معماری
الایزا

الایزا ریدر

الایزا ریدر  یا خوانشگر الایزاکه به اسامی <میکروپلیت ریدر> و <خوانشگر میکروپلیت فتومتریک> نیز معروف است، یک اسپکتروفتومتر تخصصی بوده که به منظور قرائت نتایج تست الیزا طراحی شده است. این وسیله به منظور تعیین حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن های اختصاصی در نمونه ها به کار می‌رود. این تکنیک بر اساس تشخیص یک آنتی‌ژن یا آنتی بادی ها روی یک سطح جامد به صورت مستقیم یا ثانویه به کمک آنتی بادی های نشاندار و ایجاد محصولاتی استوار است که می‌توانند توسط اسپکتروفتومتر  خوانده شوند. واژه الایزا ELISA، اختصاری از کلمات Enzyme-Linked  Immuno  sorbent  Assay است.

 

کاربرد میکروپلیت ریدر
مــیــکـــروپــلــیـــت ریــدر بــرای خــوانــدن نـتــایــج تست‌های الایزا مورد استفاده قرار می گیرد. این تـکـنـیــک کــاربــردی مـسـتـقـیــم در ایـمـنــولــوژی و سـرولـوژی دارد. از مـیـان کـاربـردهـای دیگر این وسیله به تایید حضور آنتی بادی ها یا آنتی‌ژن‌های یک عامل عفونی در یک ارگانیزم، آنتی بادی های یـک واکـسـن یـا اتـوآنـتـی بـادی هـا بـرای مـثال در آرتریت روماتوئید می توان اشاره کرد.

اصول کار
الایـزا ریـدر یـک اسپکتـروفتـومتـر اختصـاصی است. بر خلاف اسپکتروفتومترهای معمولی که قرائت جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج ها تسهیل می کنند، الایزا ریدر دارای فیلترها یا گریتینگ های انکساری بوده که گستره طول موج ها را محدود کرده و معمولا بین ۴۰۰ تا ۷۵۰ نانومتر  عمل می کنند. برخی از الایزا ریدرها در گستـره مـاوراء بنفـش عمـل کرده و قرائت را در مـحــدوده ۳۴۰ تــا ۷۰۰ نـانـومتـر انجـام مـی دهنـد. سـیـستم نوری موجود در این دستگاه ها توسط تعدادی از کارخانه ها با استفاده از فیبرهای نوری به منظور تامین نور جهت چاهک های حاوی نمونه در میکرو پلیت طراحی می شود. ابتدا یک شعاع نوری از نمونه ای که دارای قطری بین ۱ تا ۳ میلی متر است عبور کرده و سپس یک سیستم آشکار کننده، نور عبوری از نمونه را آشکار و تقویت می کند. در مرحله بعد، سیگنال مربوط به جذب نوری نمونه‌ها ثبت شده و سیستم خوانشگر نیز آن را به اطلاعاتی تبدیل می کند که سبب تفسیر نتایج تست می شوند. برخی از الایزا ریدرها با استفاده از سیستم های شعاعی نوری دوتایی کار می کنند.
نمونه های مورد آزمایش در پلیت هایی که به این منظور طراحی شده اند و دارای تعداد خاصی چاهک هستند، قرار می گیرند. پلیت های ۸ ستونی همراه با ۱۲ ردیف که در مجموع ۹۶ چاهک را تشکیل می دهند، رایج تر از بقیه هستند. برای کاربردهای اختصاصی تر، تعداد چاهک ها افزایش می یابد که در برخی موارد تا پلیت های ۳۸۴ چاهکی را نیز شامل می شود. افزایش تعداد چاهک ها به منظور کاهش مقدار مصرف معرف ها و نمونه ها است. موقعیت سنسور نوری الایزا ریدر بر اساس نوع کارخانه سازنده متغییر است؛ به طوری که در برخی موارد ممکن است در بالای پلیت حاوی نمونه و گاهی نیز مستقیما در زیر پلیت قرار گیرد. امروزه میکرو پلیت ریدرها دارای کنترل هایی هستند که به وسیله میکروپروسسورها تنظیم شده اند.

وسایل لازم جهت انجام تکنیک الایزا
جهت انجام آزمایش الایزا تجهیزات زیر مورد نیاز  است:
۱- الایزا ریدر
۲- میکرو پلیت واشر (شستشو دهنده چاهک ها)
۳- سیستم توزیع کننده مایع (که در این مورد ممکن است از پیپت ها چند کاناله استفاده شود)
۴- انکوباتور

تجهیزات مورد نیاز در انجام تست های الایزا
مراحل مکانیکی انجام تکنیک الایزا
یک تست الیزا به طور رایج شامل مراحل زیر است:
۱- شستشوی اولیه پلیت که ممکن است با استفاده از میکرو پلیت واشر انجام شود.
۲- استفاده از یک توزیع کننده مایع (دیسپنسر) یا پی پت چند کاناله.
۳- پلیت در انکوباتور قرار داده می شود که دارای دمای کنترل شده بوده و واکنش ها در آن محل انجام می شوند.
بسته به نوع تست، مراحل ۱، ۲ و ۳ ممکن است چـنـدین بار تکرار شوند، تا این که معرف‌های اضافه شده، واکنش ها را کامل کنند.
سـرانـجـام، وقـتـی تـمـام مـراحـل انـکوباسیون کامل شد، پلیت به الایزا ریدر منتقل شده و سپس بـا قـرائـت جـذب نـوری نمونه ها، نتیجه آن ها مشخص می شود.

مراحل بیوشیمیایی تکنیک الیزا
۱- چــــاهــــک هــــای مــــوجــــود در پــلــیــــت بــــا آنـتــی‌بــادی‌هــا و آنـتــی ژن هــا پــوشـیـده (Coat) می‌شوند.
۲- نـمــونــه هـا، کـنـتـرل هـا و اسـتـانـداردهـا بـه چاهک‌ها اضافه شده و در دمای اتاق  یا ۳۷ درجه سـانتیگـراد بـرای یـک مـدت زمـانی معین، طبق دستـورالعمـل تست انکوبه می شوند. در طول انکـوباسیون، بسته به حضور یا عدم حضور و مقدار آنتی ژن   یا آنتی بادی موجود در نمونه، آنتی ژن نمونه به آنتی بادی کوت شده به پلیت، یا آنتی بادی موجود در نمونه به آنتی ژن Coat شده در پلیت باند می شود.
۳- پـــس از انـکـــوبـــاسـیـــون، آنـتـــی ژن‌هــا  یــا آنـتــی‌بــادی‌هــای آزاد، شـسـتشـو داده شـده و بـا اســتــفـــاده از مـیـکــرو پـلـیــت واشــر و یــک بــافــر شستشوی مناسب، برداشته می شوند.
۴- در مرحله بعد، یک آنتی بادی ثانویه، به نام کونژوگه، اضافه شده که حاوی آنزیمی است که به منظور ایجاد یک تغییر رنگی، با یک سوبسترا واکنش خواهد داد.
۵- ســـپــــس یــــک دوره زمــــانــــی ثــــانــــویــــه از انـکــوبــاسـیـون شـروع مـی شـود کـه در طـی آن، کـونـژوگـه بـا کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی در چاهک ها پیوند برقرار خواهد کرد.
۶- پس از انکوباسیون، یک دوره شستشوی جدید انجام می شود که سبب برداشت کونژوگه متصل نشده از چاهک ها خواهد شد.
۷- در مرحله بعد، سوبسترا اضافه می شود. آنـزیـم بـا سـوبستـرا واکنش خواهد داد و سبب تغییر رنگ محلول خواهد شد. این واکنش نشان خواهد داد که چه مقدار کمپلکس آنتی‌ژن- آنتی بادی در پایان تست وجود خواهد داشت.
۸- وقتی که زمان انکوباسیون کامل می شود، یک معرف برای توقف واکنش آنزیم- سوبسترا به آن اضافه شده که از تغییرات بیشتر در شدت رنگ ایجاد شده، جلوگیری می‌کند. این معرف عموما یک اسید رقیق است.
۹- در پایان، پلیت بوسیله الایزا ریدر خوانده می شود. نتایج حاصله برای تعیین مقادیر اختصاصی یا حضور آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها در نمونه به کار برده می شوند.
تــوجـه: بـرخـی از چـاهـک هـا بـرای استـانـداردهـا و کنتـرل هـا استفـاده مـی شـونـد. استانداردها برای تعریف نقاط cut-off به کار برده می شوند. استانداردها و کنترل ها مـقـادیر معینی هستند و برای اندازه گیری نتایج تست و ارزیابی اطلاعات در مقابل غلظت‌های مشخصی برای هر کنترل به کار برده می شوند. فرایند توصیف شده در بالا عمومی است؛ اگرچه بسیاری از تست های الایزا وجود دارند که همراه با مراحل یا متغیرهای اختصاصی هستند.

نصب تجهیزات
به منظور عملکرد صحیح الایزا ریدر، نکات زیر لازم است تا رعایت شود:
۱- یک محیط تمیز و عاری از گرد و غبار
۲- یک میز کار ثابت و به دور از تجهیزاتی از قبیل سانتریفوژ، شیکر و … که سبب لرزش آن می شوند. این میز باید دارای اندازه مناسبی باشد  به طوری که در کنار الایزا ریدر، فضای کاری مناسبی وجود داشته باشد. تجهیزات تکمیلی مورد نیاز برای انجام تکنیک توصیفی بالا عبارتند از: واشر، انکوباتور، دیسپنسر و کامپیوتر همراه با وسایل جانبی آن.
۳- یک منبع تغذیه الکتریکی، که سازگار با استانداردها و معیارهای کشور باشد. در کشورهای آمریکایی به طور مثال، عموما فرکانس های ۶۰ هرتز و ۱۱۰ ولت استفاده می‌شود، در حالی که در نواحی دیگر از جهان ۲۲۰ تا ۲۴۰ ولت و ۵۰ تا ۶۰ هرتز به کار برده می شود.

کالیبراسیون الایزا ریدر
کالیبراسیون الایزا ریدر، یک مرحله اختصاصی است که باید توسط یک تکنسین یا مهندس آموزش دیده که به دستورالعمل های سازنده دستگاه آشنایی دارد، انجام شود. بـرای انجـام کالیبراسیون، داشتن یک مجموعه از فیلترها که از لحاظ اندازه، یکسان هستند، الزامی است. سازندگان این دستگاه ها، پلیت های کالیبراسیون را برای هر طول موجی که دستگاه به کار می برد فراهم می کنند.
پلیت های کالیبراسیون مجهز به حداقل سه مقدار جذب نوری از قبل تعیین شده (پایین، متوسط و مقدار بالا)، در دامنه اندازه گیری هستند.
برای انجام کالیبراسیون مراحل زیر را باید دنبال کرد:
۱- پلیت کالیبراسیون را روی دستگاه قرار دهید.
۲- یـک خـوانـش کـامـل را بـا پلیـت کـالیبراسیون انجام دهید. مشخص کنید که آیا تفاوت‌هایی در قرائت های به دست آمده از یک چاهک به چاهک دیگر وجود دارد یا خیر. چنانچه اختلافی مشاهده شد، پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و قرائت را مجددا تکرار کنید تا    از اختلافاتی که به خود پلیت نسبت داده می شوند، جلوگیری کنید. به طور کلی، اگر نتایج پلیت در دو طول موج، به میزانی باشد که انتظار داریم، گفته می‌شود که دستگاه به کالیبراسیون دیگری احتیاج ندارد.
۳- تایید کنید آیا خوانشگر به کالیبراسیون احتیاج دارد یا خیر. چنانچه به کالیبراسیون احتیاج دارد، راهنمایی های  رایج کارخانه سازنده دستگاه را برای کالیبراسیون دنبال کنید. تایید کنید که خطی بودن )linearity( خوانشگر تا حد امکان قابل قبول است.
۴- اگــر دستگـاه حـاوی یـک پلیـت کـالیبـراسیـون نیسـت، یـک محلـول رنگـی را در چاهک‌های یک پلیت از آن ریخته و فوری نتایج را قرائت کنید. سپس پلیت را به اندازه ۱۸۰ درجه چرخانده و دوباره قرائت را انجام دهید. اگر هر دو خوانش ها و میانگین مقادیر در هر ردیف یکسان هستند، خوانشگر کالیبر است.
۵- تایید کنید که خوانشگر به صورت ستون به ستون نیز کالیبر است. یک پلیت تمیز و خالی را  در محل مخصوص قرار دهید و قرائت را انجام دهید. اگر اختلافی بین هر یک از خوانش های میانگین از اولین تا آخرین ستون وجود ندارد، می توان فرض را بر این گذاشت که خوانشگر کالیبر است.

حفظ و نگهداری رایج
‌نـگـهــداری اســاســی (تـکـرار بـه صـورت روزانه)
۱- مـرور ایـنـکـه سنسورهای نوری هر کانال تـمـیـز هـسـتـنـد. چـنـانـچـه کـثـیـف هـستند، سطح پنجره‌‌های عبور دهنده نور و سنسورها را با یک برس کوچک تمیز کنید.
۲- تایید کنید که سیستم نوری تمیز  است.
۳- تایید کنید که کالیبراسیون خوانشگر کافی اسـت. وقـتـی کـارهـای روزانه شروع می شود، اجـازه دهـید تا خوانشگر برای مدت ۳۰ دقیقه گرم شود. در مرحله بعد، قرائت Blank را انجام دهـیـد و سـپـس یـک پـلیت کامل از سوبسترا را قـرائـت کـنـیـد. خـوانـش هـا مـی بـایـست یکسان بـاشند. اگر این طور نبود، پلیت را چرخانده و قرائت را به منظور تعیین این که آیا اختلاف در پلیت یا در خوانشگر است، تکرار کنید.
۴- سـیـسـتــم کـشـنــده اتــومــاتـیــک اســلایــدهـا (Automatic drawer sliding system) را بــررسـی کنید که باید نرم و ثابت باشد.

‌نـگـهـداری بـازدارنـده (تـکـرار هـر سه ماه یکبار)
۱- پـــایـــداری لامـــپ را تـــایـیــد کـنـیــد. پـلـیــت کالیبراسیون را به کار برده، قرائت را با فاصله ۳۰ دقیقه مجددا با همان پلیت انجام دهید. قرائت ها را مقایسه کنید که هیچ تفاوتی نباید میان آن ها مشاهده شود.
۲- سیستم نوری دتکتور و سیستم های نوری را تمیز کنید.
۳- کشنده پلیت (Plate drawer) را تمیز کنید.
۴- مکان قرار گیری هر چاهک را با استفاده از سـیـسـتـم هـای انتشار نور و آشکار  کننده تایید کنید

 

پاسخ دهید