معماری

اندازه‌گیری هموگلوبین

فرآورده رفرانس هموگلوبین سیانید Haemoglobincyanide (HiCN) در سال 1965 توسط ICSH (International Council for Standardization in Haematology) ارائه شد و سپس توسط سازمان جهانی سلامت (WHO) به عنوان استاندارد و رفرانس بین‌المللی تأئید گردید. این روش برای اندازه‌گیری هموگلوبین در آزمایشگاه‌های عادی توصیه می‌شود. فرآورده‌هایی که معادل استاندارد بین‌المللی می‌باشند در بازار قابل دسترس هستند.

 

اصول

خون در معرفICSH (که دارای محلول پایه درابکین است) رقیق می‌شود. این معرف دارای فری‌ سیانید پتاسیم، سیانید پتاسیم و یک دترجنت غیر یونی است. گلبول‌های قرمز لیز شده و هموگلوبین آزاد شده به سیانو‌مت‌ هموگلوبین (HICN) تبدیل می‌شود. یک محلول تازه باید هر دو تا سه هفته ساخته شود و در بطری تیره و دور از نور مستقیم خورشید در کمد نگهداری گردد.

جذب نوری محلول توسط اسپکترومتر یا اسپکتروفتومتر در طول موج 540 نانومتر و بر اساس وزن ملکولی و ضریب خاموشی (extinction coefficient) اندازه‌گیری شده که می‌تواند به صورت غلظت هموگلوبین بیان شود. اگر اسپکترومتر در دسترس نبود، می‌توان از یک رنگ سنج ساده (colorimeter) یا فتومتر با استفاده از فیلتر سبز- زرد مناسب کمک گرفت. سپس غلظت هموگلوبین در نمونه مورد آزمایش با میزان جذب نوری استاندارد رفرانس (یا فرآورده تجاری معادل آن) مقایسه می‌گردد. مزایای این روش پایداری فرآورده رفرانس و ارزیابی همه انواع هموگلوبین به استثناء سولفوهموگلوبین است.

 

استفاده از اسپکتروفتومتر

  • مطمئن باشید که عدسی یا آینه‌ها دارای گرد و خاک و اثر انگشت نیستند. در صورت ضرورت با دستمال نرم یا دستمال کاغذی پاک کنید.
  • به سیستم برق پایداری متصل شوید (اگر به ثبات جریان برق مطمئن نیستید، از باتری استفاده کنید).
  • از تماس زیاد فتوسل با نور جلوگیری کنید. به عنوان یک عمل پیشگیری کننده، جریان نور را توسط بستن شاتر یا گذاشتن پوشش کووت در محلی که کووت اندازه‌گیری هموگلوبین را انجام نمی‌دهد مسدود نمائید.
  • کووت‌ها را با قرار دادن چند ساعت در دترجنت ملایم تمیز کنید. اگر ضرورتی داشت سطوح داخل را با سواب پنبه‌ای تمیز نمائید، با آب مقطر آبکشی کنید و به طور معکوس بگذارید تا خشک شده و در محفظه عاری از گرد و خاک نگهداری نمائید. کووت‌های خراش‌دار یا شکسته را دور بیاندازید.

 

روش‌های کاری

  • چک جریان تاریک

دستگاه را روشن کنید و طوری تنظیم کنید که میزان جذب با حالت مسدود برای جریان نور خوانده شود. این تنظیم باید هر موقع که دستگاه روشن می‌شود چک گردد.

  • چک پایداری خواندن

با آب مقطر کووت را پر کنید و آن را در جای خود در داخل دستگاه قرار دهید، قرائت جذب را در میزان مناسبی مانند 0.100 تنظیم نمائید. خواندن را در فواصل 5 دقیقه‌ای تکرار نمایید تا قرائت پایداری دیده شود. در استفاده روزمره هرگز اندازه‌گیری‌ها را قبل از اینکه زمان گرم شدن دستگاه کامل گردد و خواندن پایدار شود انجام ندهید (معمولاً 5 تا 30 دقیقه).

  • کووت‌ها

پس از پر کردن کووت با محلول، سطوح بیرون کووت را پاک و خشک کنید و چک کنید که هیچگونه حباب یا ذره‌ای وجود ندارد. کووت را از سطح بالایی یا کناری که نور از آن سطوح عبور نخواهد کرد حمل و نقل نمائید. بعد از گذاشتن کووت در قسمت مخصوص خود، چک کنید که حرکات آینه بر روی کووت‌ها تأثیری بر روی خواندن ندارند. اگر کووت‌ها به صورت دوتایی استفاده می‌شوند (محلول تست و بلانك در دو کووت جداگانه) آنها باید در ابتدا با همدیگر مطابقت داده شوند (‌مشابه باشند). برای این کار کووت‌ها را با محلول HICN پر کنید. در ابتدا نقطه قرائت مناسب را تنظیم کنید (برای مثال0.100). به نوبت هر کووت را بخوانید و فقط آنهایی که کمتر از 0.005 واحد با هم اختلاف دارند را انتخاب نمائید.

  • حجم محلول

حجم محلول‌های مورد نیاز را با اضافه کردن میزان مورد نیاز چک کنید و بیش از حد لازم محلول به کووت نریزید تا قرائت پایداری بدست آید. در کارهای روزمره توصیه شده است که از حجم حداقل، کمی بیشتر محلول بریزید اما نه آنقدر که کووت تا بالا پر شود.

  • تابش خارجی

با حالتی که کووت کاملاً در جای خود قرار گرفته است، چک کنید که قرائت دستگاه تحت تأثیر نور خارجی از بالای دستگاه قرار نداشته باشند. اگر این امر رخ می‌دهد دستگاه باید یا جابجا شود یا جلوی نور خارجی توسط سرپوش گذاشتن یا مسدود کردن بالای قسمت نگهدارنده کووت گرفته شود.

فتومتر‌ها یا رنگ سنج‌ها

این ابزارها معمولاً دارای کاربری آسانی هستند اما اصول کاری مشابه می‌باشد.

 

روش‌های اجرایی آزمایش

  • 20 میکرولیتر از خون EDTAدار که به خوبی مخلوط شده را به 5 میلی‌لیتر معرف ICSH (درابکین) در یک لوله آزمایش اضافه کنید تا رقت 1 به 251 بدست آید. حداقل پنج دقیقه صبر کنید تا تبدیل به HICN به طور کامل صورت گیرد.
  • محلول را به داخل یک کووت که با کووت دوم (حاوی معرف) مطابقت دارد بریزید.
  • اسپکترومتر را در طول موج 540 نانومتر یا یک فتومتر با فیلتر سبز- زرد تنظیم کنید و میزان جذب نوری نمونه‌های رقیق شده آزمایش و محلول معرف را بدست آورید.

4 – محاسبه غلظت هموگلوبین با استفاده از فرمول زیر بدست می‌آید.

Hb (g/l) = (جذب نوری لوله تست 540 / جذب نوری لوله استاندارد540) x غلظت استاندارد (mg/l) x (251/100)

 

استاندارد رفرانس و فرآورده کنترل

یک استاندارد رفرانس با غلظت حدود 800 میلیگرم در لیتر توسط سازمان جهانی سلامت ارائه شده است. مواد مشابه تجاری با غلظت هموگلوبین ذکر شده نیز در دسترس است. مطمئن‌ترین هدف رفرانس، چک کارکرد صحیح اسپکتروفتومتر است.

فرآورده‌های کنترل خون کامل باید در کنار هر سری آزمایش مورد استفاده قرار گیرند تا قابل اطمینان بودن آزمایش انجام شده با استفاده از نمودار کنترل مشخص شود.

 

منحنی کالیبراسیون

این منحنی برای چک خطی بودن (Linearity) پاسخ دستگاه تهیه می‌شود.

یک سری پنج تایی لوله آماده نمائید. داخل لوله‌ها به ترتیب 0,1.5 ,3 ,4.5 ,6 میلی‌لیتر از معرف رفرانس HiCN بریزید. با اضافه کردن معرف، به ترتیب 6 ,4.5 ,3 ,1.5 ,0 میلی‌لیتر به لوله‌ها، حجم نهایی هر لوله را به 6 میلی‌لیتر برسانید. در این حالت غلظت 100%، 75%، 50%، 25% غلظت اولیه رفرانس استاندارد بدست می‌آید. جذب نوری را در 540 نانومتر برای هر محلول اندازه‌گیری نمایيد. در برگه شطرنجی محور Xها را با غلظت هموگلوبین و محور Yها را با میزان جذب مشخص نمائید.

تمام نقاط باید بر روی خطی که از صفر می‌گذرد بیافتند. اگر در منحنی ناهماهنگی وجود دارد عملکرد اسپکتروفتومتر را چک نمائید. این چک باید هر موقع که اسپکتروفتومتر سرویس یا تعمیر می‌شود و همچنین به طور روتین در فواصل شش ماهه تکرار شود.

 

جدول کالیبراسیون

وقتی که تعداد زیادی نمونه‌های خونی در هر روز آزمایش می‌شود بهتر است که نتایج از طریق منحنی کالیبراسون (یا جدول تهیه شده از آن) بدست آید که مقادیر خوانده شده جذب را به غلظت هموگلوبین تبدیل می‌کند. در عمل، قرائت‌هایی مورد قبول هستند که درون قسمت خطی نمودار واقع شده باشند. در بیشتر دستگاه‌ها بهترین دقت و صحت قرائت‌ها در محدوده واحد‌های جذب 0.2-0.7 می‌باشد. اگر یک قرائت بیرون از این محدوده است آزمایش باید با استفاده از یک معرف مناسب‌تر و متفاوت و رقیق سازی نمونه تکرار شود. جدول کالیبراسیون فقط برای دستگاهی که مقادیر از آن بدست می‌آید، معتبر است. هر روز جدول باید توسط اندازه‌گیری یک نمونه از سری آزمایش‌های قبلی و همینطور فرآورده کنترل چک شود.

 

منابع خطا

  • خطای جمع‌آوری
  • مخلوط نکردن کافی نمونه قبل از برداشت
  • خطای پیپت کردن یا رقیق سازی
  • وجود لخته در نمونه
  • باقی ماندن نمونه بر روی میز کار و تماس طولانی مدت با نور یا فریز کردن نمونه.
  • فرآورده رفرانس تاریخ گذشته یا فاسد شده، مخصوصاً اگر این فرآورده چند مدت بعد از باز کردن ویال بر روی میز کار باقی مانده باشد.
  • کالیبراسون ناصحیح دستگاه
  • خطاهای دستگاه
  • زمان ناکافی برای گرم شدن دستگاه
  • اشکال در کار لامپ یا بیش از حد گرم شدن- ممکن است نیاز به تعویض لامپ باشد.
  • اشکال فتوسل
  • تغییرات شدید ولتاژ
  • خطی نبودن
  • قرارگیری نادرست کووت
  • کثیفی یا خراشیدگی کووت

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

علی اصغر صفری فرد، کارشناس ارشد خون شناسی و بانک خون