معماری
نانو

اثرات سیتوتوکسیک نانوذرات CdSe بر غلظت آنزیمهای کبدی در موش بالغ نر

اثرات سیتوتوکسیک نانوذرات CdSe بر غلظت آنزیمهای کبدی در موش بالغ نر

چکیده

زمینه و هدف: اخیراً پیشرفت‌های امیدوارکننده‌ای در تشخیص‌های بیولوژیکی و استفاده از کوانتوم‌دات‌ها در نانوساختارها و نانوابزارهای چند منظوره بوجود آمده است، با این وجود سیتوتوکسیسیتی این نانوذرات در محیط Invivoکمتر مورد توجه قرار گرفته است، از اینرو در این تحقیق اثرات سیتوتوکسیک کوانتوم‌داتCdSe بر آنزیم‌هایAST و ALTمورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‌ها: بدین منظور CdSe با دوزهای 40 و 10 و 20mg/kg به تعدادی موش نر بالغ تزریق شد. خصوصیات ساختاری و نوری کوانتوم‌دات‌هاCdSe توسط XRD، Scaning Tunneling Microscopy مورد بررسی قرار گرفت. خونگیری به روش گیوتینی صورت گرفت و غلظت آنزیم‌هایAST و ALT به روش فتومتريک توسط دستگاه اتوآنالايزر اندازه‌گيري و مقایســــــــــــــــه غلظت آنزیم‌ها در گروه‌های مختلف توسط
One way ANOVA test به وسیله برنامه کامپیوتری SPSS (version 16) بررسی شد.

نتایج: غلظت سرمی آنزیم‌هایAST در گروه‌های تیمار با دوز mg/kg 20 و mg/kg 40 با افزایش معنادار در سطح 01/0≥ P همراه است و در گروه CdSe با دوز mg/kg 10 افزایش معنادار در سطح 05/0 ≥ P مشاهده شد، اما غلظت سرمی آنزیم هایALT در گروه‌های تیمار و گروه کنترل اختلاف معنی‌داری را نشان نداد.

بحث: این مطالعه نشان از عدم توکسیسیتی CdSe بر اختلال در غلظت آنزیم AST و عدم توکسیستی این کوانتوم‌دات بر غلظت ALT دارد و بر اساس تحقیقات ما با توجه به عدم وجود ادبیات تحقیق در این زمینه مطالعات ملکولی بیشتر در این زمینه برای بیان دقیق‌تر این نتیجه ضروری به نظر می‌رسد و این تحقیق می‌تواند به عنوان مقدمه‌ای بر تحقیقات بیشتر در زمینه توکسیسیتی کوانتوم‌دات‌ها در محیط In Vivo باشد.

 

1- مقدمه

امروزه نانوفناوري در تمامي عرصه‌ها نفوذ كرده است و داراي كاربردهاي وسيع و متعددي است. يكي از عرصه‌‌هاي نانوفناوري، ظهور در علم پزشكي است (3)، از اينرو با پيشرفت نانوتکنولوژي تعداد زيادي از نانوذرات بطور گسترده در زيست‌شناسي و پزشكي مورد استفاده قرار گرفتند و سيتوتوکسيسيتي نانوذرات به عنوان فاکتور بسيار تعيين‌کننده در گستردگي کاربردشان در زمينه درماني مطرح است و از اينرو توجه بسيار زيادي را در سال‌هاي اخير به خود معطوف ساخته است (1).

در بین نانوذرات اخيراً کوانتوم‌دات‌ها در ارتباط با پتانسيل کاربردي‌شان در تشخيص پزشكي و تصويربرداري سلولي شهرت يافته‌اند و پتانسيل کاربردی کوانتوم‌دات‌ها به عنوان ردياب‌هاي زيستي براي تشخيص بيماري‌هاي انسان به اثبات رسیده است (2،10). اما هنوز اطلاعات محدودی در این زمینه به دست آمده و سبب شده کوانتوم‌دات‌ها در یک محیط بالینی به منظور ابزار درمانی و یا تشخیصی مورد استفاده قرار نگیرند، از اینرو نیاز به تحقیق بیشتر در زمینه قرار گرفتن کوانتوم‌دات‌ها در محیط‌هایی که کاملاً از محیط بدن انسان تقلید می‌کنند، ضروری است و از برترین تحقیقات به سمت استفاده از این نانوذرات در برنامه‌های کاربردی پزشکی است (3، 6).

 

2– مواد و روش تحقیق

1-2 روش ساخت کوانتوم دات‌های CdSe

نانوذرات با استفاده از روش شیمیایی رسوب سنتز شدند. برای این منظور، سه محلول کلرید کادمیوم (CdCl2.4H2O)، مرکاپتواتانول (ME) و سدیم سلنیت (Na2SeO3.5H2O) در آب مقطر دیونیزه آماده شدند و تحت همزدن شدید (از شرکت مرک) قرار گرفتند. در ابتدا، محلول CdCl2 به سه ظرف بالن لوله‌دار ریخته شد و همزمان محلول ME به بالون مشابه اضافه شد. در نهایت، محلول سدیم سلنیت به همان شیوه و تحت شرایط کنترل جو (N2) به بالن اضافه شد. محلول حاصل با آب مقطر شستشو داده شد و پس از آن به منظور حذف هرگونه ناخالصی ریز سانتریفوژ شد. سپس، نمونه رسوب در دمای اتاق خشک شد. تمام مراحل در دمای اتاق انجام گرفت.

 

2-2 نگهداری از حیوانات و تزریق نانوذرات  CdSe

تعدادی از موش‌های بالغ نر نژاد Balb/C در محدوده سني 12-10 هفته و محدوده وزني 2 ± 26 گرم از دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد تهیه گردید. از اين حيوانات 48 عدد به طور تصادفي انتخاب شدند و قبل از شروع آزمايش جهت سازگاري حيوانات با محيط، به مدت يك هفته با دسترسي آزادانه به آب و غذا در شرايط 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريكي و در درجه حرارت 3±22 درجه سانتي‏گراد نگهداري شدند كه پس از علامت‏گذاري و وزن کردن آنها، حيوانات به 4 گروه شاهد و تیمار با دوزهای mg/kg 10،mg/kg 20و40 mg/kg نانوذرات CdSeتقسيم شدند. سپس نانوذرات CdSe در نرمال سالین آماده شدند و با دوز10 mg/kg ،mg/kg 20 و mg/kg 40 در یک نوبت به صورت درون صفاقی به موش‌های گروه تیمار تزریق شد و به گروه کنترل فقط نرمال سالین تزریق شد.

 

3-2 تشریح موش‌ها و برداشت کبد

به منظور تعیین اينکه آيا نفوذ و تجمع نانوذرات باعث اختلال در عملکرد کليه‌ها و کبد شده‌اند، پس از خونگیری به شیوه گیوتینی در لوله‌های حاوی هپارین، نمونه‌ها به مدت 15 دقيقه سانتريفوژ شدند (3000 RPM ) و پلاسماي آنها جدا گرديد و مقادير فاکتورهايي نظير آنزيم‌هاي کبدي) SGOT سرم گلوتامات اگزالواستات ترانس‌آميناز) یا AST (Aspartate Aminotransferase) و SGPT (سرم گلوتامات پيروات ترانس‌آميناز) یا ALT (Alanine Transaminase) از پلاسما به روش فتومتريک توسط دستگاه اتوآنالايزر اندازه‌گيري شد.

 

4-2 آناليز داده‌ها

تجزيه و تحليل اطلاعات كمي به دست آمده با روش آماري آناليز واريانس (One way Anova) و توسط نرم‏افزار SPSS V11 صورت گرفت. فاصله اطمينان 95 موردقبول و خارج از آن غيرقابل قبول در نظر گرفته شده است.

 

3- نتایج

1-3 نتایج حاصل ازXRD ، STM و جذب اسپکتروفتومتر

ساختار کوانتوم‌دات‌هاي CdSe توسط XRD مورد مطالعه قرار گرفت. شکل 1 الگوي XRD کوانتوم‌دات‌هاي CdSe را نشان مي‌دهد. آنچه مشاهده مي‌گردد نمونه تک‌فاز و داراي ساختار بلوري مکعبي هستند و مطابق با استاندارد JCPDS) کميته مشترک بر استانداردهاي پراش پودر) شماره کارت 19-0191، قله پراش با (111)، (220) و (311) که صفحه کريستال هستند، مطابقت دارند. ميانگين اندازه ذرات که توسط فرمول دبي‌شرر تعيين شد، 4/2 نانومتر محاسبه گردید. شکل 4-2 تصویر STM نمونه CdSe را نشان مي‌دهد که در این تصویر اندازه نانوذرات در حدود 3 نانومتر تعيين شد (7).

 

2-3 نتایج حاصل از آنالیز فاکتورهای خونی

مقایسه غلظت‌های آنزیمی آنزیم‌های آمینوترانسفرازها در گروه تیمار و کنترل در گروه بالغ چنانچه در جدول 1 نیز قابل مشاهـــــده است نشان می‌دهد غلظت سرمی آنزیم‌هایAST در گروه‌های تیمار CdSe با دوز
mg/kg 20 و mg/kg 40 با افزایش معنادار در سطح 01/0≥ P همراه است و در گروه CdSe با دوزmg/kg 10 افزایش معنادار در سطح 05/0 ≥ P مشاهده شد. همچنین مقایسه غلظت‌های آنزیمی آنزیم‌های ALT در گروه تیمار و کنترل نشان می‌دهد غلظت سرمی آنزیم‌های ALT در گروه‌های تیمار و گروه کنترل اختلاف معنی‌داری را نشان نداد.

 

جدول 1: بررسي ميانگين غلظت سرمي آنزیم‌هايAST و ALT در گروه‌هاي مختلف تيمار در مقايسه با گروه کنترل، 10 روز پس از تزريق درون صفاقي (IP) نانوذرات CdSe به موش‌هاي نر نژاد BALB – c در گروه‌هاي بالغ

سن گروه‌ها گروه‌ها دوز نانوذره غلظت AST غلظت ALT غلظت ALP
 

 

بالغ

شاهد mg/kg 0 331 93 270
 

CdSe

 

mg/kg10 386 83 303
mg/kg20 **430 91 312
mg/kg40 **413 87 *362

در اين جدول، * = P<0.05 و ** = P<0.01 اختلاف معني‌دار نشان می‌دهد.

نمودار 1: بررسي ميانگين غلظت سرمي آنزیم‌هاي ALT در گروه‌هاي مختلف تيمار در مقايسه با گروه کنترل، 10 روز پس از تزريق درون صفاقي (IP) نانوذرات CdSe به موش‌هاي نر نژاد BALB – c در گروه‌هاي بالغ

 

نمودار 2: بررسي ميانگين غلظت سرمي آنزیم‌هاي AST در گروه‌هاي مختلف تيمار در مقايسه با گروه کنترل، 10 روز پس از تزريق درون صفاقي (IP) نانوذرات CdSe به موش‌هاي نر نژاد BALB – c در گروه‌هاي بالغ

 

بحث

برنامه‌های کاربردی پزشکی و زیستی کوانتوم دات‌ها با بهره‌برداری از خواص فلورسنت کوانتوم‌دات‌ها به عنوان ابزارهای تشخیصی (به عنوان مثال، تصویربرداری)، اهداف درمانی (به عنوان مثال، تحویل دارو و درمان سرطان)، برچسب زدن سلول زنده، و ردیابی در مدت طولانی از زمان، امکان‌پذیر است و نتایج مثبت به دست آمده تا‌کنون موفقیت کوانتوم‌دات‌ها را در سیستم‌های بیولوژیکی و کاربردهای متفاوت آنها را در زیست پزشکی نشان داده است (5،9). کوانتوم دات‌ها همچنین در حال وارد شدن به سلول‌های خورشیدی و دستگاه‌های الکترونیکی، مانندLED ها هستند که در آنها خواص الکترونیکی و نوری مزیت‌هایی را فراهم می‌کند (5). استفاده از کوانتوم‌‌دات‌ها در کاربردهای عملی به تازگی شروع شده است. از اینرو اخیراً، تحقیق در ارتباط با ساخت کوانتوم‌دات‌ها، خواص فیزیکی و شیمیایی آنها و از همه مهم‌تر و جالب‌تر استفاده تجربی از آنها بسیار پراهمیت است (4، 5).

اولين گام در تشخيص آسيب کبدي، انجام آزمايش ساده خون است که حضور آنزيم‌هاي کبدي مشخص را نشان مي‌دهد. حساس‌ترين و پر مصرف‌ترين آنزيم‌هاي تشخيصي کبد، آمينوترانسفرازها هستند. آنها آسپارتات آمينوترانسفراز (SGOT يا AST) و آلانين آمينوترانسفراز (SGPT يا ALT) هستند. آمينوترانسفرازها باعث کاتاليز واکنش‌هاي شيميايي در سلول‌ها مي‌شوند که در آن گروه آمين از يک مولکول دهنده به مولکول گيرنده منتقل مي‌گردد، به همين دليل به آنها آمينوترانسفراز گفته مي‌شود. واژه‌هاي پزشکي در خصوص اين آنزيم‌ها مي‌تواند گاهي گيج‌کننده باشد. نام ديگر آمينوترانسفرازها، ترانس‌آميناز است. آنزيم آسپارتات آمينوترانسفراز (AST) نيز به نام ترانس‌آميناز اگزالواستيک سرم (SGOT) ناميده مي‌شود و آلانين آمينوترانسنفراز (ALT) نيز به نام ترانس‌آميناز پيرويک گلوتاميک سرم (SGPT) مشهور است (7)، بنابراین تحقیقات در زمینه تغییرات غلظت این دو آنزیم نقش مهمی در تعیین توکسیسیتی کوانتوم‌دات‌ها بر اندام‌ها به ویژه کبد و کلیه دارد، از اینرو در مطالعه حاضر CdSe بدون پوشش، با اندازهnm 3-2 به روش رسوبگذاری سنتز شده و اثرات توکسیسیتی آن بر فاکتورهای خونی در محیط In Vivo مورد بررسی قرار گرفت. در زمینه اثرات توکسیسیتی کوانتوم‌دات‌ها بر غلظت آنزیمهایAST وALT تاکنون هیچ تحقیقی انجام نگرفته است و مطالعات اندکی در زمینه اثرات توکسیسیتی نانوذرات بر غلظت آنزیم‌هایAST وALT وجود دارد. از جمله Wang و همکارانش در سال 2007 روی اثرات توکسیسیتی نانوذرات TiO2 با اندازه 25، 80 و 155 نانومتر کار کردند. نانوذرات TiO2 را با غلظت 5  g/kg به صورت درون شکمی تزریق کردند و نتایج هر دو تحقیق افزایش سطح آنزیم‌های ALT و نسبت ALT/AST را نشان داد (7).

در تحقیق دیگری تانگ و همکاران در سال 2011 نانوذرات TiO2 آناتاز را با اندازه 1 ± 5 نانومتر به صورت ریزش تدریجی داخل نایی با دوز 4،20 و 0.8 (mg/kg) ارائه دادند و نتایج نشان داد پارامترهای بیوشیمیایی AST افزایش یافته است (8)، از اینرو در این تحقیق اثرات سیتوتوکسیسیتی CdSe برای اولین بار بر غلظت سرمی آنزیم‌های ترانس‌آميناز اگزالواستيک و ترانس‌آميناز پيرويک گلوتاميک در حیوانات مورد بررسی قرار گرفته است. غلظت سرمی آنزیمهای AST در گروه‌های تیمار CdSe با دوز20 mg/kg و 40 mg/kg با افزایش معنادار در سطح 01/0 P ≤همراه بود. در ارتباط با ALT در گروه‌های CdSe هیچگونه تغییری در غلظت سرمی این آنزیم مشاهده نشد.

با توجه به وجود عناصر سنگین مانند کادمیوم در کوانتوم‌دات‌ها و نبود پوشش محافظتی، احتمال توکسیسیتی کوانتوم‌دات‌ها افزایش می‌یابد و با توجه به اینکه ALT بیشتر از همه در کبد یافت می‌شود و عمدتاً در زمان نکروز کبدی افزایش می‌یابد اما AST علاوه بر کبد در قلب و به میزان کمتر در کلیه و مغز یافت می‌شود در نتیجه علاوه بر نکروز کبدی در زمان نکروز قلبی و آسیب ماهیچه‌ای- مغزی نیز افزایش می‌یابد و با توجه به کوچک بودن اندازه نانوذرات بین 3-2 نانومتر و احتمال عبور آن از سد خونی مغزی و احتمال آسیب به مغز می‌توان گفت احتمال مشاهده اختلالات بیشتر در ترشح آنزیم AST در مقایسه با آنزیم ALT وجود دارد. البته برای بیان نتیجه قطعی در این زمینه بررسی سیتوتوکسیسیتی کوانتوم‌دات‌ها بر بافت‌های مختلف قلب، کلیه، کبد، ماهیچه و مغز لازم است.

 

1- Bae، Pan، K.،Kim، a Kyung، N.،Lee ،a Seung، J.،Chang، Hyun ،J.،Lee، Chong ،K.،Park، Joung ،K ،1- (2008) ، The modification of quantum dot probes used for the targeted imaging of his-tagged fusion proteins، Biomaterials ، 30(5)، 836-842.

2- Beverly، A.، Rzigalinski، Jeannine.، Strobl ، S، (2009)،Cadmium-containing nanoparticles: Perspectives on pharmacology and toxicology of quantum dots، Toxicol Appl Pharmacol، 238(3)، 280-288.1- Changa Shu-quan،Daia Yao-dong،Bin Kanga،Wei Hana،MaobLing and Chena Da (2009). UV-enhanced cytotoxicity of thiol-capped CdTe quantum dots in human pancreatic carcinoma cells . Toxicology letters. 188(2): 104-111.

3- Clift Martin J. D،Stone Vicki (2012). Quantum Dots: An Insight and Perspective of Their Biological Interaction and How This Relates to Their Relevance for Clinical Use. Theranostics.; 2(7):668-680.

4- Jana Drbohlavova،Vojtech Adam،Rene Kizek and Jaromir Hubalek Quantum Dots-Characterization: Preparation and Usage in Biological Systems. Molecular science. 10، 2009، 656–673.

5- Jenny R Roberts،James M Antonini،Dale W Porter،Rebecca S Chapman،James F Scabilloni،Shih-Houng Young،Diane Schwegler-Berry،et al (2013). Lung toxicity and biodistribution of Cd/Se-ZnS quantum dots with different surface functional groups after pulmonary exposure in rats. Particle and Fibre Toxicology. 10،.

6- Muller L،Gasser M،Raemy D.O،Herzog F،Brandenberger C،Schmid O،Gehr P،Rothen-Rutishauser B،Clift M.J.D (2011). Realistic exposure methods for investigating the interaction of nanoparticles with the lung at the air-liquid interface in vitro. Theranostics. 1: 30-64.

7- Tang، M.،Zhang، T.،Xue، Y.،et al ،( 2010)، Dose dependent in vivo metabolic characteristics of titanium dioxide nanoparticles، Nanosci Nanotechnol، 10(12)، 8575-8583.

8- Valipoor Akram، Parivar Kazem and et al (2013)، Cytotoxicity effects of CdSe quantum dots on testis development of laboratory mice، OPTOELECTRONICS AND ADVANCED MATERIALS – RAPID COMMUNICATIONS، 7(3-4: 252 – 257

9- Wang، J.،Zhou، G.،Chen، C.،et al ،(2007)،Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration، Toxicol Lett، 168(2)، 176-185.

10- Wen-hsiung C،Nion-heng S (2008). Cytotoxic effect of CdSe quantum dots on mouse embryonic development. Molecular science. 29( 2): 259-266.

اکرم ولی‌پور1*، جعفر طاهری2، حمیده قراملکی3

1* گروه فیزیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه اسلامی آزاد شهرکرد، ایران

2 گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی شهرکرد، ایران

3 دپارتمان علوم تشریح، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، ایران

*نویسنده مسئول: اکرم ولی‌پور

پاسخ دهید