معماری

آنالیز اسپرم با کامپیوتر

5-3 آناليز اسپرم به كمك كامپيوتر

1-5-3 مقدمه:

تا مدتي پيش ،اندازه‌گيري غلظت اسپرم با استفاده از كامپيوتر CASA امكان‌ پذير نبود زيرا مشكلاتي در تشخيص اسپرم از ذرات ديگر وجود داشت اما پيشرفت‌هاي تكنولوژيك، بخصوص رنگ‌آميزي فلورسانت DNA و الگوريتم‌هاي تشخيص دم ، مي‌تواند تعيين غلظت اسپرم و نيز تعيين غلظت اسپرم‌هاي پيش‌رونده را امكان ‌پذير سازد.

اگر در آماده سازي نمونه و استفاده از تجهيزات دقت كافي به عمل آيد، مي‌توان ازCASA بطور روتين استفاده نمود. براي بهره‌برداري مناسب و استاندارد از اين سيستم‌ها بايد روش‌هاي كنترل كيفي مناسب اعمال گردند. اين روش‌ها در فصل 7 توضيح داده شده‌اند.

سيستم‌هاي CASA توسط شركت‌هاي مختلفي توليد شده‌اند. اين دستگاه‌ها قادرند حركت اسپرم را ارزيابي نمايند و برخي از آنها مي‌توانند غلظت اسپرماتوزوئيدها را هم اندازه‌گيري کنند. تعيين مورفولوژي اسپرم بصورت نيمه اتوماتيك نيز توسط برخي از اين سيستم‌ها امكان‌پذير است. استفاده از CASA نسبت به روش‌هاي دستي دو مزيت دارد: ‌1- دقت بالاتر 2- توانايي شناسايي اسپرم‌هايي كه قدرت باروري دارند. (اين اسپرم‌ها دچار افزايش فعاليت شده و حركت پيشرونده دارند.)

2-5-3 استفاده از CASA در تعيين حركت اسپرم:

از روش CASA مي‌توان در بررسي حركت اسپرم استفاده نمود. البته به دليل اينكه ممكن است اسپرم‌هاي بي حركت با ذرات غير اسپرم اشتباه شوند، تعيين درصد تحرك اسپرم چندان قابل اعتماد نيست.

عوامل زيادي در عملكرد دستگاه‌هاي CASA نقش دارند از جمله چگونگي آماده سازي اسپرم، تعداد ميدان‌هاي ميكروسكوپي كه بررسي مي‌شوند، غلظت اسپرم و عمق فضايي كه اسپرم در آن شمارش مي‌شود. با اين حال در صورتي كه از روش‌هاي مناسب استفاده كنيم مي‌توان نتايج قابل اعتمادي بدست آورد.

دستگاه‌هاي CASA بايد به رايانه‌اي متصل شوند كه بتواند اطلاعات را مرتب نموده و از نظر آماري آناليز نمايد. بسياري از پارامترهاي حركتي اسپرم منحني گوسي ندارند در نتيجه براي نشان دادن شاخص مركزي اين پارامترها، استفاده از ميانه بر ميانگين ارجحيت دارد.

1-2-5-3 روش كار:

اگر چه سازندگان دستگاه‌هاي CASA تنظيمات مناسب را براي كاركرد آنها ذكر مي‌كنند، اما فردي كه آزمايش را انجام مي‌دهد بايد شخصاً از تكرار پذيري و قابل اعتماد بودن آنها اطمينان حاصل نمايد. بكارگيري كنترل كيفي مناسب (مثل ويديوهاي ضبط شده) ضروري است (ضميمه 7 بخش 5-7A)

2-2-5-3 آماده سازي نمونه:

نمونه را بايد مطابق آنچه در فصل 2 شرح داده شد آماده كرد. دستگاه‌هاي CASA بايد دماي نمونه را در حدC ˚37 حفظ نمايند زيرا حركت اسپرم نسبت به تغييرات دما حساس است. حركت و غلظت اسپرم را مي‌توان بر روي اسپرم رقيق نشده انجام داد به شرطي كه غلظت اسپرم بين 106 × 2 و 106× 50 در ميلي‌ليتر باشد. در نمونه هايي‌ كه غلظت اسپرم بالاتر از ml 106 × 50 است بدليل برخورد اسپرم ها با يكديگر خطا بوجود مي‌آيد. اين نمونه‌ها را بايد با پلاسماي مني خود بيمار رقيق نمود. براي اين كار، مقداري از نمونه را به مدت 6 دقيقه در g 16000 سانتريفوژ نموده و از پلاسماي مني كه در قسمت بالاي لوله قرار مي‌گيرد براي رقيق سازي استفاده می کنیم .

براي شمارش مي‌توان از لام‌هاي يكبار مصرف با عمق mµ 20 استفاده كرد. اين لام‌ها دو محفظه براي شمارش دارند كه بايد هر دو را پر نموده و بررسي كرد. اگر در هر طرف لام، 6 ميدان ميكروسكپي (در كل 12 ميدان) ‌ارزيابي شود معمولاً نتايج قابل قبول خواهد بود. در هر طرف لام حداقل 200 اسپرم بايد بررسي شود. نمونه‌ها را مي‌توان مستقيماً و يا به صورت ويديويي آناليز نمود. بررسي ويديويي اين امكان را مي‌دهد كه استفاده از روش‌هاي تضمين كيفيت و استانداردسازي بهتر انجام شود. سازندگان اين دستگاه‌ها توصيه مي‌كنند كه از چه نوع ويديويي استفاده شود و تنظيمات نوري لازم براي ايجاد بيشترين كنتراست بين سر اسپرم و زمينه لام را تشريح مي‌نمايند.

در مورد اينكه اسپرم را چه مدت بايد تعقيب نمود نظرات مختلفي وجود دارد، اما به نظر مي‌رسد حداقل زمان 1 ثانيه براي روش CASA كافي است.

3-2-5-3 اصطلاحات مورد استفاده در CASA:

برخي از اصطلاحات مورد استفاده در روش CASA كه در شكل 3-3 نمايش داده شده است عبارتند از:

  • VCL (Curvilinear Velocity) µm/s: به معني متوسط سرعت حرکت سر اسپرم در يك مسير منحني است و معياري از توان اسپرم قلمداد مي‌شود.
  • VSL (Straight -Line Velocity) µm/s: به معني متوسط سرعت حرکت سر اسپرم در يك خط راست، از يك نقطه شروع تا يك نقطه پايان است.
  • :VAP (Average Path Velocity) µm/s به معني متوسط سرعت حرکت سر اسپرم در میانگین مسير خود است. (براي محاسبه میانگین مسير، دستگاه‌هاي CASA داراي الگوريتم‌هايي هستند كه مي‌تواند مسير منحني را به يك مسير نسبتاً صاف تبديل كرده و آن را محاسبه نمايد. اين الگوريتم‌ها بين دستگاه‌هاي مختلف، متفاوت است و لذا نتايج حاصل از دستگاه‌هاي مختلف قابل مقايسه با يكديگر نيستند.)
  • :ALH (Amplitude of Lateral Head Displacement) µm ‌به معني اندازه‌گيري ميزان جابجايي جانبي سر اسپرم درمیانگین مسير است. از آنجا كه دستگاه‌هاي مختلف از الگوريتم‌هاي متفاوتي براي محاسبه ALH استفاده مي‌كنند لذا نبايد نتايج آنها را با يكديگر مقايسه نمود.
  • :Lin= Linearity به معني ميزان خطي بودن مسير حركت اسپرم است و از فرمول بدست مي‌آيد.
  • Wob= Wobble : معياري است كه ميزان نوسان مسير واقعي از مسير میانگین را نشان مي‌دهد و از فرمول بدست مي‌آيد.
  • :STR = Straightness به معني ميزان خطي بودن مسير میانگین است و از فرمول بدست مي‌آيد.
  • :BCF (Beat – Cross Frequency) Hz عبارت است از تعداد دفعاتي كه منحني مسير میانگین، توسط منحني مسير اصلي قطع مي‌شود.
  • :MAD (Mean Angular Displacement) متوسط مقادير زاويه چرخش سر اسپرم در طول مسير خود مي‌باشد.

 

 

 

 

3-5-3 استفاده از CASA براي تعيين غلظت اسپرم:

در روش CASA با استفاده از رنگ‌آميزي فلورسانس DNA مي‌توان غلظت اسپرم‌هاي متحرك و درصد تحرك آنها را تعيين نمود. در صورتي كه از لام‌هاي يكبار مصرف استفاده مي‌شود لازم است كه نقاط مختلفي از لام مورد ارزيابي قرار گيرد زيرا انتشار اسپرم‌ها در لام يكنواخت نيست. همچنين ضروري است تا اعتبار لام‌هاي يكبار مصرف در مقابل هماسيتومترها سنجيده شود. غلظت‌هاي بين / ml106×2 تا ml /106× 50 را مي‌توان با اين روش اندازه‌گيري كرد و غلظت‌هاي بالاتر را بايد رقيق نمود.

توجه: در روش CASA سرهاي اسپرم كه فلورسئينه شده‌اند اندازه‌گيري مي‌شوند. براي اينكه بدانيم اين اسپرم‌ها سالمند (يعني داراي دم نيز مي‌باشند) تنها راه، بررسي ميكروسكپي است.

4-5-3 بررسي مورفولوژي با استفاده از CASA:

امروزه دستگاه‌هايي ابداع گرديده‌اند كه مي‌توانند مرفولوژي سر، قطعه مياني و قطعه اصلي را تعيين نمايند. با CASA مي‌توان نقايص دم اسپرم را كه بر حركت اسپرم تأثير مي‌گذارد مشخص نمود. سيستم‌هاي CASA مي‌توانند مورفولوژي را بصورت موارد زير ارائه نمايند:

الفـ سر و قطعه مياني را بصورت نرمال و غير نرمال تقسيم بندي نموده و ميانگين و انحراف معيار يا ميانه را براي ابعاد سر و قطعه مياني ارائه نمايند.

ب- منظم بودن و ميزان بيضوي بودن سر را گزارش دهند.

ج- ناحيه اكروزوم را به كمك رنگ‌آميزي اندازه‌گيري‌ كنند.

روش‌هاي اتوماتيك نسبت به روش‌هاي دستي از دقت و تكرار پذيري بيشتري برخوردارند. دقت و تكرار پذيري ممكن است كمتر از 7% باشد كه نسبت به روش دستي بيشتر است. البته در روش CASA، ميزان فوكوس، روشنايي تصوير، چگونگي تهيه نمونه و رنگ‌‌آميزي، بر اين پارامترها تأثيرگذار است و اشكالات تكنيكي مي‌تواند در تشخيص سرهاي اسپرم از ذرات ديگر ايجاد اشكال نمايد.

ابزارهاي مورد استفاده و روش كار بايد استاندارد شوند و روش‌هاي كنترل كيفي مناسب بكار گرفته شوند. براي كاهش اثرات background در شمارش اسپرم، مي توان اسپرم را شستشو داد (مطابق بخش 4-2-13-2). در صورتي كه غلظت اسپرم پايين باشد (كمتر از ml 106 × 2) مي‌توان آن را تغليظ نمود. (بخش 2-2-13-2)

توجه: چون عمل سانتريفوژ كردن بر مورفولوژي اسپرم اثرگذار است، لذا بايد در جواب بيمار قيد شود . مطالعات نشان داده كه نتايج مورفولوژي CASA مي‌تواند پيشگويي كننده ميزان باروري در محيط آزمايشگاهي و بدن انسان باشد. Garrett و همكارانش با مطالعه بر زوجيني كه از قدرت باروري برخوردارند دريافتند كه انديس VSL و درصد اسپرم‌هايي كه مورفولوژي سر آنها شبيه به اسپرم‌هايي است كه به زونا پلوسيدا مي‌چسبند (zona – preferred = Z%) با حاملگي طبيعي مربوط است. ارتباط بين Z% و VSL يك ارتباط مستقيم است و هيچ آستانه‌اي وجود ندارد كه بتوان گفت پس از آن ديگر افزايشی در ميزان حاملگي ديده نمي‌شود.