحل یا متغیرهای اختصاصی هستند.

نصب تجهیزات 
به منظور عملکرد صحیح الایزا ریدر ، نکات زیر لازم است تا رعایت شود:
۱- یک محیط تمیز و عاری از گرد و غبار
۲- یک میز کار ثابت و به دور از تجهیزاتی از قبیل سانتریفوژ ، شیکر و … که سبب لرزش آن می شوند. این میز باید دارای اندازه مناسبی باشد ، به طوری که در کنار الایزا ریدر ، فضای کاری مناسبی وجود داشته باشد. تجهیزات تکمیلی مورد نیاز برای انجام تکنیک توصیفی بالا عبارتند از: واشر ، انکوباتور ، دیسپنسر و کامپیوتر همراه با وسایل جانبی آن.
۳- یک منبع تغذیه الکتریکی که سازگار با استانداردها و معیارهای کشور باشد. در کشورهای آمریکایی به طور مثال ، عموماً فرکانس های ۶۰ هرتز و ۱۱۰ ولت استفاده می‌شود ؛ در حالی که در نواحی دیگر از جهان ۲۲۰ تا ۲۴۰ ولت و ۵۰ تا ۶۰ هرتز به کار برده می شود.

کالیبراسیون الایزا ریدر
کالیبراسیون الایزا ریدر یک مرحله اختصاصی است که باید توسط یک تکنسین یا مهندس آموزش دیده که به دستورالعمل های سازنده دستگاه آشنایی دارد ، انجام شود. بـرای انجـام کالیبراسیون ، داشتن یک مجموعه از فیلترها که از لحاظ اندازه ، یکسان هستند ، الزامی است. سازندگان این دستگاه ها ، پلیت های کالیبراسیون را برای هر طول موجی که دستگاه به کار می برد فراهم می کنند.
پلیت های کالیبراسیون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوری از قبل تعیین شده (پایین ، متوسط و مقدار بالا) در دامنه اندازه گیری هستند.

برای انجام کالیبراسیون مراحل زیر را باید دنبال کرد:
۱- پلیت کالیبراسیون را روی دستگاه قرار دهید.
۲- یـک خـوانـش کـامـل را بـا پلیـت کـالیبراسیون انجام دهید. مشخص کنید که آیا تفاوت‌هایی در قرائت های به دست آمده از یک چاهک به چاهک دیگر وجود دارد یا خیر. چنانچه اختلافی مشاهده شد ، پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و قرائت را مجددا تکرار کنید تا از اختلافاتی که به خود پلیت نسبت داده می شوند ، جلوگیری کنید. به طور کلی ، اگر نتایج پلیت در دو طول موج به میزانی باشد که انتظار داریم ، گفته می‌شود که دستگاه به کالیبراسیون دیگری احتیاج ندارد.
۳- تأیید کنید آیا خوانشگر به کالیبراسیون احتیاج دارد یا خیر. چنانچه به کالیبراسیون احتیاج دارد ، راهنمایی های رایج کارخانه سازنده دستگاه را برای کالیبراسیون دنبال کنید. تأیید کنید که خطی بودن (linearity) خوانشگر تا حد امکان قابل قبول است.
۴- اگــر دستگـاه حـاوی یـک پلیـت کـالیبـراسیـون نیسـت ، یـک محلـول رنگـی را در چاهک‌های یک پلیت از آن ریخته و فوری نتایج را قرائت کنید. سپس پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهید. اگر هر دو خوانش ها و میانگین مقادیر در هر ردیف یکسان هستند ، خوانشگر کالیبر است.
۵- تایید کنید که خوانشگر به صورت ستون به ستون نیز کالیبر است. یک پلیت تمیز و خالی را  در محل مخصوص قرار دهید و قرائت را انجام دهید. اگر اختلافی بین هر یک از خوانش های میانگین از اولین تا آخرین ستون وجود ندارد، می توان فرض را بر این گذاشت که خوانشگر کالیبر است.

حفظ و نگهداری رایج
الف) ‌نـگـهــداری اســاســی (تـکـرار بـه صـورت روزانه)
۱- مـرور ایـنـکـه سنسورهای نوری هر کانال تـمـیـز هـسـتـنـد. چـنـانـچـه کـثـیـف هـستند ، سطح پنجره‌‌های عبور دهنده نور و سنسورها را با یک برس کوچک تمیز کنید.
۲- تأیید کنید که سیستم نوری تمیز  است.
۳- تأیید کنید که کالیبراسیون خوانشگر کافی اسـت. وقـتـی کـارهـای روزانه شروع می شود ، اجـازه دهـید تا خوانشگر برای مدت ۳۰ دقیقه گرم شود. در مرحله بعد ، قرائت Blank را انجام دهـیـد و سـپـس یـک پـلیت کامل از سوبسترا را قـرائـت کـنـیـد. خـوانـش هـا مـی بـایـست یکسان بـاشند. اگر این طور نبود ، پلیت را چرخانده و قرائت را به منظور تعیین این که آیا اختلاف در پلیت یا در خوانشگر است ، تکرار کنید.
۴- سـیـسـتــم کـشـنــده اتــومــاتـیــک اســلایــدهـا (Automatic drawer sliding system) را بــررسـی کنید که باید نرم و ثابت باشد.

ب) ‌نـگـهـداری بـازدارنـده (تـکـرار هـر سه ماه یکبار)
۱- پـــایـــداری لامـــپ را تـــأیـیــد کـنـیــد. پـلـیــت کالیبراسیون را به کار برده ، قرائت را با فاصله ۳۰ دقیقه مجدداً با همان پلیت انجام دهید. قرائت ها را مقایسه کنید که هیچ تفاوتی نباید میان آن ها مشاهده شود.
۲- سیستم نوری دتکتور و سیستم های نوری را تمیز کنید.
۳- کشنده پلیت (Plate drawer) را تمیز کنید.
۴- مکان قرار گیری هر چاهک را با استفاده از سـیـسـتـم هـای انتشار نور و آشکارکننده تأیید کنید.

اساسا واکنش‌های بین آنتی‌ژن وآنتی‌بادی را می‌توان هم درIn vivo و هم In vitro بررسی نمود و لذا مقوله بررسی واکنش‌های بین آنتی‌ژن وآنتی‌بادی‌، یکی از مهم‌ترین شاخه‌های تحقیقاتی و کاربردی بشمار رفته، بطوریکه گاه نقطه عطفی در این میان پدید آمده و روش جدیدی مطرح گردیده که تا رسیدن به نقطه عطف دیگر و روشی تازه، تحقیقات در جهت اصلاح و بهبود روش قبلی ادامه یافته است. چرا که مسلما هر روشی محاسن و معایب خاص خود را داشته که با توجه به آن گسترش یافته و یا محدود می‌شود؛ اما آنچه که مسلم است، اینست که روش‌های جدید همواره جایگزین روش‌های قبلی نبوده، بلکه به موازات آنها از محدودیت‌های موجود می‌کاهند.

طبقه‌بندی واکنش‌های بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی درIn vitro

اصولا واکنش‌های بین آنتی‌ژن وآنتی‌بادی درIn vitro طی دو مرحله واکنش‌های اولیه وثانویه اتفاق افتاده و بر این اساس دوروش کلی برای بررسی این واکنش‌ها در In vitro وجود دارد:

الف– روش‌های ایمونولوژیک که توانایی نشان دادن اتصال یک مولکول از آنتی‌ژن را به یک مولکول آنتی‌بادی را در مراحل اولیه داشته و لذا مقادیر جزئی از آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را می‌توانند شناسایی نمایند. بنابراین ازحساسیت، ویژگی و پتانسیل خاصی برخوردارند.

ب– روش‌های سرولوژیک که برخلاف روش‌های ایمونولوژیک، توانایی آنها در نمایش واکنش‌های بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی در مقادیر زیادی از آنتی‌ژن و آنتی‌بادی بارز شده و لذا یا تقویت شده واکنش اولیه بین آنتی‌ژن و آنتی بوده و یا اثرات نا شی از چنین واکنش‌هایی را نشان می‌دهند. این گروه از واکنش‌ها را براساس شکل آنتی‌ژن که ممکنست ذره‌ای، محلول، و یا کلوئیدی باشد، بترتیب به انواع آگلوتیناسیون، پرسیپیتاسیون و فلوکولاسیون تقسیم‌بندی می‌نمایند.

تقسیم‌بندی واکنش‌های ایمونولوژیک

با توجه به این که برای انجام واکنش‌های ایمونولوژیک اولا بایستی از یک ماده نشاندار که ممکنست رادیواکتیو، آنزیم یا فلوئورسانس بعنوان ردیاب یا نشانگراستفاده شود، ثانیا براساس این که آنالیت مورد سنجش یعنی آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بایستی با این ماده نشاندار کونژوگه گردد و ثالثا واکنش بین آنتی‌ژ‌ن یا آنتی‌بادی در فاز یا محیط جامد و یا مایع انجام می‌گیرد، واکنش‌های ایمونولوژیک را براساس ترکیب ماده نشاندار، نوع آنالیت نشاندار شده و فاز واکنش تقسیم‌بندی می‌نمایند.

واکنش‌های ایمونولوژیک را براساس نوع ماده نشاندار که ممکنست رادیواکتیو، آنزیم یا فلوئورسانس باشد، به انواع رادیوایمونواسی، آنزیم ایمونواسی و ایمونوفلوئورسانس تقسیم می‌نمایند. بدیهی است که در روش الایزا با توجه به اینکه از آنزیم برای نشاندارسازی استفاده شده است، لذا در واکنش‌های آنزیو ایمونواسی قرار می‌گیرد.

براساس نوع فاز واکنش، واکنش‌های ایمونولوژیک را به دو گروه تقسیم می‌نمایند:

الف– واکنش‌های هموژن که در فاز مایع انجام گرفته و ماده نشاندار در واکنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی دخالت دارد. لذا نیازی به جداسازی و شستشوی مولکول‌های واکنش‌دهنده از مولکول‌های آزاد نیست. این روش معمولا برای شناسایی و اندازه‌گیری داروها و هاپتن‌ها کاربرد داشته و لذا بطور معمول در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی کاربردی ندارند.

ب- واکنش‌های هتروژن که بر خلاف روش‌های هموژن در فاز جامد انجام گرفته، ماده نشاندار در واکنش‌های بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی دخالتی نداشته، بلکه فقط بعنوان ردیاب مورد استفاده قرار می‌‌گیرد. بنابراین جداسازی مولکول‌های واکنش‌کننده از مولکول‌هایی که وارد واکنش نشده‌اند، امری الزامی و ضروری می‌باشد. لازم بذکر است که این واکنش‌ها در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی کاربرد گسترده‌ای داشته و روش الایزا در این گروه قرار می‌گیرد.

براساس نوع آنالیت نشاندار شده که ممکنست آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی با رادیواکتیو، آنزیم و یا فلوئورسانس نشاندار شده باشد، واکنش‌های ایمونولوژیک را نیز به دو گروه تقسیم نموده و لذا از آنجائی که هدف ما بررسی واکنش‌های الایزا می‌باشد، از اینرو انواع واکنش‌های الایزا براساس نوع آنالیت نشاندار شده عبارتست از:

الف – آنزیم ایمونواسی یا EIA (Enzymo Immunometric Assay) که درآن آنتی‌ژن نشاندار شده و آنتی‌بادی به کف چاهک پلیت الایزا چسبیده است. اساس واکنش EIA، رقابت بین آنتی‌ژن نشاندار و آنتی‌ژن آزاد موجود در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی‌بادی چسبیده به کف چاهک می‌باشد (شکل ۱).

از آنجائیکه اساس روش EIA رقابت بوده و رقابت نیز در محدودیت معنا می‌یابد، به این روش، معرف محدود(Restirected Reagent)  نیز می‌گویند. ضمنا از آنجائیکه هر چه میزان آنتی‌ژن موجود در نمونه بیشتر باشد، آنتی‌ژن نشاندار کمتری به آنتی‌بادی متصل می‌گردد، لذا میزان کمپلکس نشاندار با کمپلکس غیر نشاندار مورد سنجش، رابطه معکوس داشته و از اینرو منحنی استاندارد آن سیر نزولی دارد (شکل ۲).

همچنین با توجه به افزودن همزمان آنتی‌ژن آزاد و نشاندار، واکنش یک مرحله‌ای و مستقیم می‌باشد.

ب– ایمونوآنزیمومتریک اسی یا IEMA (Immuno Enzymo Meteric Assay) که درآن آنتی‌بادی بصورت نشاندار بوده و بسته به اینکه هدف سنجش آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی باشد، به روش ساندویچی انجام می‌گیرد. لذا در صورتیکه آنتی‌ژن مورد سنجش باشد، روش را آنتی‌بادی ساندویچ یا Ag Capture و اگر آنتی‌بادی مورد سنجش باشد، روش را آنتی‌ژن ساندویچ یا Ab Capture گویند.

در روش IEMA بدلیل اینکه رقابت وجود نداشته و برای اطمینان از کفایت آنتی‌بادی‌ها برای تشکیل کمپلکس در غلظت‌های بالای آنالیت همواره مقادیر زیادی از آنتی‌بادی‌ها بکار می‌روند، لذا این روش را، معرف مازاد (Excess Reagent ) نیز می‌گویند. در این روش با توجه به اینکه بازاء هر آنالیت یک کمپلکس نشاندار تشکیل می‌گردد، لذا رابطه مستقیم میان آنالیت وکمپلکس برقرار بوده و بنابراین منحنی استاندارد سیر صعودی دارد (شکل ۳).

مزایای روشIEMA  نسبت به EIA

نشاندارسازی آنتی‌بادی بجای آنتی‌ژن در روش IEMA مزایای متدولوژیک زیادی را به ارمغان می‌‌آورد، که برخی از مهمترین آنها عبارتست از:

۱- سهولت نشاندارسازی– با توجه به اینکه درروش EIA مولکول‌های آنتی‌ژن اغلب از جنس هاپتن بوده که مولکول‌هایی با جرم مولکولی کمتر از هزار دالتون می‌باشند، لذا محدودیت گروه‌های عاملی در مولکول‌های مورد نظر، نشاندارسازی را محدود ساخته و اغلب نیاز به واکنش‌های تخصصی و پیچیده دارد. اما در روش IEMA چون نشاندارسازی بر روی مولکول بزرگ آنتی‌بادی صورت می‌گیرد که دارای انواع گروه‌های عملکردی است؛ لذا نشاندارسازی آن براحتی با روش‌های ساده و عمومی امکان‌پذیر است.

۲- افزایش ویژگی– در روش EIA با توجه به اینکه از یک آنتی‌بادی برای شناسایی منفرد استفاده شده، درحالیکه در روش IEMA استفاده از دو آنتی‌بادی امکان شناسایی مضاعف را میسر می‌سازد، از اینرو ویژگی IEMA نسبت به EIA بیشتر است.

۳- افزایش حساسیت– باتوجه به اینکه در روش IEMA بازاء تک‌تک آنالیت‌ها، کمپلکس نشاندار وجود داشته و همچنین جایگاه‌های نشاندارسازی بالقوه آن بیشتر است؛ لذا هم بدلیل رابطه یک به یک بین آنالیت و کمپلکس نشاندار و هم بیشتر بودن جایگاه‌های بالقوه نشاندارسازی، حساسیت روش IEMA نسبت به EIA بیشتر است.

۴- کاهش زمان انکوباسیون- با نظر به اینکه واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی یک واکنش تعادلی دو طرفه بوده که طبق اصل لوشاتلیه با افزودن هر یک از مواد در یکی از طرفین معادله، تعادل بسمت طرف دیگر پیشرفت می‌نماید، از اینرو بدلیل اینکه در روش IEMA غالبا رقابت وجود نداشته و برای حصول اطمینان ازکفایت آنتی‌بادی‌ها بمنظور تشکیل کمپلکس در غلظت بالای آنالیت، همواره مقادیر زیادی از آنتی‌بادی بکار می‌رود؛ در نتیجه غلظت بالای مواد اولیه، سرعت به تعادل رسیدن یا زمان انکوباسیون را کاهش می‌دهد.

۵- افزایش محدوده عملکرد (Work of range)– محدوده عملکرد که محدوده  قابل اندازه‌گیری برای آنالیت بوده و فاصله بین اولین و آخرین نقطه استاندارد را شامل می‌شود، در روش IEMA حدود صد برابر بیشتر از EIA است.

۶- کاهش اثر هوک (Hook Effect)- اثر هوک که عبارتست از کسب نتایج منفی کاذب در غلظت بالای آنالیت می‌باشد، در واکنش‌های ایمونولوژی اتفاق افتاده و معادل پدیده پروزون در واکنش‌های سرولوژی است. در این پدیده غلظت آنالیت که می‌تواند آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی باشد، از بالاترین استاندارد نیز بسیار بالاتر بوده و لذا علیرغم زیادبودن آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد آزمایش در سرم، نتیجه منفی کاذب حاصل می‌گردد.

بدلیل نتایج منحرف‌کننده و نامطلوبی که اثر هوک می‌تواند بر آزمون‌های ایمنی‌سنجی          باقی گذارد، تحقیقات زیادی در زمینه شناخت این پدیده و چگونگی خنثی‌سازی آن انجام شده است؛ که یکی از آنها با توجه به اینکه پدیده هوک درروش  EIAبدلیل تک مرحله‌ای و مستقیم بودن روش آزمایش، شایع‌تر از روش IEMA می‌باشد؛ عدم استفاده از این چنین کیت‌هایی می‌باشد. در شرایطی که ناچار به استفاده از چنین کیت‌ها باشیم، برای اطمینان از صحت نتیجه،‌اولا از کیت‌هایی استفاده شود که محدوده شروع پدیده هوک در آن قید شده باشد و ثانیا بایستی هر جواب منفی را با رقت‌های بالاتری از همان سرم تکرار نمود.

البته باید توجه داشت که اگرچه پدیده هوک غالبا در اثر فزونی آنالیت اتفاق می‌افتد، ولی تحقیقات انجام شده توسط محققان ثابت نموده که منحصرا بالا بودن میزان آنالیت تنها عاملی نیست که در بروز این پدیده دخالت داشته و لذا عوامل دیگری نیز نظیر توزیع و پراکندگی اپی‌توپ‌ها، وجود اپی‌توپ‌های مشابه و یا استفاده از دو آنتی‌بادی مونوکلونال که بر ضد دواپی‌توپ مختلف تهیه شده‌اند، می‌تواند در بروز پدیده هوک موثر باشد؛ که نمونه آن نیز ایجاد پدیده هوک در روش‌های IEMA علیرغم دو مرحله‌ای بودن آنها می‌باشد؛ که علت آن در نتیجه استفاده از دو آنتی‌بادی مونوکلونال بر ضد دواپی‌توپ مختلف می‌باشد.

تعریف نهایی روش الایزا

با توجه به کلیات فوق‌الذکر در مورد انواع واکنش‌های ایمونولوژی، روش الایزا را می‌توان بطور خلاصه بصورت ذیل توصیف نمود:

الایزا، روش In vitro بررسی واکنش آنتی‌ژن و آنتی‌بادی بطریق ایمنی‌سنجی درفاز جامد بوده که از آنزیم برای نشاندارسازی و ردیابی آنالیت مورد نظر استفاده شده است.

وسایل و تجهیزات مورد نیاز در روش الایزا

وسایل و تجهیزاتی که جهت انجام آزمایشات به روش الایزا انجام می‌گیرد، عبارتست از:

الف– کیت الایزا که خود متشکل از موارد ذیل است:

۱- یک یا دوعدد پلیت ۹۶ خانه‌ای که در ۱۲ستون هشت خانه‌ای قرارگرفته‌اند. هر یک ازخانه‌ها را چاهک ( (Well و هر ستون هشت خانه‌ای را یک استریپ (Strip) گویند. جنس چاهک‌ها از پلی‌استیرن، پلی‌وینیل کلراید و یا پلی‌پروپیلن بوده، عمقی حدود cm1 داشته و به اشکال ته صاف و یا ته گود می‌باشند، که بطورایده آل جاهک‌های ته صاف برای قرائت اسپکتروفتومتری در سنجش‌هایی که در آنها پیشرفت رنگ وجود دارد، پیشنهاد می‌شود. لذا چاهک‌های ته گود برای قرائت اسپکتروفتومتری مناسب نمی‌باشند.

۲- ویال‌های استاندارد، کنترل منفی و مثبت، که با توجه به نوع کیت می‌توانند بصورت محلول یا لیوفیلیزه باشند.

۳- رقیق‌کننده نمونه (Sample Diluents) که مزیت آن اینست که باتوجه به رقیق- سازی نمونه، اثر هوک را تا حدود زیادی خنثی می‌نماید.

۴- کونژوگه نشاندار شده با آنزیم که از مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در الایزا می‌توان از پراکسیداز ترب کوهی یا HRP، آلکالن فسفاتازوپنی سیلیناز نام برد  که عمدتا از پراکسیداز استفاده شده و از آلکالن فسفاتاز بعلت گرانی، در کارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود. بایستی متذکر شد که آنزیم مورد استفاده برای نشاندارسازی، نقش مهمی در تعیین نوع سوبسترا و نیز نوع محلول متوقف‌کننده دارد.

۵- محلول شستشو که متشکل از بافر فسفات سالین (PBS)، تواین ۲۰ و تایمرسال می‌باشد. باید توجه داشت که هر چند PBS با تنظیم قدرت یونی وPH  مناسب، اتصال غیراختصاصی به جدارچاهک را به حداقل می‌رساند؛ بااینحال برای افزایش دقت و نیز کاهش اتصالات غیراختصاصی، از مقدار کمی پروتئین ودترژان یعنی تواین ۲۰ استفاده می‌شود. همچنین از آنجائیکه محیط‌های بافری غالبا برای رشد میکروارگانیسم‌ها بسیار مناسب می‌باشند، لذا از ترکیبات نگهدارنده نظیر تایمرسال و سدیم آزید استفاده می‌شود؛ که البته با توجه به اینکه سدیم آزید مهارکننده آنزیم پراکسیداز می‌باشد، از اینرواز تایمرسال استفاده می‌گردد.

۶- محلول سوبسترا– کروموژن که می‌تواند هم بصورت منفک از یکدیگر و یا بصورت ترکیبی باشد.

لازم بذکر است که در واکنش‌های آنزیمی، سوبسترا براساس حلالیت، می‌تواند محلول یا غیرمحلول باشد؛ که در سنجش الایزا بایستی سوبسترا محلول باشد. زیرا اگر غیرمحلول باشد، نمیتوان محصول را با دستگاه خوانشگر الایزا یا الایزاریدر قرائت نمود و توضیحا اینکه، سوبسترای غیرمحلول در روش دات الایزا (Dot ELISA) و بلاتینگ کاربرد دارد.

در مورد نوع سوبسترا نیز بایستی در نظر داشت، نوع سوبسترا بستگی به کونژوگه آنزیمی داشته و لذا اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، سوبسترا می‌تواند تترامتیل بنزیدین (TMB) و یا ارتوفنل دی آمین (OPD) بوده و رنگ حاصل از واکنش آنزیمی آبی خواهد شد. اما اگر کونژوگه آنزیمی ALP باشد، سوبسترا پارانیتروفنل (PNP) بوده و رنگ حاصل از واکنش نیز، زرد خواهد شد.

۷- محلول متوقف‌کننده یا بلوکر (Stopping or Blocking Solution) که باتوجه به نوع کونژوگه آنزیمی، می‌تواند اسیدی یا قلیایی باشد. بدین ترتیب که اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، برای توقف واکنش بایستی ازمحلول‌های اسیدی نظیر اسید کلریدریک و یا اسید سولفوریک استفاده نمود. ولی اگرکونژوگه ALP باشد، بایستی از محلول‌های قلیایی نظیر NaOH استفاده کرد. لازم بذکر است که در اثر توقف واکنش توسط متوقف‌کننده اسیدی، رنگ آبی تبدیل به زرد شده، در حالیکه تغییر رنگ حاصل از کاربرد متوقف‌کننده قلیایی، بصورت تبدیل رنگ زرد به قهوه‌ای خواهد بود.

ب- دستگاه خوانشگرالایزا یا الایزاریدر (ELISA Reader)– دستگاه الایزا ریدر که در نهایی‌ترین مرحله آزمایش الایزا مورد استفاده قرار گرفته و جزء لاینفک تکنیک الایزا می‌باشد، در واقع شبیه اسپکتروفتومتر بوده، با این تفاوت که نوع کووت، مسیر خوانش و تعداد فیلترها تغییر نموده است. بدین ترتیب که بجای کووت، از چاهک استفاده شده و مسیر خوانش آن نیز برخلاف تکنیک‌های فتومتری، بصورت عمودی می‌باشد. همچنین با توجه به اینکه در تکنیک الایزا از آنزیم‌ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می‌شود، از فیلترهای محدودی استفاده شده است.

دستگاه‌های الایزا ریدر براساس نوع و سیستم خوانشگر به سه دسته تقسیم می‌گردند، که عبارتست از:

۱- Single Reader که تنها یک چاهک را بطریق دستی قرائت نموده و هیچگونه مد محاسباتی ندارند؛ لذا بایستی منحنی استاندارد تست‌های کمی توسط آزمایشگر بطریق دستی رسم گردد. بهمین علت از قیمت و کیفیت پائیینی برخوردار بوده و خوشبختانه چنین دستگاه‌هایی دیگر مورد استفاده قرار نگرفته و از صحنه بازار محو شده‌اند.

۲- Strip Reader که تعداد ۳-۱ استریپ ۸ یا ۱۲ تایی را بصورت اتومات قرائت نموده و در عین حال منحنی تست‌های کمی را براساس مد محاسباتی، رسم می‌نمایند. علاوه بر این، بعلت دارا بودن فیلترهای افتراقی (Differential Filters) قابلیت خوانش در دو طول موج(Bichromatic Reading) را که بدلایل متعددی مورد نیاز می‌باشد را، بطور همزمان دارند، که این دلایل عبارتست از:

الف- حذف رنگ زمینه آبی که در اثر واکنش آنزیم HRP باTMB بعد از نوآرایی رنگ آبی به زرد قرائت در طول موج رفرانس مورد نیاز می‌باشد.

ب- باتوجه به اینکه رنگ زرد دارای طیف بلند گذر می‌باشد که طول موج‌های بالاتر از nm500 را بخوبی عبور داده و جذب آن در طول موج‌های حدود nm 600 صفر است، لذا نمونه بایستی در طول موج رفرانس نیز قرائت شود و بدین جهت استفاده از طول موج رفرانس، نیاز به استفاده از بلانک را نیز منتفی می‌سازد. زیرا درروش (Bichromatic Reading)

نمونه در طول موج‌های گوناگون خوانده شده و سپس تفاضل جذب‌های حاصله، مبنای تعیین غلظت قرار می‌گیرد.

۳- Plate Reader که قابلیت خوانش یک پلیت ۹۶ تایی را درحداقل زمان دارا بوده و لذا از سرعت، دقت و صحت بیشتری نسبت به دستگاه‌های Strip Reader برخودارند. از اینرو قیمت بالاتری را نیز دارند.

پاسخ دهید