معماری

خطي بودن و تأييد كاليبراسيون يك روش آزمايشگاهي

خطي بودن و تأييد كاليبراسيون يك روش آزمايشگاهي

در سال 1988 براي اولين بار برنامه خطي بودن (Linearity) آزمايش‌ها و تأييد كاليبراسيون (Calibration verification) دستگاه‌هاي اندازه‌گيري در هر شش ماه يكبار بوسيله (CLIA) براي آزمايشگاه‌هاي باليني امريكا اجباري شده، مؤسسات قانوني اجراكنندگان برنامه كنترل كيفيت خارجي بخصوص CAP College of American Pathologist))، اين برنامه را بنام LN آغاز كرده و در اختيار آزمايشگاهيان قرار مي‌دهند. از آن زمان تاكنون برنامه CAP گسترش فراوان يافته و علاوه بر تهيه و ارسال نمونه‌هاي PT (proficiency test) و CV/L Calibration verification /Linearity))، نمونه‌هاي ديگر براي سنجشcarry over ، تداخل مواد (Interference)، ‌كنترل حجم نمونه‌برداري دستگاه‌هاي اندازه‌گيري، ارزيابي پي‌پت‌هاي اتوماتيك، ميكروسكوپ و غيره براي كمك به آزمايشگاه‌ها تهيه نموده است.

در كشور ما كه از دو سال پيش، بعد از سال‌ها وقفه و يا افت و خيز، برنامه كنترل كيفيت خارجي توسط انجمن‌هاي آزمايشگاهي كه از طرف دولت صلاحيت آنها تأييد شده است آغاز شده و يقيناً باعث بالا رفتن سطح اعتماد پزشكان به آزمايشگاه‌ها گرديده است. از آنجا كه نتايج بعضي از آزمايشگاه‌ها به لحاظ آماري، پراكندگي غير قابل قبولي داشته كه نشان دهنده كمي دقت و درستي كيت‌ها و يا عدم كاليبراسيون صحيح و بموقع دستگاه‌هاي اندازه‌گيري مي‌باشند، لازم ديده شد كه درباره آن چاره‌جوئي شود. اولين گامي كه در اين راه برداشته شد آغاز برنامه كنترل كيفيت مداوم و peer group توسط انجمن دكتراي علوم آزمايشگاهي است تا با بررسي نتايج هر ماهه توسط انجمن و مسئول آزمايشگاه، دقت و درستي نتايج آزمايشگاه‌ها ارزيابي شود تا اگر از كيت‌هاي تأييد نشده از طرف مقامات قانوني و يا از محلول‌هاي استاندارد و راكتيوهاي تاريخ گذشته و با كيفيت كم استفاده به عمل آمده مشخص شده و اقدامات ضروري به عمل آيد. بايد كوشش شود تا هر چه بيشتر آزمايشگاه‌هاي كشور در اين برنامه علمي كم خرج و تأييد شده از طرف CLIA و ISO شركت كرده تا قادر باشند اشكالات آزمايشگاه را در اسرع وقت و بدرستي شناسايي نموده و آن را برطرف نمايند.

برنامه ديگري كه در اين رابطه كمك زيادي به آزمايشگاه مي‌نمايد اجراي برنامه خطي بودن آزمايش‌ها و تأييد كاليبراسيون (Calibration verification) دستگاه‌هاي اندازه‌گيري مي‌باشد. براي اجراي اين برنامه انجمن دكتراي علوم آزمايشگاهي پيشقدم شده و گام‌هاي اوليه را در اين جهت پيموده است. همانطوري كه انجمن اعتقاد دارد”كيفيت را پاياني نيست”، اميد است در اجراي اين امر مهم كه كمك به بالا بردن كيفيت اندازه‌گيري آزمايشهاي بيماران و جلب اطمينان پزشكان كشور خواهد شد، موفق شوند.

با توجه به اين امر مهم تصميم گرفته شد تا درباره خطي بودن و تأييد كاليبراسيون دستگاه‌هاي اندازه‌گيري توضيحاتي داده شده و طرز كار اين موضوع توسط CAP نيز مورد بررسي گيرد.

تائيد خطي بودن و كاليبراسيون

Linearity & Calibration verification

بعد از تصويب و لزوم اجراي برنامه كنترل كيفيت خارجي براي آزمايشگاه‌هاي امريكا‏‏، CAP كه يكي از ارگان‌هاي مورد قبول براي اجراي آن بود، برنامه خطي بودن و تأييد كاليبراسيون دستگاه‌هاي اندازه‌گيري را نيز شروع كرد. برنامه PT كالج پاتولژيست‌هاي امريكا كه در سال 1998 آغاز شد تاكنون بيش از 580 Survey داشته و با 108 كشور جهان و 22000 آزمايشگاه همكاري نزديك دارد. CAPبا وجود تعداد بالاي اين آزمايشگاه‌ها اشكال يافتن peer group براي مقايسه نتايج آزمايشگاه‌هاي كوچك را ندارد. CAP علاوه بر داشتن 580 Survey داراي محلول‌هاي استاندارد براي تعيين ميزان تداخل، carry over دستگاه‌ها، تأييد دقت پي‌پت‌هاي اتوماتيك، سنجش درستي ميكروسكوپ‌ها و غيره مي‌باشد.

خطي بودن يك آزمايش

تعريف: آزمايشي خطي است كه مقادير حاصله از آزمايش موردنظر روي خط مستقيم قرار گيرند. در سال 1993 مؤسسه1CLSI تعريف دقيق‌تري ارائه داد.” نتايج يك آزمايش زماني خطي مي‌باشد كه خط حاصل از Fitted Polynominal با خط ايده‌آل كه از معادله Linear Regression بدست مي‌آيد تفاوت معني‌داري نداشته باشد.

در سال 2003 اين تعريف با اندك تغييري از CLSI بنام EP-G پذيرفته شد.

برنامه‌هاي كامپيوتري متعددي براي خطي بودن آزمايش‌ها وجود دارند كه مي‌توان از آنها استفاده نمود. يكي از آنها EP- Evallutor مي‌باشد كه با استفاده از خطاي كل مجاز ATe و ميزان دقت هر آزمايش خطي بودن آن را پس از وارد كردن داده‌ها به كامپيوتر معلوم مي‌سازد. استفاده از كامپيوتر و بكار بردن برنامه آن آزمايش خطي بودن را آسان‌تر نموده و علاوه بر آن:

  • خطي بودن آزمايش را با توجه به مقادير اندازه گيري و ATe مشخص مي‌كند.
  • نقاط خارج از خطي بودن را نشان مي‌دهد.
  • نقاط خارج را نديده گرفته و خط واقعي را نيز رسم مي‌كند.
  • Fitted Line و يا خطي بودن ايده‌آل آزمايش را نشان مي‌دهد.

بايد توجه داشت كه واكنش دستگاههاي اندازه گيري براي بسياري از آزمايشات خطي نمي‌باشد؛ مثل واكنش‌هاي EIA (Enzyme Immunoassay) شكل (1)

الف: رابطه خطي بودن با دقت

‌ميزان دقت هر آزمايشي در خطي بودن آن آزمايش اثرگذار مي‌باشد. مثلاً محلول‌هايي كه غلظت آنها برابر 84.0، ‌81.1، 47.3 و 59.3 است اگر براي آزمايش خطي بودن با دو دستگاه مختلف آزمايش شوند ديده مي‌شود كه دستگاه اول (a) دقيق‌تر و فواصل جواب‌ها نزديكتر بوده در حاليكه دستگاه دوم (b) دقت كمتري داشته و نتايج از هم فاصله بيشتري دارند. با توجه به اين امر ديده مي‌شود كه (Best fit polynomal) براي دستگاه (a) ‌غيرخطي و براي دستگاه (b) ‌خطي مي‌باشد. درصد عدم دقت دستگاه (a) ‌6.3 درصد و براي دستگاه (b) 7.18 درصد مي‌باشد، بنابراين ديده مي‌شود كه ميزان دقت چه تأثيري در آزمايش خطي بودن يك آزمايش دارد. شكل (2)

ب: رابطه خطي بودن با درستي

مقدار خطاي كل مجاز تأثير مهمي بر خطي بودن يك آزمايش دارد.

اگر ميزان خطاي كل مجاز (ATe) زياد باشد احتمال خطي نشدن نتايج زياد است و برعكس هرچه اين خطا كه مجموعه‌اي از خطاي سيستماتيك و دقت مي‌باشد كمتر باشد شانس خطي شدن يك آزمايش بيشتر است.

ج- رابطه خطي بودن و دامنه اندازه‌گيري

دامنه اندازه‌گيري يك دستگاه كه آن را Analytical Measurment Range (AMR) نيز مي‌گويند چنين تعريف شده است:

AMR دامنه كمترين و بالاترين مقداري است كه مي‌شود بدون تغييرات (مثل رقيق كردن و يا غليظ نمودن) ‌اندازه‌گيري نمود. در آزمايش خطي بودن حدود مشخصي مورد نظر است كه تا آن حد، ‌حاصل آزمايش بايد خطي باشد. بهرحال دامنه AMR يك روش آزمايشي، از ميزان خطي بودن آن بيشتر است. شكل (3)

د- رابطه خطي بودن با كاليبراسيون

بسياري از آزمايش‌هايي كه توسط دستگاه‌هاي جديد اندازه‌گيري مي‌شوند كاليبراسيون آنها با دو محلول استاندارد، يكي صفر و ديگري مثلاً (mg/dl) 200 (براي كلسترول) انجام مي‌شود. با آزمايش خطي بودن مي‌توان كاليبره بودن اين دستگاه‌ها را به آساني معلوم نمود ولي اگر كاليبراسيون با چند استاندارد و با غلظت‌هاي متفاوت صورت گيرد آزمايش خطي بودن نمي‌تواند كاليبراسيون را تأييد نمايد.

آزمايش خطي بودن

همانطوري كه توضيح داده شد آزمايش خطي بودن يك آزمايش بايد قبل از استفاده از آن آزمايش، عوض شدن شماره ساخت (Lot Number)، پايان زمان انقضاء و بطور كلي هر شش ماه يكبار انجام شده و مدارك آن در آزمايشگاه بايگاني ‌شود. اين امر توسط ISO و CLIA ‌تأكيد شده است.

براي اين آزمايش لازم است آزمايشگاه پيش‌بيني كند كه:

  • اگر مي‌خواهد در برنامه خطي بودن يكي از انجمن‌هاي ذيصلاحيت شركت كند، در اين صورت مواد لازم و دستور انجام خطي بودن معلوم است ولي اگر بخواهد در آزمايشگاه انجام شود بايد به اين نكات توجه كند:
  • چه مقدار از نمونه‌هاي مورد آزمايش براي انجام خطي بودن لازم است؟
  • غلظت هر كدام چقدر بايد باشد تا دامنه مورد نظر را پوشش دهد؟
  • اين نمونه‌ها را مي‌توان به طرق زير خريداري و يا تهيه نمود:

الف- از كمپاني‌هاي مورد اطمينان، كيت خطي بودن آزمايش را تهيه نمود.

ب- از مواد رفرانس كه قبلاً از آن استفاده شده محلول‌ها را تهيه نمود.

ج- از نمونه‌هاي باقيمانده از PT استفاده كرد.

د- از دو نمونه يكي با غلظت بالا و ديگري با غلظت صفر مي‌توان 5 تا 6 نمونه با غلظت‌هاي مختلف تهيه و از آنها استفاده كرد.

نكته مهمي كه در انتخاب نمونه‌ها لازم است مورد توجه قرار داد Matrix و عدم وجود تداخل كننده‌ها مي‌باشد. Matrix مواد خريداري و يا تهيه شده بايد همانند سرم طبيعي بوده و هيچگونه مواد تداخل كننده‌اي كه در آزمايش اثرگذار مي‌باشد، نداشته باشد.

 

ارزيابي CAP از خطي بودن و كاليبراسيون

  • خطي بودن

CAP نتايج خطي بودن يك آزمايش را پس از مقايسه با نتايج آزمايشگاه‌هاي همگروه بصورت زير گزارش مي‌كند:

  • Linear خطي است: نتيجه آزمايشات خطي بوده و توافق با نتايج همگروه دارد. اگر اختلافي داشته باشد مربوط به شانس است كه قابل گذشت مي‌باشد.
  • Linear (خطي است): نتيجه آزمايشات خطي بوده و از نظر آماري و كلينيكي قابل قبول مي‌باشد.
  • Nonlinear (خطي نيست):‌ نتيجه خطي نبوده و ممكن است از نظر كلينيكي تفاوتش معني‌دار باشد.
  • Nonlinear (خطي نيست): نتيجه خطي نبوده و از نظر آماري نيز اختلاف، معني‌دار مي‌باشد.
  • تأييد كاليبراسيون

CAP تأييد كاليبراسيون را نيز به چهار صورت زير گزارش مي‌نمايد:

الف: 1-Verified‌ (تأييد شده): كاليبراسيون تأييد شده و اگر اختلافي بين ضريب زاويه (كه بايد واحد باشد) و عدد ثابت (كه بايد صفر باشد) ‌وجود دارد اين اختلاف از نظر آماري معني‌دار نيست.

ب- 2- Verified: كاليبراسيون تأييد شده زيرا نتايج هيچيك از خطاهاي حاصل از آزمايش نمونه‌ها از حد خود تجاوز نكرده و تغييرات ضريب زاويه و عدد ثابت معني‌دار نمي‌باشد.

ج- 1-Different: كاليبراسيون تأييد نشده و حداقل نتيجه يكي از نمونه‌ها با مقدار معدل گروه اختلاف معني‌دار داشته ولي تفاوت بين عدد ثابت و ضريب زاويه معني‌دار نيست.

د- 2 -Different: كاليبراسيون تأييد نشده حداقل نتيجه يكي از نمونه‌ها با مقدار معدل گروه، عدد ثابت و ضريب زاويه نيز اختلاف معني‌دار دارند.

CAP علاوه بر اصطلاحات فوق كه براي ارزيابي خطي بودن و تأييد كاليبراسيون يك آزمايش استفاده نموده و آزمايشگاه‌ها را ارزيابي مي‌كند واژه‌هاي ديگري را نيز بكار مي‌گيرد كه دانستن آنها اهميت دارند.

اين واژه‌ها عبارتند از:

  • خطاي كل مجاز – خطاي كل مجاز يا Allowable Error ‌بر اساس فرمول زير محاسبه مي‌شود:

 

خطاي كل مجاز = 100 ×

 

براي اين محاسبه CAP از جدولي كه CLIA قبول نموده است استفاده مي‌كند. در اين جدول مقدار خطاي كل مجاز و كمترين مقدار قابل اندازه‌گيري آزمايش‌هاي بيوشيمي آورده شده است. مثلاً براي كلسترول اين مقادير به ترتيب عبارت از 5.9% و mg/dl 3 مي‌باشد، بنابراين اگر معدل كلسترول همگروه شركت كنندگان در PT ‌برابر با mg/dl 150 باشد مقدار خطاي مجاز مساوي خواهد بود با:

 

 2%= 100 ×

جدول (1) مقادير خطاي كل مجاز و كمترين مقدار قابل اندازه‌گيري بعضي از آزمايش‌هاي بيوشيمي را نشان مي‌دهد.

نام جدول اصلاح شود

  • Value Coded – غلظت نمونه‌ها برحسب تقسيمات انجام شده را مي‌گويند كه از مخلوط نمودن استاندارد با غلظت بالا با محلول پايه (يعني صفر درصد) به نسبت‌هاي مختلف بدست مي‌آيد.
  • Preassigned Value – مقدار نمونه‌هاي ارسالي و يا تهيه شده در آزمايشگاه معلوم مي‌باشد.
  • دلتا (Delta)– اختلاف بين نمونه دوم از اول، سوم از دوم و … را مي‌گويند.
  • نسبت دلتا– نسبت دلتاهاي بدست آمده از نمونه‌هاي آزمايشگاه به مقادير بدست آمده از همگروه را مي‌گويند.       = نسبت دلتا

 

  • Theoretical Delta

نسبت مقدار دلتاي آزمايشگاه به اختلاف كل دلتاي گروه

 

LN2 – LN1 – = مقدار نمونه اول – مقدار نمونه دوم

–اوليLN – LN آخري = اختلاف كل

 

تأييد خطي بودن يك آزمايش در آزمايشگاه

در امريكا و اروپا از ميان مؤسسات خصوصي زيادي كه محلول‌هاي استاندارد، ‌كاليبراتورها و نمونه‌هاي آزمايشگاهي را مي‌فروشند، فقط بعضي از آنها تأييديه مقامات مسئول كشور خود را دارند و بنابراين در تهيه و خريد آنها اين نكته مهم بايد مراعات شود.

آزمايشگاه‌ها مي‌توانند بعد از تهيه مواد مورد نظر آزمايش‌هاي تأييد كاليبراسيون و خطي بودن را با آنها انجام دهند. بيشتر اين كمپاني‌ها داراي برنامه كامپيوتري بوده و آزمايشگاه بعد از انجام آزمايشات مي‌تواند بوسيله رايانه نتايج را به اين كمپاني‌ها ارسال داشته و بعد از دريافت موفقيت‌آميز نتايج، آنها را بعد از امضاء شدن توسط مسئول QC و يا آزمايشگاه در بايگاني آزمايشگاه نگهداري كند.

آزمايشگاه‌ها مي‌تو‌انند با خريد نمونه‌هاي معتبر و قابل قبول و داشتن برنامه كامپيوتري براي اين منظور ميزان خطي بودن و كاليبراسيون آزمايش‌ها را تأييد نمايند. در اين صورت نيز نتايج پس از امضاء بايد بايگاني شوند.

راه ديگري كه وجود دارد شركت در برنامه كنترل كيفيت خارجي كه مورد قبول مقامات دولتي مي‌باشد بوده كه مسلماً نمونه‌هاي آنها از مطمئن‌ترين نوع بوده و نتايج آزمايشگاه را با نتايج همگروه مقايسه نموده و بدين ترتيب ميزان درستي و دقت آزمايشگاه نيز مورد مقايسه قرار مي‌گيرد.

در مثال زير كه براي خطي بودن آزمايش گلوكز درنظر گرفته شده است 6 نمونه از محلول استاندارد گلوكز به غلظت‌هاي 25 تا mg/dl 1000 انتخاب شده و هر كدام دو بار آزمايش شدند. نتايج آزمايش را با ميانگين، درصد بازيابي و باقيمانده‌ها در جدول (2) ديده مي‌شوند.

 

نام جدول اصلاح شود

در اين آزمايش از كامپيوتر خواسته شد تا خطي بودن آزمايش را تأييد نمايد. كامپيوتر خطي بودن را با خط ايده‌آل I:I و Fitted Line با در نظر گرفتن همه نتايج و بدون نتيجه خارج از حد رسم نموده و مقادير عدد ثابت و ضريب زاويه آنها را نيز نشان مي‌دهد. شكل(4).

 

 

درصد بازيابي كه با فرمول زير براي هر استانداردي توسط كامپيوتر محاسبه شده است در جدول ديده مي‌شود. اين مقدار براي استاندارد اول mg/dl 25 برابر 102% و براي استاندارد پنجم برابر 6/98% مي‌باشد.

براي استاندارد mg/dl 25                    102% =

براي استاندارد mg/dl 700                98.6% =

 

در شكل (5) درصد بازيابي همه استانداردها ديده مي‌شود. نقاط دايره O و نقاط به ترتيب نماينده مقادير تجربي هر نمونه و معدل بين اندازه‌گيري‌ها مي‌باشد.

 

بازمانده‌ها: يا Residuals كه نماينده اختلاف بين مقدار واقعي y و مقدار محاسبه شده y مي‌باشد و از فرمول y=ax+b بدست مي‌آيد در شكل(6) ديده مي‌شوند.

 

 

در اين ارزيابي دو دسته ضريب زاويه و عدد ثابت بدست آمده‌اند؛ يكي مربوط به خطي است كه با استفاده از تمام نتايج بدست آمده و ديگري با خارج كردن نتيجه ششم محاسبه شده است.

y=ax+b

1) a=1 , b= 1.5

2) a= 0.971 , b= 3.6

y= 25 + 1.5 = 26.5           26.5 – 25 = 1.5    بازمانده استاندارد اول از معادله 1

y= 100 = 1.5 = 101.5     101.5-100 = 1.5     بازمانده استاندارد دوم از معادله 1

 

نمونه‌اي از گزارش CAP

CAP بعد از دريافت نتايج آزمايش‌هاي CV/L، معدل نتايج آزمايشگاه، معدل نتايج همگروه، ميزان خطاي مجاز (بر حسب درصد) و اقسام دلتاها را تعيين مي‌نمايد. جدول (3).

آزمايش خطي بودن و تأييد كاليبراسيون كه براي انزايم ALT، با دستگاه و رآكتيوهاي Beckman انجام گرفته بود.

پس از محاسبات بالا و تعيين ضريب زاويه و عدد ثابت در جدول (4) ديده مي‌شوند.

براساس اين ارزيابي خطي بودن آزمايش ALT بين نمونه اول تا ششم تأييد شده و كاليبراسيون نيز با Verified – 2 مورد قبول قرار گرفته است ولي ضريب زاويه و عدد ثابت اين خط مساوي واحد و صفر نشده تا نتايج همگروه اختلافي نداشته باشد. در اين جدول علاوه بر ارزيابي كلي، ارزيابي جداگانه‌اي بر اساس قوانين چهارگانه CAP بين نمونه‌هاي 1 تا 6، 1 تا 5 و 1 تا 4 براي خطي بودن و همچنين تأييد كاليبراسيون ديده مي‌شود جدول (4).

نمودار خطي بودن معدل نتايج آزمايشگاه با علامت (O) و معدل نتايج همگروه با علامت (□) و خط اصلي كه از مقادير اوليه استانداردها بدست آمده است در شكل (7) آورده شده است.

درصد اختلاف بين معدل نتايج آزمايشگاه و نتايج همگروه نماينده Bias مي‌باشد كه در شكل (8) ديده مي‌شود.

 

تعيين دامنه اندازه‌گيري يك آزمايش

تعيين دامنه اندازه‌گيري Analytical Measurement Range با دامنه اندازه‌گيري قابل گزارش Reportable Range))، دامنه خطي بودن يك آزمايش (Linearity)،‌ دامنه قابل قبول كلينيكي (Clinically Reportable Range) و (Calibration) تفاوت دارد. با نظري به تعاريف آنها كه از طرف CLIA و CAP ارائه شده‌اند شباهت‌ها و اختلاف‌ها معلوم مي‌شوند.

براي تعيين دامنه اندازه‌گيري يك آزمايش بايد از مواد و يا نمونه‌هايي استفاده شود كه Matrix آنها با سرم طبيعي يكي باشد و براي اجراء اين آزمايش مي‌توان از:

  • موادي كه براي خطي بودن استفاده شده‌ا‌ند را بكار گرفت.
  • نمونه‌هايي‌كه قبلاً براي اين آزمايش استفاده و نگهداري شده‌اند.
  • كاليبراتورها و مواد رفرانسي كه در آزمايشگاه وجود دارد.
  • و يا مي‌توان محلول‌هايي با مخلوط نمودن يك نمونه با حداقل غلظت با نمونه ديگر با حداكثر غلظت تهيه و استفاده نمود.

مثال : براي تهيه نمونه‌ها از يك سرم كه غلظت ماده مورد نظر در آن صفر و ديگري كه غلظت آن mg/dl 578 بود استفاده و برحسب جدول زير محلول‌هاي با غلظت‌هاي مختلف تهيه و آزمايش شدند. جدول (4)

 

جدول (4) طرز تهيه نمونه‌ها براي AMR

نمونه نسبت درصد غلظت اوليه غلظت بدست آمده
سرم 1 سرم 2
1 100% 0% mg/dl 20 mg/dl 20
2 75% 25% mg/dl 159 mg/dl 160
3 50% 50% mg/dl 299 mg/dl 301
4 25% 75% mg/dl 438 mg/dl 439
5 0% 100% mg/dl 578 mg/dl 578

 

بعد از اندازه‌گيري نمونه‌ها ، تعيين ضريب زاويه و مقدار ثابت خط LR رسم و چنانكه ديده مي‌شود تفاوت معني‌داري ديده نمي‌شود. شكل (9). تعيين دامنه اندازه‌گيري يك آزمايش كمك به تأييد خطي بودن و كاليبراسيون نيز مي‌نمايد.

[gview file=”http://persianlab.com/wp-content/uploads/خطی-بودن.doc”]

1- CLSI= Clinical Laboratory