معماری
ld;v,f

دستورالعمل نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی به روش طولانی مدت و کوتاه مدت

نگهداری طولانی مدت باکتری ها این امکان را می دهد که سویه های میکروبی ، ماهها و حتی سالها به صورت زنده باقی بمانند . بهترین روش های نگهداری طولانی مدت شامل لیوفیلیزاسیون (Freeze drying) و یا نگهداری باکتریها در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد یا پایین تر (در دیپ فریز یا در نیتروژن مایع) می باشد .

نگهداری در دیپ فریز (۵۰- تا ۷۰- درجه سانتیگراد یا پایین تر) و یا نیتروژن مایع :
باکتری مورد نظر را روی محیط مغذی مانند پلیت (Tryptic Soy Agar) TSA حاوی ۵% خون گوسفند کشت دهید. پلیت ها را به مدت ۲۴- ۱۸ ساعت در دمای ۲ ± ۳۵ درجه سانتیگراد و تحت شرایط Co2 در صورت نیاز برای هر باکتری انکوبه نمایید.
بعداز انکوباسیون ، خالص بودن ومورفولوژی کلنی ها را بررسی نموده و در صورت نیاز، تستهای بیوشیمیایی آن انجام دهید. سپس از باکتری رشد یافته سوسپانسیون غلیظی در mL100-50 از یک محیط محافظت کننده از سرما(Cryoprotective)تهیه نمایید. محیط محافظت کننده از سرما میتواند Skim milk، خون گوسفند یا خرگوش دفیبرینه استریل یا (TSB) Tryptic Soy Broth حاوی گلیسرول با غلظت نهایی ۱۵-۱۰% باشد.
سپس از سوسپانسیون باکتریایی فوق به مقدار mL 1-5/0 در ویالهای شیشه ای یا پلاستیکی کوچک استریل توزیع کنید.تعداد ویال ذخیره برای مصرف یک سال خود را آماده نمایید .
ویالها را در فریزر۵۰- درجه سانتیگراد یا پایین تر و یا تانک نیتروژن مایع قرار داده و تا موقع مصرف در آن ذخیره کنید. سوش ها را میتوان در دمای کمتر از۷۰- درجه سانتیگراد به مدت طولانی نگهداری نمود ، اما در دمای۵۰ – تا ۷۰- درجه سانتیگراد فقط باید برای یک سال ذخیره شوند . سوش ها نباید در دمای بالاتر از ۵۰- درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
هنگام نیاز ، یک ویال را از فریزر یا تانک نیتروژن مایع بیرون آورده و سریع محتویات آن را ذوب نمایید. این باکتری میتواند برای انجام آزمایشات کنترل کیفی داخلی در آزمایشگاه یا برای تهیه کشت های Working Control به کار رود . قبل از هر گونه استفاده از این سویه ها باید از خالص بودن آنها مطمئن شد . ویال مورد استفاده پس از ذوب شدن باید دور انداخته شود و هرگز برای استفاده بعدی آنها را دوباره فریز نکنید.
کشت های Working Control
عبارتست از یک کشت مجدد از کشت ذخیره فریز شده که برای کنترل کیفیت محیط های کشت و ….. استفاده می شود.
تا ۳ پاساژپشت سر هم از کشت ذخیره فریز شده می توان انجام داد. بعد از انجام حداکثر ۳ پاساژ پشت سرهم، آنرا با یک کشت ذخیره فریز شده دیگر جایگزین کنید. پاساژهای پشت سرهم بیشتر از این تعداد ، احتمال تغییرات فنوتیپی آنها را افزایش میدهد.
برای تهیه کشت Working Control ، از کشت ذخیره فریز شده روی پلیت یا آگار شیبدار تلقیح کرده و آن را به مدت یک شبانه روز یا تا زمانی که رشد مناسبی بدست آید ، انکوبه نمایید. این پلیت یا آگار شیبدار را میتوان در ۸-۲ درجه سانتیگراد یا دردمای اتاق تا مدت ۴ هفته نگهداری نمود. بعد از هر پاساژ خالص بودن و مورفولوژی کلنی ها را بررسی نمایید.

استفاده از روغن معدنی در دمای اتاق :
محیط کشت برین هارت اینفیوژن آگار (BHIA) را با شیب کم در لوله تهیه نمایید . برای باکتریهای پرنیاز (Fastidious) مانند گونوکوک، مننگوکوک ، استرپتوکوک پنومونیه وهموفیلوس آنفلوانزا، مقداری خون تازه یا خون حرارت داده شده، به محیط اضافه کنید .
سپس روغن معدنی (یا پارافین مایع ) را در حرارت خشک (۱۷۰درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت) استریل نمایید .
از میکروب مورد نظر روی سطح محیط کشت دهید.
بعد از بدست آمدن رشد کافی ، روغن استریل را به مقدار cc1روی سطح محیط بریزید.
در صورت نیاز به انجام کشت مجدد ، نمونه از قسمت زیرین روغن برداشته می شود.
بعد از ۱۲-۶ ماه تجدید کشت نمایید.

کشت عمقی و نگهداری در دمای اتاق سویه های میکروبی:
این روش فقط برای باکتری هایی که مشکل پسند نیستند ، مانند استافیلوکوک و انتروباکتریاسه ها به کار می رود .
یک محیط کشت آگاربدون کربوهیدرات با عمق زیاد در لوله تهیه کنید. به این منظورمحیط TSA پیشنهاد می شود.
باکتری را به صورت کشت عمقی در این محیط تلقیح کنید.
این محیط را ۲۴ ساعت در اتو۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه نمایید.
در لوله را با در پیچ یا چوب پنبه ببندید.
سپس لوله در پیچ دار را در پارافین مذاب فرو ببرید. به گونه ای که کاملا در لوله را بپوشاند.
کشت ها را در حرارت اتاق نگهداری کنید.
هر ساله سوش مورد نظر را تجدید کشت نمایید.
کشت عمقی در محیط سیستین تریپتیکیس آگار (CTA) برای نایسریا واسترپتوکوک :
محیط CTA را در لوله تهیه نمایید.
– باکتری را به طور عمقی در این محیط کشت دهید.
– محیط را به مدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
– در لوله را با چوب پنبه یا درپیچ ببندید.
– سپس لوله در پیچ دار را در پارافین مذاب فرو ببرید، به طوری که کاملاً در لوله را بپوشاند.
– برای نایسریا ها لوله را در ۳۵ درجه سانتیگراد نگهداری کنید و هر دو هفته یک بار تجدید کشت نمایید. برای استرپتوکوک ها لوله را در حرارت اتاق نگهداری کرده و هر ماه تجدید کشت کنید.
کشت عمقی در محیط سیستین تریپتیکیس آگار (CTA) برای نایسریا واسترپتوکوک :
محیط کشت Cooked Meat برای باکتری های بیهوازی:
باکتری را در لوله های حاوی محیط Cooked Meat کشت دهید.
– لوله را به مدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه نمایید .
– در لوله ها را با در پیچ یا چوب پنبه ببندید .
– لوله ها را در حرارت اتاق نگهداری کنید.
– هر دو ماه یکبار تجدید کشت نمایید.

باکتریهای با رشد سریع :
سوش مورد نظر را در سطح محیط TSA لوله ای در پیچ دار کشت دهید.
لوله را به مدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
پس از رشد کامل ، لوله را در یخچال نگهداری نمایید.
هر ماه یکبار تجدید کشت کنید.
محیط کشت Cooked Meat برای باکتری های بیهوازی:
باکتری را در لوله های حاوی محیط Cooked M eat کشت دهید.
– لوله را به مدت ۲۴ ساعت در اتو ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه نمایید .
– در لوله ها را با در پیچ یا چوب پنبه ببندید .
– لوله ها را در حرارت اتاق نگهداری کنید.
– هر دو ماه یکبار تجدید کشت نمایید.

نگهداری کوتاه مدت سویه های میکروبی
مننگو کوک و هموفیلوس :
– سوش مورد نظر را در سطح محیط شکلات آگار لوله ای یا پلیت کشت دهید.
– لوله یا پلیت را به مدت ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید .
– لوله یا پلیت را بعد از رشد در حرارت اتاق نگهداری کنید.
– هر دو هفته یک بار تجدید کشت نمایید.
گنوکوک :
– سوش مورد نظر را روی محیط شکلات آگار کشت دهید .
– به مدت ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید. پس از این مدت ، مجدداً در این درجه حرارت (۳۵ درجه سانتیگراد) نگهداری نمایید.
– هر دو روز یکبار تجدید کشت کنید.

استرپتوکوک ها :
– سوش مورد نظررا در سطح محیط بلادآگار شیبدار لوله ای و در پیچ دار کشت دهید.
– لوله را به مدت ۲۴ ساعت در ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
– پس از رشد لوله را در یخچال نگهداری نمایید. (جهت استرپتوکوک پنومونیه محیط را در دمای اتاق نگهداری نمایید.)
– هر دو هفته یکبار تجدید کشت کنید.

پاسخ دهید