معماری

رهنمودهای ICSH برای استانداردسازی نمونهها و گزارشهای مغز استخوان

بررسی مغز استخوان یک بررسی ضروری برای تشخیص و پیگیری بسیاری از اختلالات خونی و مغز استخوان است.نمونه‌های آسپیراسیون و بیوپسی مکمل همدیگر هستند و زمانی که هر دوی آنها را داشته باشیم، امکان ارزیابی جامع مغز استخوان فراهم می‌شود. تفسیر نهایی نیازمند جمع‌بندی یافته‌های خون محیطی، آسپیراسیون و بیوپسی مغز استخوان همراه با نتایج تست‌های تکمیلی مثل ایمونوفنوتایپ، آنالیز سایتوژنتیک و مطالعات ژنتیک مولکولی مناسب در زمینه بالینی بیمار است. روش‌های آماده‌سازی، پردازش و گزارش نمونه‌های آسپیراسیون و بیوپسی مغز استخوان بسیار متغیر است. این تفاوت‌ها منجر به تناقضات در تشخیص یا طبقه‌بندی بیماریها می‌شود که احتمال دارد روی درمان و نتایج بالینی بیمار اثر گذارد. با تشخیص نیاز به استانداردسازی در این زمینه، یک گروه کاری بین‌المللی برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان توسط کمیته بین‌المللی استانداردسازی در هماتولوژی(ICSH) برای آماده‌سازی مجموعه‌ای از دستورالعمل‌ها بر اساس بهترین شیوه‌ها و اقدامات تشکیل شد. دستوراالعمل‌ها در مجامع عمومی ICSH مورد بحث قرار گرفت و توسط یک هیات بین‌المللی از کارشناسان برای رسیدن به اتفاق نظر بیشتر، بررسی شد.

 

مقدمه

بررسی بیوپسی و آسپیراسیون مغز استخوان برای تشخیص اختلالات مغز استخوان ضروری است. یک تشخیص جامع اختلال مغز استخوان اغلب نیازمند راههای تشخیصی مختلف است که شامل ارزیابی اسمیر و شمارش سلولهای خون محیطی، اسمیر آسپیراسیون مغز استخوان، برش لخته ذرات(particle clot section)، بیوپسی مغز استخوان و مورفولوژی نقش‌گذاری(imprint) همراه با نتایج حاصل از بررسی‌های مرتبط دیگر مثل سیتوشیمی، آنالیز ایمونوفنوتیپ، تکنیکهای سیتوژنتیک و ژنتیک مولکولی و همچنین نتایج تستهای بیوشیمی و میکروبیولوژیک در صورت لزوم است. تفسیر نهایی باید در چارچوب یافته‌های کلینیکی و تشخیصی مقدماتی اولیه باشد. روش‌های فعلی برای آماده سازی، پردازش و گزارش نمونه‌های مغز استخوان بسیار متغیر است. فقدان یکسان‌سازی می‌تواند منجر به تناقض در طبقه‌بندی و تشخیص بیماریها شود و در نتیجه روی درمان و نتایج بالینی بیمار اثر گذارد. در تلاش برای استانداردسازی اندیکاسیونهای بررسی مغز استخوان، نمونه‌هایی که مورد نیاز است و چارچوب گزارش، یک گروه کاری بین‌المللی برای استانداردسازی نمونه‌ها و گزارش‌های مغز استخوان توسط اعضای خود و بنیاد مستقل از کمیته جدید بین‌المللی برای استانداردسازی در هماتولوژی(ICSH) در ایالات متحده در آوریل 2007 تشکیل شد. توسط کنفرانس الکترونیکی پیش‌نویس کارگروه که مجموعه‌ای از دستورالعمل‌های مورد توافق بود در مجامع عمومی ICSH در انگلستان در اکتبر 2007 و در استرالیا در می 2008 ارائه شد. پس از انجام اصلاحات لازم، دستورالعمل‌ها به یک هیات بین‌المللی از کارشناسان برای اظهار نظر بیشتر قبل از انتشار ارائه شد. اگرچه گروه کاری توصیه‌های زیر را بر اساس بهترین شیوه ارائه داده است ولی تغییراتی در عمل به دلیل هزینه‌ها یا محدودیت‌های عملی وجود دارد و این تغییرات در آن منطقه خاص قابل قبول است.

اندیکاسیون‌های بررسی مغز استخوان

اندیکاسیون‌های بررسی BM در جدول شماره 1 لیست شده است. آسپیراسیون و بیوپسی اطلاعات مفید و تکمیلی را ارائه می‌کند. توصیه می‌شود هم آسپیراسیون و هم بیوپسی مغز استخوان به طور روتین انجام شود، به طوری که یافته‌های این‌دو می‌تواند با هم ارتباط داشته باشند. اگرچه در بعضی شرایط کلینیکی، امکان دارد یک آسپیره به تنهایی کافی باشد. اگر بیوپسی اندیکاسیون دارد ولی انجام نشده است و یا قابل دستیابی نیست، نمونه لخته ذرات(particle clot) توصیه می‌شود.‌ اگر آسپیره قابل دستیابی نباشد (مثلاٌ در آسپیره خشک) نقش‌گذاری بیوپسی تهیه شود.

جدول1-اندیکاسیون‌های بررسی مغز استخوان
-بررسی آنمی غیرقابل توجیه، شاخص‌های غیرطبیعی گلبول قرمز، سایتوپنی یا سایتوزیس

-بررسی مورفولوژی غیرطبیعی اسمیر خون محیطی که مطرح کننده پاتولوژی مغز استخوان است

-تشخیص، مرحله‌بندی و پیگیری اختلالات هماتولوژیک بدخیم (مثل لوکمی حاد و مزمن، سندرمهای میلودیسپلاستیک، اختلالات میلوپرولیفراتیو مزمن، لنفوما، میلوم پلاسماسل، آمیلوئیدوز، ماستوسیتوز)

-بررسی متاستازهای مغز استخوان مشکوک

-ضایعات استخوانی کانونی غیرقابل توضیح در تصویربرداری رادیولوژی

-ارگانومگالی غیرقابل توجیه یا وجود ضایعات توده‌ای غیرقابل دسترس برای بیوپسی

-کشت میکروبیولوژیک برای بررسی تب با منشا ناشناخته یا عفونت‌های خاص مثل سل ارزنی، لیشمانیوز، مالاریا

-ارزیابی ذخایر آهن

-بررسی اختلالات ذخیره‌ای چربی/گلیکوژن

-رد بیماری هماتولوژیک در اهداء کنندگان بالقوه پیوند سلول ریشه‌ای آلوژنیک

روش‌های مقدماتی

مهم است که اپراتور از اندیکاسیون‌های کلینیکی بررسی BM و نمونه‌هایی که مورد نیاز است گرفته شود آگاهی داشته باشد. همچنین اپراتور باید از نیاز به آرام‌بخش و تسکین درد کافی و مباحث ایمنی با توجه به ترومبوسیتوپنی یا خطرات انعقادی آگاه باشد که امکان دارد نیازمند انتقال پلاکت یا برگشت ضدانعقادی باشد. ملاحظات خاص از محل بررسی BM و وضعیت قرارگیری بیمار باید برای بیماران بی‌حرکت، بیماران چاق، کودکان یا شیرخواران، بیماران با ضایعات استخوانی لیتیک یا نکروز BM و یا افرادی که پرتوتابی قبلی داشته اند لحاظ شود. قبل از بررسی BM، اقدامات زیر لحاظ شود:

  • روش کار با جزئیات برای بیمار توضیح داده شود. تاریخچه کلینیکی گذشته بیمار گرفته شود. هرگونه آلرژی و ناخوشی‌های همزمان مستند شود و هر گونه مصرف دارویی توضیح داده شود.
  • رضایت آگاهانه باید از بیمار گرفته شود. همچنین بر اساس دستورالعملهای محلی برای استفاده از هر کدام از نمونه‌ها برای اهداف غیرتشخیصی مثلا پژوهشی تحقیقاتی، بانک بافتی، آموزشی یا تضمین کیفیت باید رضایت گرفته شود.
  • یک اسمیر خون محیطی و شمارش سلولهای خونی باید تهیه شود، در صورتی که طی 2 روز گذشته جمع آوری نشده است.

 

محل آناتومیک

محل آناتومیک ترجیحی برای آسپیراسیون و بیوپسی BM، ستیغ ایلیاک خلفی است. ستیغ ایلیاک قدامی برای بیمارانی که قادر به حرکت نیستند استفاده میشود. سطح داخلی تیبیا در شیرخواران استفاده میشود. آسپیره استرنوم در برخی شرایط خاص مناسب است مثلا اگر بیمار قادر به حرکت نیست، پرتوتابی به لگن یا محل‌های دیگر داشته است که منجر به آسپیره خشک می‌شود یا اگر بیوپسی مورد نیاز نیست. آسپیراسیون استرنوم فقط باید توسط یک اپراتور باتجربه که از خطر تامپوناد قلبی باخبر است انجام شود. اگر یک ضایعه استخوانی کانونی شناخته شده وجود دارد (در تصویربرداری رادیولوژی)، احتمال تشخیص ضایعه از طریق آسپیراسیون سوزنی و بیوپسی استخوانی در محل ضایعه وجود دارد.

آسپیراسیون یا بیوپسی هر کدام ممکن است اول انجام شوند. اگر ابتدا آسپیراسیون انجام شود، بیوپسی از راه همان انسیزیون، تقریبا نیم تا یک سانتی متر دور از محل آسپیراسیون برای اجتناب از به دست آوردن یک بیوپسی آسیب دیده یا خونریزی دهنده انجام می‌شود. اگر ابتدا بیوپسی انجام شود، سوزن آسپیراسیون روی سطح استخوان نیم تا یک سانتی متر دور از محل بیوپسی قرار می‌گیرد تا نمونه آسپیراسیون لخته نشود. توصیه می‌شود که آسپیراسیون و بیوپسی با استفاده از سوزنهای مربوطه جداگانه و نه از طریق یک سوزن بیوپسی به دست آید. اگر آسپیراسیون با سوزن بیوپسی انجام شود، امکان رقیق شدن نمونه آسپیره با خون وجود دارد. اگر بیوپسی بعداً با همان سوزن انجام شود، امکان دارد نمونه بیوپسی آسیب دیده و خونریزی دهنده باشد.

آسپیراسیون مغز استخوان

جمع‌آوری نمونه‌های آسپیراسیون

توصیه می‌شود که آسپیراسیون با یک سرنگ پلاستیکی 10 یا 20 سی‌سی متصل به سوزن آسپیراسیون، برای به دست آوردن فشار منفی کافی، کشیده شود. برای حفظ مورفولوژی، سرنگ نباید حاوی ضدانعقاد باشد. تقریباً نیم سی‌سی از اولین نمونه آسپیراسیون برای تهیه اسمیرهای BM در کنار بالین بیمار جمع‌آوری می‌شود. با افزایش حجم آسپیراسیون BM رقیق شدن پیشرونده آسپیراسیون با خون محیطی دیده می‌شود. آسپیره‌های اضافی باید در لوله حاوی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید(EDTA) ریخته شود، در مواردی که نمونه سریعاً لخته می‌شود برای کاهش آرتیفکت ناشی از EDTA مقدار آسپیراسیون باید متناسب با مقدار EDTA در لوله باشد. ICSH نمک دی پتاسیم EDTA با غلظت خونی 25/0±50/1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر را توصیه می‌کند. امکان دارد حجم مناسب آسپیراسیون به یک لوله حاوی EDTA ایزوتونیک اضافه شود تا غلظت مورد نظر به دست آید. در روش دیگر حجم مناسب از آسپیراسیون به یک لوله EDTA کودکان اضافه می‌شود.

سرنگ دوم به سوزن آسپیراسیون برای کشیدن نمونه‌های بیشتر برای تست‌های تکمیلی مثل فلوسیتومتری، آنالیز سیتوژنتیک و مطالعات ژنتیکی مولکولی، میکروبیولوژی، میکروسکوپ الکترونی یا کشت BM متصل می‌شود. در صورت آسپیره خشک یا زمانی که قطعات بافتی وجود ندارد، آسپیره BM در یک زاویه مختصر متفاوت یا در یک محل دیگر می‌تواند تکرار شود. پیشنهاد می‌شود که نمونه‌های فلوسیتومری، سیتوژنتیک و بررسی ژنتیکی مولکولی با تمام آسپیره‌های BM جمع‌آوری شود. امکان دارد نمونه‌ها دور انداخته شود در صورتی که اسلایدهای BM مرور شود و بررسی‌ها نشان دهد که وجودشان غیر ضروری است.

نمونه‌های آسپیره مغز استخوان باید برای تست های تکمیلی جمع‌آوری شود، به روشی که توسط آزمایشگاه محلی توصیه شده است. آسپیراسیون مغز استخوان برای فلوسیتومتری باید در لوله حاوی هپارین سدیم ریخته شود. EDTAدی‌پتاسیم نیز می‌تواند استفاده شود، اگرچه نمونه‌ها باید عرض 12 تا 24 ساعت آنالیز شوند. در صورت آسپیره خشک، یک قطعه بیوپسی که مجموعا به طول 2 تا 3 سانتی‌متر باشد برای آنالیز فلوسیتومتری در یک محیط کشت بافتی مثل RPMI در یک ظرف استریل ارسال می‌شود. اگرچه به علت افزایش سلولهای مرده و ذرات سلولی کیفیت سوسپانسیون سلولی به دست آمده توسط دوباره معلق‌سازی نمونه بیوپسی نسبت به آسپیراسیون پایین‌تر است. آسپیره‌های BM برای آنالیز سیتوژنتیک یا هیبریدیزاسیون در جای فلورسنت(FISH) باید به همان صورتی که آزمایشگاه سیتوژنتیک توصیه می‌کند جمع‌آوری شود. ترجیحاً نمونه‌ها داخل لوله‌های استریل با محیط کشت بافتی مثل RPMI یا سرم جنین گاو 10% برای زنده ماندن سلولی خوب یا به داخل لوله‌های حاوی هپارین سدیم برای انتقال بعدی به داخل محیط کشت بافتی در آزمایشگاه ریخته می شود. اگر امکان آسپیراسیون مغز استخوان وجود ندارد یک نمونه بیوپسی در محیط کشت بافتی استریل یا سالین برای آنالیز سیتوژنتیک قرار می‌گیرد. نمونه‌های آسپیراسیون برای مطالعات مولکولی مثل PCR یا RT-PCR نیز باید بر اساس دستورالعمل آزمایشگاه مولکولار، معمولاً داخل لوله‌های حاوی EDTA، جمع‌آوری شود. نمونه‌ها برای میکروبیولوژی باید در ظرف استریل قرار داده شود یا به داخل محیط کشت مناسب که توسط آزمایشگاه میکروبیولوژی توصیه می‌شود تلقیح گردد. اگر نمونه‌ها برای کشت BM یا میکروسکوپ الکترونی مورد نیاز است باید به داخل محیط مناسب به صورتی که آزمایشگاههای مربوطه مشخص کرده‌اند جمع‌آوری شود. آسپیره‌های اضافی را می‌توان برای تهیه “لخته ذرات” استفاده کرد یا در لوله حاوی EDTA برای اهدافی مثل تهیه اسمیرهای‌ بیشتر، فلوسیتومتری، بررسی‌های ژنتیک مولکولی، انجماد و بانک بافتی استفاده کرد.

گزارش نمونه‌های آسپیراسیون مغز استخوان

ظاهر نمونه آسپیره و بیوپسی باید با یکدیگر ارتباط داده شود و اگر مغایرت فاحشی وجود دارد، دلیل آن توضیح داده شود. مطلوب است که گزارش آسپیره و بیوپسی به‌صورت یک گزارش واحد باشد.

گزارش آسپیره باید دربرگیرنده نتایج شمارش خونی، مثلاً غلظت هموگلوبین، تعداد کل و افتراقی گلبول‌های سفید (نوتروفیل، ائوزینوفیل، بازوفیل، منوسیت، لنفوسیت و در صورت وجود دیگر سلول‌های در گردش خون) و تعداد پلاکت و تفسیر خون محیطی باشد. کافی بودن نمونه آسپیره باید در گزارش ذکر شود. اگر ذرات در اسمیر BM وجود دارد (دارای ذرات یا فاقد ذرات) یا اگر آسپیراسیون dry است یا با خون رقیق شده است باید ذکر شود.

سلولاریتی ذرات مغز استخوان باید با بررسی چندین ذره در اسمیرها یا نمونه‌های ناشی از خرد شدن (squash) صورت گیرد. سلولاریتی در نمونه‌های squash بهتر از اسمیرها ارزیابی می‌شود. سلولاریتی به‌صورت بدون سلول، کاهش‌یافته، طبیعی، افزایش‌یافته یا بسیار افزایش‌یافته توصیف می‌شود. در کل ارزیابی سلولاریتی کلی مغز استخوان در برش‌های بیوپسی بهتر از آسپیره است. سلولاریتی ذرات و دنباله‌ها می‌تواند متفاوت باشد، مثلاً در مغز استخوان‌های فیبروتیک که باید جداگانه شرح داده شود. ذرات با نمای غیرطبیعی باید جداگانه ذکر شود، مثلاً نکروتیک، ژلاتینوس و ادماتوس. وجود رنگ‌پذیری زمینه اسمیر یا مواد پروتئینی بین‌سلولی، رولو یا کریستال‌ها باید گزارش شود. تفاسیر کمی و کیفی برای همه رده‌های سلولی و همه سلول‌های غیرطبیعی انجام می‌شود. تعداد (کاهش‌یافته، طبیعی یا افزایش‌یافته)، بلوغ طبیعی است یا غیرطبیعی و مورفولوژی رده‌های اریتروئید و میلوئید باید ذکر شود و در صورت غیرطبیعی بودن شرح داده شود. تعداد و مورفولوژی مگا‌کاریوسیت‌ها را قید می‌کنیم. تعداد آن‌ها در نمونه بیوپسی بهتر ارزیابی می‌شود. زمانی که تعداد ماکروفاژها افزایش ‌یافته است باید ذکر کنیم و مورفولوژی غیرطبیعی (مثل همو یا اریتروفاگوسیتوز، وجود انکلوزیون‌ها مثل میکروارگانیسم‌ها یا کریستال‌ها، واکوئل‌ها یا هیستیوسیت‌های sea-blue) ثبت شود. افزایش تعداد ماست‌سل‌ها و هر نمای مورفولوژیکی آتیپیک یا تجمعات باید ذکر شود. هر سلول غیرطبیعی یا تجمعات سلول توموری متاستاتیک باید شرح داده شود و وجود تعداد قابل‌توجه سلول‌های smudged باید ثبت شود. نتایج رنگ‌آمیزی آهن و دیگر بررسی‌های سیتوشیمی باید گزارش شود.

یافته‌های فلوسیتومتری مرتبط، در صورت وجود، باید در گزارش آسپیره به‌صورت خلاصه آورده شود. گزارش نتیجه آسپیراسیون نباید به علت آماده نبودن نتایج بررسی‌های تکمیلی به تأخیر بیفتد. باید در گزارش اولیه اشاره کرد که بررسی‌های تکمیلی در حال انجام است. زمانی که نتایج بررسی‌های ژنتیک مولکولی شناخته شده است و بر روی تشخیص تأثیر می‌گذارد باید در یک گزارش تکمیلی قید شود. اگر نتایج بررسی‌های تکمیلی باعث تغییر تشخیص شود، یک گزارش اصلاح‌شده تهیه می‌شود.

اگر اسلایدها توسط فرد دیگری بازبینی شده است باید در گزارش نام فرد مشاور ذکر شود یا گزارش توسط هر دو نفر امضا شود.

نتیجه‌گیری گزارش آسپیره BM باید تشخیص یا تشخیص افتراقی را با توجه به گایدلاین‌های مجامع بین‌المللی بیان کند. یافته‌های اصلی باید خلاصه شود و بررسی‌های دیگری که انجام شده است، ذکر گردد. اگر آسپیره برای مانیتورینگ بیماری است یافته‌ها باید با گزارش‌های قبلی BM مقایسه شود. اگر آسپیره برای تائید یک تشخیص کلینیکی است و نتیجه منفی است باید ذکر شود. کد مناسب بیماری بر اساس SNOMED CT یا ICD باید ذکر گردد.

گزارش باید به‌صورت دستی یا الکترونیکی امضا شود و تاریخ قید شود.

 

نمونه‌های بیوپسی ترفین مغز استخوان

جمع‌آوری نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان

بیوپسی مغز استخوان قبل یا بعد از آسپیراسیون انجام می‌شود. طول بيوپسي در بالغین باید حداقل 2 سانتی‌متر باشد، البته یک بیوپسی کوتاه‌تر (مثلاً 1 سانتی‌متر) نيز گاهی اوقات حاوی اطلاعات تشخیصی کافی است. نمونه بیوپسی بعد از آماده‌سازی تقریباً 20 درصد کوچک‌تر می‌شود. هر چه مقدار بافت بیوپسی شده بزرگ‌تر باشد، احتمال یافتن یک ضایعه کانونی (مثل لنفوما، تومور متاستاتیک، گرانولوم) بیشتر است. گاهی بیوپسی‌های ترفین دوطرفه برای افزایش احتمال تشخيص ضایعات کانونی به کار می‌رود.

هنگامی‌که نمونه بيوپسي گرفته شد، یک استایلت بلانت (blunt stylet) از انتهای دیستال وارد سوزن بیوپسی می‌شود تا نمونه از انتهاي پروگزیمال سوزن بیوپسی خارج شود و بر روی یک اسلاید شیشه‌ای قرار گيرد. براي جلوگيري از خردشدگی و تخريب، كار با نمونه به‌آرامی انجام می‌شود.

Touch imprints باید از نمونه بیوپسی قبل از قرارگیری در فیکساتیو تهیه شود. Imprints به‌ویژه در مواقعی که آسپیره مغز استخوان dry است مفيد می‌باشد.Imprints از طريق تماس آرام نمونه بيوپسي تازه و فيكس‌نشده روي اسلايد و يا قرارگيري اسلايد روي نمونه به دست می‌آید. Imprints با همان روش نمونه‌هاي آسپيره و squash فيكس و رنگ‌آمیزی می‌شوند. اگر هیچ نمونه آسپیراسیوني در دسترس نباشد، Imprints تنها نمونه‌ای است كه بررسي تركيب سلولي، جزئيات سيتولوژيكي و شمارش سلول‌های هسته‌دار بر روي آن‌ها انجام می‌شود. پس از تهيه Imprints، نمونه بيوپسي در یک ظرف حاوي فيكساتيو مناسب قرار می‌گیرد. ظرف نمونه باید به‌طور مناسب در کنار تخت بيمار، با نام و نام خانوادگی بیمار، شناسه منحصربه‌فرد بیمار و تاریخ و زمان جمع‌آوری نمونه برچسب زده شود، به‌طوری‌که زمانی که نمونه بیوپسی باید از فيكساتيو بيرون آورده شود قابل‌محاسبه باشد.
فیکساسیون

نمونه‌های بیوپسی با یک متد یا متدهای مختلف فیکس می‌شود. روش‌های فیکساسیون می‌تواند به‌طور قابل‌توجهی مورفولوژی، جزئیات سیتولوژی و ایمونوراکتیویتی را تحت‌تأثیر قرار دهد. یک فیکساتیو استاندارد، فرمالین بافری خنثی برای 6 ساعت است. فیکساتیوهای دیگری که به‌طور شایع استفاده می‌شود عبارتند از فرمالدئید روی، B5 (کلریدجیوه، استات‌سدیم و فرمالین)،AZF (اسید استیک-روی-فرمالین)، IBF (فرمالین بافری ایزوتونیک)، فیکساتیو بوئن (اسید پیکریک، اسید استیک و فرمالدئید) یا فرمالدئید و گلوتارآلدئید. زمان فیکساسیون بسته به نوع فیکساتیو استفاده‌شده از حداقل یکساعت تا ماکزیمم بیشتر از 24 ساعت است. اگرچه B5 مورفولوژی خوب و زمان چرخه کاری کوتاهی دارد، حاوی کلریدجیوه است که به علت مسائل ایمنی و محیطی در چندین کشور ممنوعیت دارد. اسید پیکریک که در فیکساتیو بوئن استفاده می‌شود یک ماده قابل‌انفجار است و در ایالات متحده ممنوعیت دارد. فرمالین بافری خنثی با کلسیفیکاسیون EDTA منجر به مورفولوژی مناسب و حفظ آنتی‌ژن‌ها برای بررسي ایمونوهیستوشیمی و حفظ اسیدهای نوکلئیک برای بررسی‌های مولکولار می‌شود.

 

آماده‌سازی نمونه ترفین بیوپسی

بعد از دکلسیفیکاسیون، نمونه بیوپسی در پارافين تعبيه می‌شود و برش‌ها با میکروتوم انجام می‌شود. ضخامت مناسب برش‌ها 2 تا 3 میکرون است. حداقل 6 برش در سه سطح تهیه می‌شود؛ 25 درصد، 50 درصد و 75 درصد. قطر سطح مقطع نمونه و برش‌های متوالی باید روی اسلاید شیشه‌ای قرار داده شود. اگر ایمونوهیستوشیمی یا رنگ‌های هیستوشیمی نیاز است، برش‌های اضافه‌تری تهیه شود. نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان در پلاستیک هم می‌تواند تعبيه شود. این روش جزئیات سیتولوژی را به‌خوبی حفظ می‌کند ولی ازنظر تکنیکی دشوارتر است و دامنه بررسی‌های ایمونوهیستوشیمی و احتمالاً FISH را محدود می‌کند. تعبيه‌سازي (embedding) با پلاستیک نیاز به دکلسیفیکاسیون ندارد و برای ارزیابی بیماری‌های متابولیک استخوانی و واکنش‌های هیستوشیمی که با روش دکلسیفیکاسیون تداخل دارد، احتمالاً مفید است.

 

رنگ‌آمیزی برش‌ها

برش‌های ترفین بیوپسی باید با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شود. گاهی رنگ‌آمیزی گیمسا هم علاوه بر هماتوکسیلین-ائوزین انجام می‌شود. رنگ گیمسا برای شناسایی پلاسماسل‌ها، ماست‌سل‌ها، سلول‌های لنفوئیدی، ائوزینوفیل‌ها و برای افتراق بین میلوبلاست‌ها و پرواریتروبلاست‌ها تا حدی کمک‌کننده است. امکان دارد یک برش بافتي براي رنگ‌آمیزی رتیکولین با silver impregnation method استفاده شود. یک برش مغز استخوان که قبلاً نشان داده شده است که افزایش رتیکولین دارد باید به‌عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شود، زیرا روش‌های رنگ‌آمیزی silver impregnationوابسته به فیکساسیون هستند. امکان دارد رنگ‌آمیزی تری‌کروم برای شناسایی فیبروز کلاژنی استفاده شود که به‌آسانی در نمونه‌های هماتوکسیلین-ائوزین خوب رنگ شده، قابل‌تشخیص است.

 

میکروسکوپی

به‌طور روتین باید 2 تا 4 برش بررسی شود. در استیجینگ لنفوما و در مواردی که شک به انفیلترای متاستاتیک وجود دارد، اگر برش‌های بیشتری بررسی گردد، شانس تشخیص یک ضایعه کانونی افزایش می‌یابد. اگر IHC انجام شده است برش‌های بیشتری بررسی خواهد شد. برش‌های بیوپسی به‌ویژه برای ارزیابی سلولاریتی و ساختار کلی مغز استخوان مفید است و حساسیت بیشتری برای ارزیابی ضایعات کانونی و انفیلتراهای پچی دارد. درصد سلولاریتی با تخمین نسبت سلول‌های اشغال‌کننده کل حفره مغز استخوان به دست می‌آید. سلولاریتی مغز استخوان بر اساس سن فرق می‌کند و با توجه به سن بیمار باید ارزیابی شود. در نمونه‌های اطفال سالم، سلولاریتی در بیماران زیر 2 سال بالاترین مقدار است (تقریباً 80 درصد) و در بیماران 2 تا 4 سال (تقریباً 70 درصد) و 5 تا 9 سال (تقریباً 60 درصد) کاهش می‌یابد. در کل نمونه‌های ستیغ ایلیاک تدریجی از سلولاریتی 60 درصد بعد از بلوغ به 30 درصد تا دهه 8 می‌رسد. دامنه نرمال وسيع، اغلب اين روند رو به پايين را می‌پوشاند که تا حدی مربوط به از دست رفتن توده استخوانی ترابکولار در افراد مسن است. فضاهای بین ترابکولار که مجاور کورتکس قرار دارند اغلب هایپوسلولار هستند، به‌ویژه در افراد مسن و نباید در ارزیابی سلولاریتی مدنظر قرار گيرد.

برش‌های بیوپسی در ابتدا با بزرگنمایی کم (X40-X100) برای کافی بودن، پترن، سلولاریتی، وجود ضایعات کانونی، تعداد مگاکاریوسیت، دستجات سلولی غیرطبیعی و موقعیت قرارگیری آن‌ها، ساختاراستخوانی (ضخامت و تعداد ترابکول ها) و فعالیت استئوبلاستی و استئوکلاستی بررسی می‌شود. سپس برش‌ها با بزرگنمایی بالاتر (X200-X400) برای ارزیابی فعالیت هماتوپویتیک (مثلاً رده‌های اریتروئید، میلوئید، مگاکاریوسیتی، سلول‌های لنفوئیدی، پلاسماسل‌ها و ماکروفاژها) و جزئیات سیتولوژیکی بررسی می‌شـــــود. بزرگنمایی‌های بیشتر (X600-X1000) برای بررسی جزئیات سیتولوژیکی مثل گرانول‌های داخل سلولی و آئر راد مفید است.

 

بررسی‌های تکمیلی

امكان دارد ایمونوهیستوشیمی برای تعیین رده و مرحله تمایز سلول‌های طبیعی یا غیرطبیعی یا انفیلتراهای سلولی، تعیین بیماری باقیمانده، مانیتورینگ یک فنوتیپ سلولی خاص، ارزیابی وسعت بیماری و بیماری کانونی، طبقه‌بندی بیماری، مارکرهای تعیین‌کننده پروگنوز، تعیین کلونالیتی و مانیتورینگ بیماری کاربرد داشته باشد. اگرچه درصورتی‌که فنوتیپ جمعیت سلولی غیرطبیعی قبلاً از روی نمونه آسپیراسیون تشخیص داده شده است (مثلاً با فلوسیتومتری)، انجام IHC بر روی نمونه بیوپسی مغز استخوان ضرورت ندارد. بعضی از مارکرهای فنوتیپی با IHC بر روی نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان ارزیابی می‌شود، مثلاً نوکلئوفسمین در لوکمی میلوئیدی حاد.IHC با روش‌های ایمونوپراکسیداز یا ایمونوآلکالین فسفاتاز به‌صورت دستی یا اتوماسیون قابل انجام است. انجام روتین IHC بر روی تمام نمونه‌های بیوپسی توصیه نمی‌شود.

طیف وسیعی از آنتی‌بادی‌های منوکلونال بر روی برش‌های بیوپسی دکلسیفیه شده فیکس‌شده قابل انجام است. پانل آنتی‌بادی‌های درخواستی بستگی به ليست تشخیصی دارد. اصول مشابهی برای هیبریدیزاسیون درجا بر روی نمونه‌های بیوپسی مغز استخوان بکار می‌رود، گرچه بعضی از فیکساتیوها و مواد دکلسیفیه‌کننده انجام هیبریدیزاسیون درجا را غیرممکن می‌سازد.

رنگ‌آمیزی‌های هیستوشیمی مفید شامل کنگو رد برای آمیلوئیدوز، ذیل‌ نلسون برای باسیل‌های اسید فست، Gomori’s methenamine silver (GMS) براي قارچ‌ها و پریودیک اسید شیف (PAS) برای کربوئیدرات‌ها است.

اگر آسپیره dry یا بدون ذره باشد، برش‌ها با آبی پروس برای ارزیابی ذخیره آهن رنگ می‌شود، اگرچه کلسیفیکاسیون، ذخیره آهن و آهن سیدروبلاستی را حذف می‌کند.

 

گزارش بیوپسی

در گزارش طول کلی بیوپسی، نمای ماکروسکوپی و کافی بودن آن، پیوستگی و کیفیت نمونه باید ذکر شود. درصد سلولاریتی، پترن سلولاریتی و هرگونه نواحی نکروتیک، فیبروتیک یا هموراژیک باید ذکر شود. اگر ساختار استخوان غیرطبیعی است باید ذکر شود. باید ترکیب سلولی از لحاظ موقعیت، درصد سلول‌ها، مورفولوژی و پترن تمایز رده‌های اریتروئید، میلوئید، مگاکاریوسیتی، سلول‌های لنفوئیدی، پلاسماسل‌ها و ماکروفاژها شرح داده شود. وجود هرگونه سلول غیرطبیعی ذکر شود. گرید رتیکولین و نتایج ایمونوهیستوشیمی و رنگ‌آمیزی هیستوشیمی، چه مثبت یا منفی، باید گزارش شود، درصورتی‌که انجام شده است. نتایج FISH هم باید ضمیمه شود، اگر انجام شده است. اگر بیوپسی برای استیجینگ لنفوما انجام شده است، مغز استخوان‌های درگیر باید با نمونه مغز استخوان تشخیصی اولیه مقایسه شود و شباهت‌ها و اختلاف‌ها در گرید هیستولوژی ذکر شود.

نتیجه‌گیری باید یافته‌ها و تشخیص و تشخیص‌های افتراقی را با توجه به دستورالعمل‌های مجامع بین‌المللی خلاصه نماید.

گزارش بیوپسی باید با یافته‌های آسپیراسیون ارتباط داده شود و هرگونه مغایرتی ذکر شود. یافته‌های مرتبط باید با نتایج قبلی همان بیمار مقایسه شود. هرگونه بررسی بیشتری که در حال انجام است باید ذکر شود و نتایج در یک گزارش تکمیلی در تاریخ بعدی آورده شود. گزارش به‌صورت دستی یا الکترونیکی امضاء شود و تاریخ قید گردد.

Reference

S.-H. Lee, W. N. Erber, A. Porwit, M. Tomonaga, L. C. Peterson– For The International Council For Standardization In Hematology. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int. Jnl. Lab. Hem. 2008, 30, 349–364

دکتر طاهره اسلام‌منش، استادیار پاتولوژی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی