معماری

خصوصيات پرايمرها

پرايمر يك قطعه اسيد نوكلئيك است كه داراي توالي بسيار اختصاصي مكمل يك ژن مي‌باشد. بطور كلي هرگاه كه لازم باشد تا ژن خاصي در بين مجموعه‌اي از ژن‌ها پيگيري و شناسايي شود از پرايمرها (شناساگرها) استفاده مي‌شود. براي اينكه شناساگر بطور مناسب مورد استفاده قرار گيرد بايد داراي خصوصياتي باشد كه در زير به آنها اشاره مي‌شود:

الف) تك رشته‌اي بودن: از آنجايي كه پرايمرها بايد با قسمت خاصي از ژن مكمل شوند بايد تك رشته‌اي باشند ولي تفاوتي ندارد كه شناساگر RNA یا DNA باشند.

ب) اختصاصي بودن: يك پرايمر بايد با توجه به ژن‌هاي مورد بررسي كاملاً اختصاصي باشد. يعني فقط با ژن‌هاي مورد نظر هيبريد شود و اين مهم‌ترين خصوصيت يك شناساگر مي‌باشد.

ج) نشاندار بودن: به منظور پيگيري، يك پرايمر حتماً بايد نشان‌دار باشد. نشاندار كردن شناساگر بوسيله مواد راديواكتيو و يا بوسيله مواد فلورسانس صورت مي‌گيرد. اين خصوصيت شناساگر نيز مهم است زير بدون نشاندار بودن نمي‌توان مكان شناساگر را پيدا كرد.

طراحي پرايمرها

براي تهيه و طراحي يك شناساگر براي يك ژن خاص از سه روش زير استفاده مي‌شود:

1- تعيين توالي ژن مورد نظر: براي اين كار ژن مورد نظر را جدا كرده و توالي آن را تعيين مي‌كنند، سپس قسمت كوتاهي از اين توالي را انتخاب نموده و مكمل اين قسمت را به طور مصنوعي مي‌سازند و پس از نشاندار كردن، از آن به عنوان شناساگر استفاده مي‌كنند. اين روش در صورت دسترسي توالي ژن مورد نظر راحت‌ترين روش طراحی شناساگر مي‌باشد.

2- استفاده از mRNA: براي اين كار mRNA ساخته شده از روي ژن مورد نظر را جدا مي‌كنند. چون اين mRNA دقيقاً از روي ژن مورد نظر نسخه برداري شده است، مي‌توان قسمتي از اين mRNA را نشاندار كرده و به عنوان شناساگر استفاده كرد.

همچنين مي‌توان از روي mRNA، DNA ساخت؛ براي اين منظور از آنزيم ترانس- كريپتاز معكوس[1] كه از رتروويروس‌ها جدا مي‌شود، استفاده مي‌كنند. چون آنزيم RT نيز مانند DNA پلي‌مرازها به يك قطعه اوليه براي شروع سنتز نياز دارد بايد يك قطعه پرايمر را در اختيار آن قرار داد. چون mRNAپروكاريوت‌ها معمولاً يك دم پلي A در قسمت دارد قطعه پرايمر معمولاً پلي T است. در مرحله بعد بوسيله RNaseH رشته RNA هيدروليز شده و با كمك آنزيم DNA پلي‌مراز I رشته مكمل DNA ساخته مي شود. بدين ترتيب يك DNA دو رشته‌اي حاصل مي‌شود چون اين DNA بطور مكمل RNA ساخته شده است به آن cDNA      (DNA مكمل[2]) گفته مي‌شود. سپس دو رشته cDNA از هم جدا شده و پس از نشاندار شدن به عنوان شناساگر مورد استفاده قرار مي‌گيرند. بايد توجه داشت كه در سلول‌هاي یوكاريوتي به دليل حذف اينترون‌ها از cDNA، mRNA ساخته شده مكمل قسمت‌هاي اينترون نخواهد بود.

3- استفاده از پروتئين: توالي اسيد آمينه يك پروتئين تابع ژن كد كننده آن است، به همين دليل از روي توالي يك پروتئين خاص مي‌توان به توالي ژن كد كننده آن پي برد. ولي به دليل وجود چندين كد براي يك اسيد آمينه، اين تعيين توالي تقريبي می‌باشد. به هر حال براي اين منظور پروتئين مورد نظر را خالص كرده و توالي اسيد آمينه‌هاي قطعه‌ای از آن تعيين مي‌شود، سپس از روي اين توالي‌ها و با استفاده از جدول، كد ژنتيكي قطعه مكمل رشته DNA ساخته مي‌شود. براي جلوگيري از بروز اشتباه به دليل وجود كدهاي مختلف براي اسيدهاي آمينه، کلیه احتمالات ممكن را در نظر مي‌گيرند و چندين نوع مختلف از شناساگرها را سنتز مي‌كنند، سپس اين قطعات را نشاندار كرده و به عنوان پرايمر مورد استفاده قرار مي‌دهند.

در كل بايد براي طراحي پرايمري به نكات زير توجه كرد:

1- طول اين الیگونوكلئوتيدهاي سنتزي بين 15 تا 30 نوكلئوتيد است که بهتر است كه بين 24 – 18 نوكلئوتيد باشد.

2- براي ساختن پرايمر از طرف به پرايمر به صورت نوكلئوتيدهاي 3 تايي پشت سر هم در نظر گرفته مي‌شود. در انتهاي جهت ، سعي شود كه نوكلئوتيد انتهايي G يا C باشد.

3- توالي پرايمر F (Forward) از توالي نوكلئوتيدي شروع شود. در حالي كه توالي پرايمر R (Reverse) معمولاً از توالي نوكلئوتيدي در نظر گرفته می‌شود.

4- هر قدر طول پرايمر بيشتر باشد، دماي اتصال پرايمر (Annealing) نيز افزايش مي‌يابد.

5- هر قدر طول پرايمر كوتاه‌تر باشد، تكثير غير اختصاصي بيشتر خواهد بود.

6- پرايمرها بايد طوري طراحي شوند كه در قسمت بين پرايمرها، شباهتي وجود نداشته باشد زيرا مانع اتصال با الگو مي‌گردد.

7- بين دو پرایمر نبايد تشابهاتي وجود داشته باشد زيرا منجر به تشكيل دايمر پرايمر و مانع تكثير DNA خواهد شد.

8- درصد بازهاي C+G بايد بين 45 تا 60 درصد باشد. پرايمرPoly G يا Poly C موجب مكمل شدن غير اختصاصي مي شود. از حالت Poly A،Poly T نيز بايد اجتناب شود زيرا باعث تكثير مي‌گردد.

9- سعي شود كه در انتهاي پرايمر، نوكلئوتيد، يا G يا GC يا CG انتخاب شود كه مانع آزاد ماندن انتهاي شده و به اتصال صحيح كمك خواهد كرد و كارآيي PCR را افزايش مي‌دهد.

10- در انتهاي بيشتر از دو باز C يا G قرار نگیرد تا فرآورده غير اختصاصي PCR حاصل نشود.

11- دماي ذوب آنها در حدود 72 – 55 درجه و گاهي تا 80 درجه سانتيگراد باشد.

12- دماي ذوب دو پرايمر يكسان بوده و از فرمول زير محاسبه مي‌شود؛ (لازم بذکر است این فرمول برای الیگونوکلئوتیدهای 30 – 18 بازی مناسب می‌باشد):

Tm=2 (A + T) + 4 (C + G)

13- توالي پرایمر نبايد موجب ايجاد ساختمان دومي (ثانويه) در آن گردد.

نرم‌افزارهای طراحی پرایمر:

امروزه برنامه‌های متنوعی جهت طراحی پرایمر و پروب مورد استفاده قرار می‌گیرند که مهم‌ترین آنها موارد زیر می‌باشند:

  • Oligo

–    GCG

  • BioTools
[1] -Reverse Transcriptase (RT)

[2] – Complementary DNA (cDNA)