معماری
360px-RFLP_genotyping-1-300x171

تکنیک RFLP

تکنیک RFLP

تاریخچه RFLP ‌
RFLP‌‌‌‌ اولین‌ بار در سال‌ ۱۹۷۴ به‌ عنوان‌ یک‌ مارکر ژنتیکی‌ توسطGrodzicker ‌ و همکاران برای‌ تعیین‌ جهش‌ در ویروس‌ به‌ کار گرفته‌ شد. استفاده‌ ازRFLPبه‌ عنوان‌ مارکر بیماری‌ ژنتیکی‌اولین‌ بار توسطKon ‌و Dozy (1974) برای‌ آنالیز بیماری‌ کم‌ خونی‌ داسی‌ شکل‌ به‌ کار گرفته‌ شد.Botstein و همکاران‌ ۱۹۸۰تئوری‌ پایه‌ این‌ روش‌ را برای‌ نقشه‌یابی‌ ژنهای‌ مرتبط‌ با بیماری‌ درانسان‌ مطرح‌ کردند. Southern روش‌ انتقال‌ الگویDNA ‌ و پروب‌ (کاوشگر) از ژل‌ به‌غشاء نیتروسلولزی‌ درRFLPرا ابداع‌ کرد.

360px-RFLP_genotyping (1)Backman‌‌‌‌ (۱۹۸۶) برای‌ اولین‌ بار استفاده‌ از این‌ نشانگر را مطرح‌ نمود. کاربردهای‌ مهم همچون‌ نقشه‌یابی‌ و دستکاری‌ مکانهای‌ ژنهای‌ کنترل‌ کننده‌ صفات‌ کمی‌ با استفاده‌ ازRFLPدر سال‌۱۹۸۳ توسطBackman‌ وSoller بیان‌ گردید. با گسترش‌ کاربرد این‌ نشانگر قدرتمند چند ژن‌ یا ژنوم‌آنالیز شدند تعدادی‌ از گونه‌های‌ دام‌ چون‌ گاو، گوسفند، بز، اسب، خوک‌ و جوجه‌ نیز با استفاده‌ از این‌نشانگر آنالیز شدند

کلیات‌ تکنیک‌

‌‌‌‌مشخص‌ شده‌ است‌ که‌ ژنوم‌ موجودات‌ به‌ طور طبیعی‌ دارای‌ تفاوتهائی‌ در ردیف‌ بازهای‌ خطی می‌باشند این‌ تغییرات‌ طبیعی‌ که‌ سبب‌ گوناگونی‌ در افراد یک‌ جمعیت‌ می‌شود چند شکلی‌ ژنتیکی‌نام‌ دارد. اگر این‌ چند شکلی‌ در ردیف‌ بازهایDNA ‌ در جایگاه‌ شناسائی‌ آنزیم‌ محدودکننده‌ ایجادشده‌ باشند به‌ راحتی‌ قابل‌ ردیابی‌ استRFLP . وجود الگوهای‌ غیریکسان‌ است‌ که‌ بر اثر هضم‌آنزیمی‌ یک‌ ناحیهِ خاص‌ ازDNA بوسیلهِ آنزیمهای‌ محدود کننده‌ مشخص‌ می‌شود. این‌ الگوهای‌غیریکسان‌ به‌ علت‌ تفاوتDNA ‌ بسته‌ به‌ حضور یا عدم‌ حضور جایگاه‌ آنزیمهای‌ محدود کننده‌بوجود می‌آید این‌ الگوها را به‌ دو شکل‌ می‌توان‌ مشخص‌ کرد .
– هضم‌ آنزیمی‌ و سپس‌ الکتروفوز و استفاده‌ از لکه‌گذاری‌ سادرن‌ PCR قطعه‌ مورد نظر و هضم‌ آنزیمیRFLP‌‌‌‌ مستقیما روی‌ تظاهر ژن‌ از طریق‌ تغییر در شکل‌گیریmRNA ‌و میزان‌ و تعداد نسخه‌برداری‌ تاثیر می‌گذارد.
آنزیمهای‌ محدودگر
‌‌‌‌آنزیمهای‌ برشی‌ دسته‌ای‌ از آنزیمهای‌ آندو نوکلئاز به‌ شمار می‌روند که‌ یک‌ ردیف‌ اختصاصی از بازها را در درون‌ مولکولDNA ‌ دو رشته‌ای‌ شناسائی‌ می‌کنند .
‌‌‌‌در سال‌ ۱۹۷۰ سویه‌های‌ معینی‌ از باکتری‌ که‌ قادرندDNA خارجی‌ را که‌ وارد سلول‌ آن شده‌ تجزیه‌ کنند، کشف‌ گردید. چون‌ با این‌ آنزیمها، سویه‌های‌ ویژه‌ای‌ از باکتری‌ قادر بودند که‌ آلوده‌کنندگی‌ فاژ یا ویروس‌ را کاهش‌ دهند و در واقع‌ زمان‌ میزبانی‌ باکتری‌ را محدود کنند به‌ اسم‌ آنزیم‌محدودگر نامیده‌ می‌شذتد. به‌ دلیل‌ اهمیت‌ این‌ پدیده‌ و نقش‌ کلیدی‌ آن‌ در پیشرفت‌ ملکولی‌ کاشفین‌این‌ آنزیمهای‌ محدودگر سه‌ نفر به‌ اسم‌ آلبر(Albet) )، اسمیتSmith)) ‌)، ناتنز (Nathan)بودند که‌ موفق‌ به‌ دریافت‌ جایزهِ نوبل‌ شدند ‌‌‌‌در بیشتر مواقع‌ توالی‌ شناخته‌ شده‌ این‌ آنزیمها یک‌ پالیندروم‌ است‌ که‌ معمولاً شامل‌ چهار شش‌ جفت‌ باز دارای‌ تقارن‌ دو طرفی‌ است، یعنی‌ از چپ‌ و راست‌ به‌ یک‌ صورت‌ خوانده‌ می‌شود.
‌‌‌‌زمانی‌ که‌ یک‌ آنزیم‌ برشی‌ بهDNA ‌ اضافه‌ می‌شودDNA از بسیاری‌ از مکانها که‌ از آنها قبلاعنوان‌ سایت‌ برشی‌ یاد شد، شکاف‌ برمی‌دارد و در اصط‌لاح‌ هضم‌ می‌شود. حاصل‌ فرآیند هضم،تعدادی‌ قطعه‌ است، در ذیل‌ چند مثال‌ از آنزیمهای‌ برشی‌ آورده‌ شده‌ است:
‌‌‌‌در روشRFLP ‌ ابتدا نمونه‌ای‌ ازDNAرا با یکنوع‌ آنزیم‌ برشی، هضم‌ می‌کنند که‌ در نتیجه تعداد زیادی‌ قطعه‌ با طول‌ متفاوت‌ بدست‌ می‌آید، سپس‌ این‌ قطعات‌ با استفاده‌ از ژل‌ آگارز ازهمدیگر جدا می‌شوند شناسائی‌ وتشخیص‌ یک‌ قطعه‌خاص‌ با استفاده‌ از کاوشگرها امکانپذیر است‌که‌ این‌ عمل‌ با استفاده‌ از تکنیک‌ دیگری‌ تحت‌ عنوان‌ لکه‌گذاری‌ سادرن‌ صورت‌ می‌گیرد.
پروب‌ یا کاوشگر
‌‌‌‌قطعهِ خاصی‌ ازDNAرا که‌ متعلق‌ به‌ توالی‌ از یک‌ ژن‌ خاص‌ یاcDNA می‌باشد، بوسیله آنزیمهای‌ برشی‌ خاص‌ هضم‌ و قطعات‌ حاصل‌ در حامل هایی‌ (پلاسمید) که‌ توسط‌ همان‌ آنزیم‌محدودگر برش‌ داده‌ شده‌اند جاگذاری‌ می‌شود. این‌ پلاسمیدها جهت‌ تکثیر و نگهداری‌ به‌ باکتریهای‌آزمایشگاهی‌ که‌ اغلب‌ اشریشا کلی‌ هستند منتقل‌ می‌شوند. کلونهای‌ یاد شده‌ توسط‌ رادیو ایزوتوپها یامواد شیمیایی‌ چون‌ بیوتین‌ نشاندار می‌شود. در صورت‌ وجود همگنی‌ ردیف‌ بازی‌ مشابه‌ بین‌ پروب‌وDNA هضم‌ شده‌ اتصال‌ بین‌ این‌ دو برقرار خواهد گردید.
لکه‌گذاریSouthern‌‌ ‌
‌‌‌‌برای‌ انجام‌ عمل‌ هیبرایداسیون‌ لازم‌ است‌ که‌ علاوه‌ بر قطعه‌ کاوشگر، قطعاتDNA ‌هضم شده‌ نیز تک‌ رشته‌ای‌ شوند لذا ابتداDNA روی‌ ژل‌ آگارز که‌ حاوی‌ قطعات‌ هضم‌ شده‌ است‌ درمحلولهای‌ قلیائی‌ مثل‌ اوره‌ یا فرمالدئید یا هیدروکسیدسدیم‌ تک‌رشته‌ می‌نمایند. سپس‌ صفحه‌ای‌ ازغشاء نیترو سلولزی‌ را روی‌ قسمت‌ فوقانی‌ ژل‌ قرار داده‌ و روی‌ آن‌ غشاء مقداری‌ کاغذ جاذبه‌ الرطوبه‌می‌گذارند محلول‌ بافر تانک‌ الکتروفوزر بوسیله‌ فشار اسمزی‌ کاغذ فوقانی‌ بالا کشیده‌ می‌شود و حین‌عبور از ژل‌ به‌ غشاء نیترو سلولزی‌ که‌ دارای‌ بار مثبت‌ است‌ منتقل‌ می‌گردد. با تسهیل‌ عمل‌هیبریداسیون‌ بین‌ کاوشکر و قطعاتDNA ‌ هضم‌ شده‌ در معرض‌ پروب‌ نشاندار رادیواکتیو در نقاطی‌که‌ همولوژی‌ وجود دارد هیبرید می‌گردد. قطعاتی‌ که‌ هیبریداسیون‌ در آنها صورت‌ نگرفته‌ است‌ ازمحیط‌ شسته‌ می‌شوند و سپس‌ از غشای‌ نیترو سلولزی‌ در مجاورت‌ فیلم‌ عکاسی‌ اتورادیوگرافی‌بعمل‌ می‌آید پس‌ از ظهور و ثبوت‌ فیلم‌ قطعات‌ ویژه‌ای‌ ازDNA که‌ با پروب‌ هیبرید هستند به‌صورت‌ یک‌ باند مرئی‌ دیده‌ می‌شود .مزایایRFLP ‌ عبارت‌ است‌ از موارد زیر می‌باشد:
– تحت‌ تاثیر محیط‌ نیست‌ و صددرصد ژنتیکی‌ است‌
– همبارز است‌
– تکرار پذیری‌ آن‌ بالاست‌
(PCR-RFLP(PBR
‌‌‌‌در روش‌ دومRFLP ‌، ابتدا قطعه‌ حاوی‌ جایگاه‌ چند شکلی‌ را با واکنش‌ زنجیرهِ پلی‌مراز واستفاده‌ از دو پرایمر مخصوص‌ که‌ به‌ همین‌ منظور طراحی‌ شده‌ تکثیر می‌نمایند و پس‌ از هضم‌آنزیمی، الکتروفوز می‌کنند. درPBR جهش هایی‌ از نوع‌ نقطه‌ای‌ و حذف‌ و اضافه‌ که‌ باعث‌ تغییر درسطح‌ قطعه‌ آنزیمی‌ می‌گردند قابل‌ تشخیص‌ است‌ .
‌‌فرق‌ لکه‌گذاری‌ سادرن‌ وPBR
‌‌‌‌در RFLPسادرن‌ تنوعDNA‌در داخل‌ یک‌ منطقهKb ‌۳۰ محصور توسط‌ پروب‌ تعیین می‌گردد در حالیکه‌ درPBR تنوع‌ در داخل‌ منطقه‌ای‌ که‌ از دو طرف‌ به‌ پرایمر ختم‌ شده‌ تعیین‌می‌شود این‌ ناحیه‌ معمولاKb2-0.5است. علاوه‌ بر این‌ درPBRمزایائی‌ چون‌ سادگی، سرعت‌زیاد، عدم‌ نیاز به‌ مواد رادیواکتیو و تکرارپذیری‌ بالا مطرح‌ می‌باشد .
‌‌‌‌میزان‌ پلی‌مورفیسم‌ و تعداد آللها درPBR کمترازRFLPسادرن‌ می‌باشد عباسی‌ (۱۳۷۶)نشانگرPBRبرای‌ تشخیص‌ پلی‌مورفیسم‌ در ژن‌ هورمون‌ رشد گاوهای‌ هلشتاین‌ استفاده‌کرد Aggrey‌‌‌‌و همکاران‌ (۱۹۹۹) از مارکرPBR برای‌ تشخیص‌ پلی‌ مورفیسم‌ در ناحیهِ مجاور ژن‌ گیرنده‌ هورمون‌ رشد در گاوهای‌ هلشتاین‌ کانادا استفاده‌ نمودند و الگوهای‌ باندی‌ مختلفی‌ را درروی‌ ژل‌ مشخص‌ نمودند.

 

 

پاسخ دهید