معماری

اهمیت ارزیابی D-β-Glucan-3-1 در تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی

 

شاخص D-β-Glucan-3-1 به‌عنوان یک روش جدید و جایگزین در تشخیص و مراقبت مؤثر عفونت‌های مهاجم قارچی مطرح می‌باشد. عفونت‌های مهاجم قارچی برای مدت زمانی طولانی با مرگ‌ومیر قابل‌توجه بیماران مبتلا به سرطان در بخش‌های ایزوله، بیماران دریافت‌کننده پیوند و همچنین بیماران دچار نقص سیستم ایمنی در ارتباط بوده و از سوی دیگر نیاز به استفاده از روش‌های تهاجمی؛ تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی را دشوار نموده است. ارزیابی D-β-Glucan-3-1 که در آن نمونه با روشی غیرتهاجمی به دست می‌آید می‌تواند در تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی و همچنین ارزیابی پاسخ به درمان سودمند واقع شود. یکی از محدودیت‌های روش سنجش D-β-Glucan-3-1 برای تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی، حساسیت و اختصاصیت ناکافی آن در هنگام مثبت بودن جواب تست می‌باشد درحالی‌که هنوز دستورالعمل‌های رسمی در مورد استفاده از این روش وجود ندارد، این روش می‌تواند فرصتی ارزشمند برای ارزیابی بیماران در معرض خطر بالا فراهم نماید. در این مقاله، مروری کلی بر کاربردهای آزمایشگاهی و بالینی سنجــــــــــش سطح سرمی D-β-Glucan-3-1 خواهیم داشت.

مقدمه

عفونت‌های مهاجم قارچی به‌عنوان مشکلی مهم در بیماران دریافت‌کننده پیوند سلول‌های بنیادی خون‌ساز (HSC) و ارگان‌های توپر (solid organs) مانند کبد، کلیه و ریه مطرح می‌باشد (1 و 2). علیرغم پیشرفت‌های به وجود آمده در اقدامات درمانی، هنوز عفونت‌های قارچی با مرگ‌ومیر بالای بیماران همراه است (3). در میان بیماران دریافت‌کننده پیوند، کاندیدا (Candida)، گونه‌های آسپرژیلوس (Aspergillus species) و برخی قارچ‌های رشته‌ای مانند فوزاریوم (Fusarium)، سدوسپوریوم (Scedosporium) و زیگومیست‌ها (Zygomycetes) به‌عنوان عوامل مهم ایجاد عفونت‌های در نظر گرفته می‌شوند (1 و 2).

تشخیص عفونت‌های قارچی به دلیل نیاز به نمونه‌برداری از بافت و کشت آن و همچنین آزمایش‌های بافت‌شناسی دیگر دشوار است و علاوه بر آن یافته‌های بالینی و تصاویر رادیولوژی، حساسیت و اختصاصیت تشخیصی کافی را ندارند. سنجش شاخص‌های زیستی مانند اجزای دیواره قارچی و D-β-Glucan-3-1، به‌عنوان روش‌های غیرتهاجمی مطرح می‌باشند که می‌توانند در تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم مفید واقع شوند.

 

ساختمان و ویژگی‌های بیوشیمیایی D-β-Glucan-3-1

دیواره سلول قارچی علاوه بر اینکه در محافظت آن‌ها نقش دارد، در تهاجم به بافت‌ها نیز ایفای نقش می‌کند. عمده‌ترین جزء ساختاری دیواره قارچی پلی‌ساکارید است و در مورد اکثر آن‌ها شامل گلوکان (Glucan)، کیتین (Chitin) و مانان (Mannan) است (شکل 1). گلوکان مهم‌ترین و فراوان‌ترین پلی‌ساکارید دیواره بسیاری از قارچ‌هاست، درحالی‌که دیواره سلولی مخمرها محتوی مقدار کمتری گلوکان نسبت به قارچ‌های رشته‌ای می‌باشد همچنین گلوکان‌ها جزء اصلی و عمده دیواره قارچ‌های ساپروفیت (Saprophytic) و پاتوژن هستند. البته استثناهایی نیز در این مورد وجود دارد، برای مثال دیواره موکور (Mucor)، ریزوپوس (Rhizopus)، بلاستومیسس درماتیتیدیس (Blastomyces dermatitidis) و گونه‌های کریپتوکوکوس (Cryptococcus sp.) محتوی مقدار بسیار کمی از این پلی ساکارید است (9-4).

گلوکان غالباً متشکل از پلیمرهای گلوکز است که در یک آرایش خطی از طریق پیوندهای گلیکوزیدی کربن‌های 1 و 3، با کونفیگوراسیون بتا، به یکدیگر اتصال یافته‌اند تا اسکلت اصلی D-β-Glucan-3-1 به وجود بیاید (7). آنزیم مسئول ساخت این پلی‌ساکارید D-β-Glucan-3-1 سنتاز می‌باشد. هر پلی‌ساکارید از زنجیره‌ای به طول 1500 زیرواحد گلوکز تشکیل شده است که در بین این زنجیره شاخه‌هایی با پیوند گلیکوزیدی 4-1 و 6-1 وجود دارد (شکل 2). شاخه‌های زنجیره پلی‌ساکاریدی متنوع بوده و اختصاصی هر گونه است (7-4).

اگرچه D-β-Glucan-3-1 در ساختار دیواره قارچی به‌عنوان یک ساختار نامحلول وجود دارد، در حضور خون یا دیگر مایعات، این ساختار به شکل‌های مارپیچ منفرد (single helix)، مارپیچ سه‌تایی (triple helix) یا ساختارهای تصادفی (random coil) تبدیل می‌شود که موجب محلول شدن آن می‌گردد (4، 5، 7). گفته می‌شود که ساختار محلول D-β-Glucan-3-1 ممکن است با تعدیل سیستم ایمنی از طریق مهار فاگوسیتوز لوکوسیتی در ارتباط باشد (10). جزئیات مربوط به رهاسازی و کینتیک D-β-Glucan-3-1 محلول در گردش خون سیستمیک یا مایعات دیگر بدن، در بیمارانی که عفونت قارچی مهاجم دارند یا حضور این عفونت در آن‌ها محتمل است، محدود می‌باشد (4).

 

اصول سنجش D-β-Glucan-3-1

در سال 1956 گروهی پژوهشگر در ماساچوست مشاهده کردند که تزریق اندوتوکسین در جریان خون خرچنگ Limulus polyphemus منجر به شروع واکنش لخته شدن وسیعی می‌گردد (11). پس از مدتی مشخص شد که یک سلول شبه‌آمیبی متحرک (مشابه فاگوسیت‌ها) در جریان خون Limulus polyphemus وجود دارد که حاوی فاکتور C بوده و مسئول آغاز آبشاری از واکنش‌های لخته شدن می‌باشد. این مسیر هم‌اکنون به‌عنوان مسیر LAL (Limulus Amebocyte Lysate) شناخته می‌شود (شکل 3). فاکتور C یک زیموژن سرین پروتئازی می‌باشد که به‌وسیله لیز سلولی از آمبوسیت‌ها جدا شده است (13-11).

پیش از کشف LAL، تائید تجهیزات پزشکی و موادی که برای استفاده در انسان پیشنهاد می‌شد، نیاز به تست پیروژن (Pyrogen test) داشت (11). در پی کشف مسیر LAL، بسیاری از مواد و تجهیزات پزشکی برای تشخیص آلودگی باکتریایی توسط تست پیروژن معمول و مسیر کشف شده جدید آزمایش می‌شدند. در سال 1977، FDA (سازمان غذا و داروی آمریکا) استفاده از LAL به‌عنوان تست پیروژن جایگزین برای ارزیابی مواد بیولوژیکی، داروهای داخل وریدی و تجهیزات پزشکی (مانند دریچه‌های قلب مصنوعی یا تجهیزات مورداستفاده در ارتوپدی) را تائید کرد.

در سال 1968، مشتق کربوکسی متیله بتاگلوکان که تحت بررسی به‌عنوان یک عامل ضدسرطان قرار داشت، در عدم حضور آلودگی باکتریایی از طریق LAL سبب القای لخته شدن گردید (12). در پی این اتفاق، یک زیموژن سرین پروتئازی ثانویه به نام فاکتور G، به‌عنوان آغازکننده آبشار لخته شدن LAL توسط این مشتق بتاگلوکان شناخته شد (12 و 13). سپس روش‌های سنجش اختصاصی برای اندازه‌گیری بتاگلوکان قارچی، خصوصاً در نمونه‌های سرم، توسعه یافتند که اساس تمامی این روش‌ها فعال کردن مسیر LAL بود (4 و 13) (شکل 3).

همانطورکه ذکر شد قسمت عمده بتاگلوکان محلول به‌صورت مارپیچ سه‌گانه می‌باشد و مواجهه با معرف قلیایی ساختار آن را به مارپیچ تک‌رشته‌ای تغییر می‌دهد که برای واکنش LAL موردنیاز است (4). علاوه بر این، افزودن معرف قلیایی موجب کاهش احتمال به وجود آمدن نتایج مثبت و منفی کاذب می‌گردد که به ترتیب از طریق غیرفعال نمودن سرین پروئئازها و مهارکننده‌های سرین پروتئازی توسط این معرف میسر می‌شود. لازم به توضیح است که این قبیل پروتئین‌ها به‌صورت طبیعی در سرم انسان حضور دارند. به دنبال انجام تیمار با معرف قلیایی، واکنش LAL با فعال شدن فاکتور G توسط بتاگلوکان تک‌رشته‌ای آغاز می‌شود (11 و 14)، سپس فاکتور G فعال‌شده یک پیش‌آنزیم لخته‌کننده (proclotting enzyme) را به فرم فعال تبدیل می‌نماید. فرم فعال آنزیم لخته‌کننده یک سوبسترای رنگی به نام p-nitroanilide را از انتهای یک پپتید صناعی (که جایگزین پروتئین تشکیل‌دهنده لخته اصلی شده) جدا می‌کند. p-nitroanilide در وضعیت اتصال‌یافته به پپتید بی‌رنگ می‌باشد، ولی جدا شدن آن از پپتید باعث ایجاد رنگ زرد می‌شود (شکل 4). درحالی‌که واکنش اصلی LAL با تشکیل لخته پایان می‌یابد، اما روش بتاگلوکان LAL، یک روش مبتنی بر رنگ‌سنجی است

 

کیت‌های تجاری در دسترس برای ارزیابی D-β-Glucan-3-1

اخیراً پنج کیت تجاری برای ارزیابی D-β-Glucan-3-1 در دسترس قرار دارد که نام این محصولات و برخی مشخصات مربوطه در جدول 1 آمده است. از میان این پنج محصـــــــــــــــول تجاری کیت‌هایEndosafe-PTS glucan و β-glucan Test تنها برای اهداف تحقیقاتی استفاده شده و برای اهداف تشخیصی در بالین کاربرد ندارند. کیت‌هایی که برای تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم مورداستفاده قرار می‌گیرند، محتوی فاکتور G و پپتید متصل به سوبسترای رنگی هستند که در حالت لیوفلیزه قرار دارند. به‌طورمعمول 5-3 میلی‌لیتر خون برای جداسازی سرم کافی موردنیاز می‌باشد. نمونه‌های لیپیمیک، ایکتریک و همولیز به دلیل این‌که منجر به تداخل و تولید نتایج نادرست می‌شوند نباید برای این کار مورداستفاده قرار گیرند. در شکل 3 مراحل انجام آزمایش به‌صورت مختصر برای کیت Fungitell نمایش داده شده است. این کیت در حال حاضر برای تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی در آزمایشگاه فوق‌تخصصی ایمونولوژی و آلرژی بیمارستان مسیح دانشوری مورداستفاده قرار می‌گیرد.

 

جدول 1: کیت‌های در دسترس برای سنجش D-β-Glucan-3-1
Kit Manufacturer FDA Approved Crab Species Cut-off Value
Fungitell Associates of Cape Cod (U.S.) Yes Limulus polyphemus (colormetric) 60–80 pg/ml
Endosafe-PTS glucan Charles River Laboratories (U.S.) No Limulus polyphemus (colormetric) 10–1000 pg/ml
Fungitec G-MK Seikagaku Biobusiness (Japan) No Tachypleus tridentalus (colormetric) 20 pg/mL
β-glucan Test Waco Pure Chemical Industries (Japan) No Tachypleus tridentalus (turbidimetric) 11 pg/ml
BGSTAR β-glucan test Maruha (Japan) No Tachypleus tridentalus (colormetric) 11 pg/ml

 

 

استفاده از D-β-Glucan-3-1 در پیگیری درمان و تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی

تائید و استفاده از تست D-β-Glucan-3-1 در تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی عرصه بالین را متحول نموده است. کیت اخیر تائیدشده توسط FDA، Fungitell است که برای سنجـــــــــــــــش سطح سرمی D-β-Glucan-3-1 می‌باشد و می‌تواند در تشخیص عفونت‌های مهاجم قارچی کمک‌کننده باشد. جدیدترین دستورالعمل‌های جامعه بیماری‌های عفونی آمریکا برای مدیریت بالینی آسپرژیلوزیس و کاندیدیازیس سنجش D-β-Glucan-3-1 سرمی را در ارزیابی بیمارانی که برای طولانی مدت مشکوک به عفونت قارچی بوده‌اند، پیشنهاد می‌کنند، اما هنوز توصیه‌ای برای استفاده‌های اختصاصی وجود ندارد (15 و 16)، با این وجود برای تولید نتایج دقیق در این تست، آزمایشگاه می‌بایست در انجام و کنترل کیفیت آن مهارت و تخصص لازم را داشته باشد. علاوه بر این، پزشکان بایستی با محدودیت‌های این تست و همچنین استفاده مناسب از آن در مدیریت بالینی بیماران آشنا شوند. کنترل‌های تجاری فعلاً برای ارزیابی کیفیت انجام این تست در دسترس نیستند، بنابراین آزمایشگاه‌هایی که این تست را انجام می‌دهند بایستی در برنامه‌های جایگزین و مشابه شرکت نمایند. درحالی‌که هنوز دستورالعمل‌های رسمی برای استفاده از D-β-Glucan-3-1 ارائه نشده‌اند، بر اساس شواهدی که اخیراً در دسترس قرارگرفته است، می‌توان از این روش استفاده نمود. در جدول 4 برخی توصیه‌های مهم که در هنگام استفاده از این روش برای تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم باید موردتوجه قرار گیرد، آورده شده است. شواهد اخیر نشان می‌دهند که نتایج منفی این تست نمی‌تواند به‌طور قطعی عدم تشخیص عفونت قارچی مهاجم را رد کند و نتایج مثبت هم به‌تنهایی حساسیت و اختصاصیت کافی در تشخیص قطعی را ندارند (21-17).

 

 

جدول 4: توصیه‌هایی که هنگام استفاده از D-β-Glucan-3-1 بهتر است موردتوجه قرار گیرد.
این تست بهتر است در کنار روش‌های دیگر تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم مورداستفاده قرار گیرد.

این تست بهتر است پیش از شروع درمان ضد قارچی انجام شود.

برای بیمارانی که در معرض خطر بالا قرار دارند، بهتر است این تست دو بار در هفته انجام گیرد.

برای ارزیابی پاسخ به درمان بهتر است هفته‌ای یک‌بار این تست انجام شود.

اگر نتیجه تست مثبت باشد، پیش از پذیرفتن آن به‌عنوان نتیجه مثبت واقعی، بهتر است با انجام آزمایش بر روی نمونه جدید یا تکرار آزمایش بر روی نمونه قبلی این نتیجه تائید شود.

مطالعات بیشتر در مورد مفید بودن این تست برای ارزیابی نمونه‌هایی غیر از سرم لازم می‌باشد.

 

اگرچه تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم توسط سنجش بتاگلوکان در بیمارانی که در معرض خطر بالا برای ابتلا به این عفونت‌ها قرار دارند، منطقی می‌باشد، اما به نظر می‌رسد استفاده از این شاخص برای پیگیری درمان بیماران نیز ممکن است سودمند واقع شود. با این وجود تعداد دفعات سنجش و نقش این شاخص در پیگیری درمان بیماران تشخیص داده شده با عفونت مهاجم قارچی یا بیماران مشکوک، هنوز به‌خوبی روشن نشده است (17 و 18).

در دسترس بودن یک روش سریع و آسان می‌تواند به‌عنوان شاخصی جایگزین برای ارزیابی عفونت‌های قارچی در جمعیت‌های خاص مانند بیماران در معرض خطر بالا برای عفونت استفاده شود. مطالعات بیشتر برای تعیین مقادیر مرجع، تعداد دفعات انجام تست، قابلیت استفاده از نمونه‌های دیگر غیر سرم برای تشخیص عفونت‌های قارچی مهاجم و ارزیابی پاسخ به درمان موردنیاز است.

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

سید مرتضی حقگو1،2، اسماعیل مرتاض2،3

1 گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس

2 مرکز تحقیقات بیماری‌های مزمن تنفسی، مرکز آموزشی، درمانی و تحقیقاتی سل و بیماری‌های ریوی دکتر مسیح دانشوری

3 گروه ایمونولوژی پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

پاسخ دهید