معماری
پلاکت

تهیه پلاکت غنی (prp)

پلاسمای غنی از پلاکت (پی‌آرپی)

از آنجایی که پلاسمای غنی از پلاکت جزو فرآورده‌های مشتق از خون کامل است و در مباحث قبلی بدان اشاره شده است، در اینجا با توجه به گسترش کاربرد این فرآورده در درمان و تهیه آن در مطب پزشکان نکاتی در مورد تهیه استاندارد و بهینه این فرآورده ارائه می‌گردد. منظور از پی‌آرپی در این مقاله، پلاسمای غنی از پلاکت تهیه شده در مطب پزشکان و مراکز درمانی و در مقیاس حجمی کم است که برای مصارف خاص درمانی مورد استفاده قرار می‌گیرد، اما پلاسمای غنی از پلاکت تهیه شده در سازمان‌های انتقال خون از کیسه خون 450 سی‌سی تهیه شده و حاوی مقدار به مراتب بیشتر پلاکت غنی شده می‌باشد که جهت تزریق به بیماران نیازمند مانند مبتلایان به بدخیمی‌های خونی تجویز می‌گردد.

پلاكت‌‌ها سلول‌هاي خوني ديسكي شكل و بدون هسته هستند كه در عملكرد‌هاي حياتي متعددي از جمله هموستاز (انعقاد خون)، التهاب، دفاع ضد ميكروبي ميزبان، رگ‌زايي و ترميم زخم نقش دارند. اگرچه ابتدا تمركز بر نقش پلاكت‌ها در انعقاد خون بيشتر بود اما بزودي مشخص گرديد بيش از 1100 پروتئين در پلاكت‌ها وجود دارد، از جمله فاكتور‌هاي رشد، پيامبر‌هاي سيستم ايمني، آنزيم‌ها و ساير تركيبات زيستي كه در مراحل مختلف روند ترميم بافت نقش دارند.

پلاسمای غنی از پلاکت (پی‌آرپیPRP ) یک فرآورده خونی است که طی فرآیند جداسازی از خون تازه و لخته نشده تهیه می‌شود. از سال‌ها پیش فرآورده تغلیظ شده‌ی پلاکتی در سازمان‌های انتقال خون، آماده شده و در بیمارستان‌ها و مراکز درمانی برای بند آوردن خونریزی یا جلوگیری از آن در بیماران مبتلا به کمبود تعداد یا اختلال در کارکرد پلاکتی استفاده می‌شود، همچنین به عنوان درمان پیشگیرانه در موارد کاهش تولید پلاکت در مغز استخوان، جراحی‌های تهاجمی، خونریزی‌های فعال و غیره مورد استفاده است.

تفکر بهره‌مندی از فرآورده پلاکتی در درمان‌های دیگر، بر پایه این تئوری شکل گرفت که ترمیم بافت سخت و نرم توسط پروتئین‌های خاص و پروسه‌ای از واکنش‌های داخل و خارج سلولی منظمی انجام می‌شود که در حال حاضر به طور کامل شناخته نشده‌اند، اما آنچه مسلم است این است که پلاکت‌ها نقش برجسته و مهمی در فعال‌سازی فرآیندها و تولید فاکتورهای رشد و پروتئین‌های خاص دارند. پلاکت‌ها در پاسخ به آسیب بافتی و پارگی عروق، با ایجاد پلاک پلاکتی و لخته منجر به هموستاز شده و سپس با ترشح پروتئین‌های خاصی، تکثیر و تمایز سلولی، حذف بافت آسیب دیده، ایجاد عروق و ماتریکس خارج سلولی، ترمیم و بازسازی بافت آسیب دیده را سبب می‌شوند.

پی‌آرپی به عنوان روشي براي وارد كردن غلظت بالاي فاكتور‌هاي رشد و ساير ملكول‌هاي زيستي به بافت آسيب‌ديده براي بهينه‌سازي محيط ترميمي بافت، پذيرفته شده است. با اين حال، همگي فرآورده‌هاي آن مشابه نيستند. حجم خون كامل گرفته شده از بيمار، ميزان كارايي روش استحصال پلاكت‌‌ها، حجم نهايي پلاسمايي كه در آن پلاكت معلق است، وجود يا عدم وجود گلبول‌هاي سفيد يا قرمز خون و اضافه كردن ترومبين يا كلسيم كلرايد براي فعال سازی همگي مي‌توانند بر روی ويژگي‌هاي فرآورده نهايي پی‌آرپی اثر بگذارند.

در سال‌های اخیر و با پیشرفت دانش پزشکی، از پی‌آرپی در رشته‌های مختلف پزشکی مثل جراحی زیبایی، جراحی پلاستیک، جراحی‌های فک و صورت، جراحی دهان و دندان، جراحی قلب، جراحی‌های مغز و اعصاب، ارتوپدی، پزشکی ورزشی، گوش و حلق و بینی، دندانپزشکی، موارد سوختگی و پزشکی پوست، مو و زیبایی استفاده می‌شود. در این روش، با بکارگیری تکنیک فرآیند جداسازی پلاسما و تغلیظ پلاکت از خون خود فرد، از آن برای خود وی استفاده می‌شود و به عنوان روشی نوین و جدید وارد دنیای طب شده است. سهولت تهیه PRP در مقایسه با مواد بیولوژیک دیگر، امکان تهیه این فرآورده در مطب، و ایمنی بالا از ویژگی‌های آن می‌باشد.

 

تهیه پلاسمای غنی از پلاکت

تعريف کاری پی‌آرپی، تعداد 000/1000 در هر ميكروليتر است كه 5 برابر میزان طبيعي پلاكت در خون كامل مي‌باشد. بر اساس قانون فيزيكي Stoke، سرعت رسوب هر ذره در محيط مايع در پاسخ به نيروي جاذبه زمين، تقريباً با قطر آن متناسب است. بنابراين، يك پلاكت (با قطر تقريبي 2 میکرومتر) نسبت به گلبول قرمز (با قطر تقريبي 7 میکرومتر) و گلبول سفيد خون با قطر تقريبي (15-7 میکرومتر) در اثر نيروي جاذبه زمين، آهسته‌تر رسوب مي‌كند. اين پديده باعث مي‌شود در حالي كه اجزاء جامد (گلبول قرمز و سفيد خون ) ‌سريع‌تر رسوب مي‌كنند، پلاكت‌‌ها در مايع بصورت انتخابی معلق باقي بمانند و بنابراين از ساير سلول‌ها جدا می‌شوند.

از آنجايي كه حجم آغازين خون كامل موردنياز براي توليد PRP در سيستم‌‌هاي مختلف، متفاوت است (همچنين وجود يا نبود گلبول‌هاي سفيد در فرآورده، كيت‌‌ها و سانتریفيوژ‌هاي مخصوص هر تكنيك)، لازم است تا از نيروي g صحيح و مدت زمان سانتریفيوژ مناسب براي توليد فرآورده خاص، اطمينان حاصل گردد. با اين حال، حتي هنگامي كه پروتكل‌هاي خاصPRP نيز استفاده مي‌شود (كيت و دستگاه سانتریفيوژ)، غلظت پلاكت در فرآورده‌هاي نهايي PRP بين تكنيك‌هاي متفاوت يا حتي دفعات مختلف استاندارد يك تكنيك، تفاوت زیادي دارد. يك مطالعه جديد نشان داد فرآورده PRP حاصل از يك تكنيك توليد PRP مي‌تواند تا 50% از نظر غلظت پلاكت تنوع داشته باشد. اين تنوع ممكن است عدم يكنواختي در نتايج باليني حاصل از برخي فرآورده‌هاي PRP را توضيح دهد.

 

پلاکت‌های سلامتی بخش

 

مراحل جداسازی و فرآوری پلاکت‌ها

به طور کلی برای جداسازی پلاکت‌ها چهار مرحله وجود دارد.

  • خون‌گیری: در این مرحله خون، به ميزان اشاره شده در كيت از بیمار اخذ می‌گردد و با ضد انعقاد مناسب مخلوط می‌شود.
  • سانتریفیوژ: خون گرفته شده سانتریفیوژ می‌شود تا پلاکت‌ها و پلاسما از گلبول‌ها جدا شوند.
  • جداسازی: پلاکت‌ها و پلاسما از گلبول‌های خون جدا می‌شوند.
  • فعال سازی و تزریق: با توجه به اينكه خون در مرحله خونگيري با ماده‌ي ضد انعقاد مخلوط شده و بدين طريق با اتصال سيترات به كلسيم، از فعال شدن پلاكت‌ها و شروع فرآیند لخته شدن جلوگيري مي‌شود، لذا متخصصين معتقدند قبل از تزريق پلاكت‌ها، بايد آنها را فعال نمود تا ضمن تشکیل لخته، فاکتورهای رشد نیز آزاد شوند. از گلوكونات كلسيم (به نسبت يك به ده) به عنوان فعال كننده استفاده مي‌شود.

فعال‌سازی سبب آزادسازی 70% فاکتورهای رشد ذخیره شده‌ی پلاکتی در عرض ده دقیقه و نزدیک به 100% در مدت یک ساعت می‌شود. مقدار کمی نیز در طول مدت زندگی پلاکت‌ها آزاد می‌شود. پس از اين ترشح ناگهاني‏، پلاكت‌ها‏ شروع به سنتز پروتئين‌هاي موردنياز خود مي‌نمايند. PRP فعال شده ظرف مدت كوتاهي (شش تا ده دقيقه) لخته مي‌شود و تزريق آن با سرنگ سخت است.

بسياري از فاكتورهاي رشد، نيمه‌عمر كوتاهي دارند و بيشترين اثر خود را در ناحيه تزريق به جا مي‌گذارند. پلاكت‌ها در طول مدت عمر خود پس از تزريق، كليه فاكتورهاي رشد موردنياز را براي ترميم بافت ساخته و در موضع درمان ترشح مي‌كنند، فازهاي سه‌گانه ترميم بافتي يعني التهاب، تكثير و تمايز، فرآیند ترميم را شروع نموده و ظرف شش ماه، موضع تزريق را به طور كامل با بافت‌هاي بالغ بازسازي مي‌كنند.

PRP تهیه شده در سازمان انتقال خون به عنوان پلاسمای غنی از پلاکت همولوگ (مشتق از دیگران) شناخته می‌شود و برای درمان بیماران نیازمند به این فرآورده مورد استفاده قرار می‌گیرد. فرآورده پلاکتی در بیماران نیازمند، مانند مبتلایان به لوکمی، سرطان و بدخیمی، افراد فاقد پلاکت کافی یا دچار اختلال عملکردی پلاکت، افراد تحت شیمی درمانی، بیماران تحت پیوند مغز استخوان و مواردی که کمبود پلاکت سبب بروز بحران حیاتی می‌شود، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

در مراكز انتقال خون پلاكت علاوه بر روش تهیه پلاکت از خون کامل اهداکنندگان، آن را از طريق فرآیند آفرزيس (Apheresis) هم تهیه مي‌كنند. در اين روش، خون اهداكننده، وارد دستگاه خاصي مي‌شود. اين دستگاه با استفاده مكانيسم سانتريفيوژ، خون را به اجزاء تشكيل دهنده آن تجزيه كرده و سپس پلاکت‌ها را جمع‌آوري و بقيه اجزاء را به اهداكننده برمي‌گرداند. فرآورده تهيه شده از اين طريق، شش برابر فرآورده تهيه شده از يك واحد خون كامل، پلاكت دارد:

 

شرايط استاندارد جداسازی پلاکت و تهيه PRP

تركيب PRP با تكنيك تهيه آن تغییر می‌کند. اگرچه همه فرآورده‌هاي PRP واجد يك سري از فاكتورهاي رشد هستند، اما غلظت نسبي هر فاكتور مي‌تواند در فرآورده‌هاي مختلف متفاوت باشد. حتي با پروتكل‌هاي اختصاصي تهيه PRP مورد استفاده غلظت پلاكتي در فرآورده نهايي PRP نه تنها در بين تكنيك‌هاي مختلف تفاوت دارد، بلکه در يك تكنيك مشخص هم متفاوت است.

برای تهیۀ PRP پيروي از اصول علمي و استفاده از کیت استاندارد الزامي است. کیت‌هاي استحصال پلاسماي غني از پلاكت، گوناگون می‌باشند ولی انتخاب صحيح کیت استاندارد، همراه با رعایت شرایط استاندارد جداسازی و تغلیظ پلاکت، برای دستیابی به منافع حداکثر درمان بسیار حائز اهمیت است. همچنين تهیه PRP باید به گونه‌ای باشد که پلاکت‌ها آسیبی نبینند تا وقتی که تزریق شدند پلاکت‌های سالمی باشند.

انتخاب رگ مناسب كه بتوان به اندازه كافي و مناسب و بدون ايجاد فشار خون‌گيري نمود، حائز اهميت فراوان است و در اين زمينه براي تهيه پلاكت باید رگی را انتخاب نمود که بتواند خون کافی را برای تهیه PRP تأمین نماید. نمونه‌گيري از بيمار بايستي در شرايط مناسب و بدور از از استرس، در مدت زمان مناسب صورت پذيرد؛ بدين معنا كه همواره از ايجاد حتي كوچكترين لخته در نمونه بايستي اجتناب گردد. در ضمن هرچه طول زمان خون‌گيري كوتاه باشد، آسيب و تحريك پلاكتي كمتر رخ مي‌دهد.

تنها يک سوزن براي خونگيري استفاده شود، تا احتمال فعال شدن پلاکت‌ها کاهش يابد. اگر خونگيري يکنواخت نيست و يا لازم است سوزن در رگ چرخانده شود از محل ديگري براي خونگيري استفاده گردد. اگر خونگيري بيمار دشوار است، براي هدايت سوزن باید از سونوگرافي کمک گرفت. با کاربرد روش استريل، خون وريدي در سيستم بسته در سانتريفیوژ گذاشته شود. بهتر است این کار در دماي اتاق بوده و کمترين دستکاري صورت گيرد. اگر چند PRP براي بيماران بطور هم‌زمان آماده شده باشد، برچسب مناسب زده شود تا امکان تزریق اشتباه وجود نداشته باشد.

پلاکت‌ها به استرس بسیار حساس بوده و اگر در حین جداسازی درست جدا نشوند، قبل از تزریق، گرانول‌های حاوی فاکتورهای رشد را به داخل پلاسما رها می‌کنند. تزریق چنین محصولی، تزریق پلاسمای فاقد عوامل مفید و درمان کننده است. گرچه در ابتدا به دلیل ادم حاصله ممکن است بعلت تورم در ناحیه چروک، باعث بهتر شدن چروک و یا از بین رفتن تیرگی زیر چشم شود ولی در حقیقت، پروسه درمان و تحریک دائمي فیبروبلاست‌ها اتفاق نمی‌افتد.

جهت جلوگيري از رخداد آسيب و مرگ سلولي پلاكتی و همين طور ممانعت از بروز هموليز، استفاده از سرسوزن استاندارد با قطر بزرگ (19G) كه جهت تهيه فرآورده‌هاي خوني بكار مي‌رود الزامي است. خونگيري با سوزن ريزتر، خطر هموليز و تخریب پلاکتی را در زمان خونگيري افزايش مي‌دهد.

تهيه خون بايد بدون ايجاد فشار منفي و فقط با نيروي جريان طبيعي خون و جاذبه صورت گيرد كه این امر با استفاده از كيسه‌هاي استاندارد تهيه پلاكت امكان‌پذير است. گرفتن خون با فشار مكش (مانند آنچه كه در هنگام خونگيري با سرنگ پيش مي‌آيد) و نيز استفاده از سرسوزن معمولي و با قطر كم، مرگ سلولي و تخريب پلاکت‌ها را به دنبال خواهد داشت.

موج‌دار بودن سطح داخلي كيسه‌هاي تهيه پلاكت استاندارد باعث حركت آرام و لغزيدن گلبول‌هاي قرمز و پلاكت‌ها در داخل كيسه شده و سدي در برابر ورود پرسرعت خون به درون كيسه است. ورود آرام خون از تخريب سلولي جلوگيري مي‌كند و حداقل هموليز را سبب مي‌گردد.

استفاده از سديم سيترات به عنوان ضد انعقاد سبب كاهش pH و اسيدي شدن محيط مي‌گردد. اين ضد انعقاد فقط مصرف آزمايشگاهي (in vitro) دارد و جهت كاربري انساني ممنوع است. همچنین ضد انعقاد مصرفي جهت تهیه PRP بر روی میزان پلاکت استحصالی و شکل پلاکت‌های بدست آمده نیز تأثیر فراوانی دارد. ضد انعقاد موجود در كيسه‌هاي تهيه پلاكت استاندارد، CPD-A1 است و محلولی تزريقي (مورد استفاده انسانی) می‌باشد. ضد انعقادCPD-A1 حاوی دکستروز، فسفات و آدنین است. سیترات از طریق جمع کردن کلسیم از محیط از انعقاد جلوگیری به عمل می‌آورد و دکستروز برای متابولیسم انرژی پلاکت در طی دوره نگهداری ضروری است و از تخلیه گلوکز و به دنبال آن کاهش مشخص نوکلئوتیدی‌های آدنین که همراه با از دست رفتن حیات پلاکتی است، ممانعت می‌کند. از اسید آمینه آدنین در CPDA1 جهت تولید مولکول آدنوزین تری‌فسفات (ATP) استفاده می‌شود.

سانتريفيوژ مورد استفاده جهت استحصال و تغليظ پلاكتي بايد استاندارد و كاليبر باشد و تعداد دور آن در دقيقه (rpm) باید همان دوري باشد كه مانيتور دستگاه آن را نشان مي‌دهد. بالانس نبودن لوله‌ها و ايجاد لرزش درسانتریفوژ، نوسانات دور و کم شدن تدریجی سرعت سانتریفوژ باعث مي‌گردند پلاكت‌ها به طور کامل جدا نشوند. براي نتيجه بهتر بايستي از سانتريفيوژي استفاده نمود كه بازوهايش به صورت 180 درجه باز شوند. رعايت شرايط استاندارد سبب دست‌يابي به تعداد حداكثر ممكن پلاكت‌ها خواهد شد.

جداسازی پلاكت بايد در دماي 22 تا 25 درجه سانتي‌گراد باشد. براي همين انتظار حداقل ده دقيقه‌اي بعد از خونگيري تا شروع سانتريفيوژ (براي رسيدن دمای خون 37 درجه سانتي‌گراد به به دماي اتاق22 درجه سانتي‌گراد) باید رعایت شود. بعد از جداسازي پلاكت‌ها، دادن زمان استراحت (rest time) به پلاكت‌ها الزامی است تا پلاکت‌هایی که در طی فرآیند سانتریفیوژ دچار تجمع (aggregation) شده‌اند، مجدداً به حالت سوسپانسیون یکنواخت درآیند.

به علت حساسيت پلاكتي، بايد سانتريفيوژ كردن خون و تغليظ پلاكتي در دور پايين و زمان طولاني باشد. اين حالت ضمن حفظ بهتر پلاكت‌ها، از تشكيل بافي‌کوت حتي‌الامكان جلوگيري مي‌كند. پلاكت‌های حاصل در داخل پلاسما شناور بوده و با چشم غيرمسلح در محلول پلاسما به صورت “ابر پلاکتی” يا “گرداب پلاكتي” (swirling) قابل مشاهده‌اند.

 

ابر یا گرداب پلاکتی

یکی از آسان‌ترین راه‌ها برای تشخیص کیفیت پلاکت‌های استحصالی، بررسی گرداب پلاکتی است. هنگامی که پلاکت‌ها به صورت معلق درآیند باید در مقابل نور، حالت ابری و گردابی را نشان دهند. وجود این حالت، بیانگر حالت دیسکوئیدی پلاکت و کیفیت بالای پلاکت‌های جدا شده است. مزیت این تست، این است که به راحتی در مطب، در بخش بیمارستانی یا در کنار تخت بیمار، قبل از تزریق PRP قابل انجام است. همچنین آموزش افراد دخیل در درمان با PRP جهت مقایسه پلاکت‌های با کیفیت و سالم با پلاکت‌های بدون عملکرد و پلاکت‌هایی که در حین خون‌گیری یا سانتریفوژ تخریب شده‌اند، بسهولت امکان‌پذیر است. این گونه پلاکت‌ها از شکل دیسکوئید و قرص مانند به شکل کروی درآمده‌اند و نمی‌توانند نور را منعکس کرده، حالت گردابی را نشان دهند.

 

علي‌اصغر صفري فرد، كارشناس ارشد خون شناسي و بانك خون

با تشکر فراوان از جناب آقای محمدحسین ارژنگیان، مخترع کیت تهیه پلاسمای غنی از پلاکت

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی