معماری

روش‌هاي آماده سازي اسپرم

جداسازي اسپرم از پلاسماي منی به دلايل مختلفي ممكن است مورد نياز باشد (مثلاً براي تشخيص برخي اختلالات و يا استفاده از روش‌هاي بارورسازي تخمك). اگر بخواهيم عملكرد اسپرماتوزوئيدها را بررسي كنيم بايد آنها را طي يك ساعت، از پلاسماي منی جدا کنیم تا از آثار مخرب فرآورده‌هاي سلول‌هاي غيراسپرم بر اسپرماتوزوئيدها جلوگيري بعمل آيد.

نكته 1: اگر تعداد كمي اسپرم شمارش شود نتايج حاصل غيرمطمئن بوده و اين امر در فرايند تشخيص و درمان بيماران اثرگذار است. البته در مواردي كه تعداد اسپرم‌هاي بيمار پايين است اين امر اجتناب ناپذير است.

نكته 2: وقتي حجم كمي از مايع مني برداشته مي‌شود صحت نتايج حاصل به مقدار زيادي كاهش مي‌يابد. در صورتي كه كمتر از 400 اسپرم شمارش شود خطاي حاصل از برداشتن نمونه را طبق جدول 2-2 گزارش مي‌كنيم.

1-1-5 چه زماني نياز به جداسازي اسپرم از پلاسمای منی داريم:

اگرچه پلاسماي مني در حالت طبيعي به اسپرم كمك مي‌كند تا به موكوس سرويكال نفوذ نمايد،در مواردي كه از روش‌هاي لقاح مصنوعي (مثل IUI و IVF) استفاده مي‌شود و موانع طبيعي در مقابل اسپرم‌ها وجود ندارند، برخي از اجزاء‌آن (مثل پروستاگلاندين‌ها و روي) مي‌توانند مانع از حاملگي شوند.

هدف از جداسازي اسپرم از پلاسماي منی ايجاد فرآورده‌اي است كه درصد زيادي از اسپرم‌هاي طبيعي و متحرك داشته باشد و عاري از سلول‌هاي غيرزايا، اسپرم‌هاي مرده و ذرات ديگر باشد. براي انجام IUI در افرادي كه اسپرم طبيعي دارند مايع مني را با محيط‌هاي مخصوصي رقيق كرده و آن را سانتريفوژ مي‌كنند اما در بيماراني كه يك يا چند پارامتر غیرطبیعی در اسپرموگرام دارند استفاده از روش Swim – Up و يا Density – gradiant centrifugation ارجح است.

2-1-5 انتخاب روش:

انتخاب تكنيك آماده سازي اسپرم بستگي به ماهيت نمونه دارد. در مواردي كه نمونه مايع مني تا حد زيادي طبيعي است از روش Swim – Up مستقيم (شنا به طرف بالا) استفاده مي‌كنيم، در حاليكه در نمونه‌هايي كه تعداد اسپرم‌ها كم است و يا اسپرم‌ها ضعيف بوده يا دچار اختلال هستند روش Density – gradient ارجح است زيرا اسپرم‌هاي متحرك بيشتري را جدا مي‌كند. با كاهش حجم ماده گراديانت فاصله حركت اسپرم را كوتاهتر كرده و بدين ترتيب مي‌توان اسپرم‌هاي متحرك بيشتري را جدا نمود. در مورد نمونه‌هاي ويسكوز، با افزايش زمان سانتريفوژ كردن مي‌توان به اين هدف رسيد.

هر آزمايشگاهي بايد زمان و دور سانتريفوژ را براي خود تعيين نمايد. اگر تعداد اسپرم‌ها خيلي كم باشد با افزايش زمان و دور سانتريفوژ مي‌توان تعداد بيشتري اسپرم متحرك را جدا نمود.

3-1-5 كارآيي روش‌هاي جداسازي اسپرم از پلاسماي منی و ارگانيسم‌هاي عفوني

كارآيي اين روش‌ها بر اساس تعداد مطلق اسپرم‌ها، تعداد كل اسپرم‌هاي متحرك و يا مقدار اسپرم‌هاي نرمالي است كه با آن روش جدا مي‌شوند. ميزان جداسازي اسپرم‌هاي متحرك در روش Swim – Up كمتر از 20% و در روش Density – gradient بيش از 20% است. همچنين ميزان آلودگي با تركيبات پلاسماي مني در انتهاي كار،‌ در روش Swim – Up بيشتر است.

نمونه‌هاي مني ممكن است به عوامل عفوني خطرناك آلوده باشند و لذا هنگام كار بايد آنها را به عنوان نمونه خطرناك در نظر گرفت. در روش‌هاي آماده سازي، عوامل عفوني بصورت 100%‌ ممكن است جدا نشوند لذا دستورالعمل‌هاي ايمني (ضميمه 2) بايد دقيقاً رعايت شوند.

2-5 اصول كلي:

نمونه مني را بايد به طريق استريل جمع‌آوري نمود. در روش‌هاي باروري مصنوعي مثل تزريق اسپرم به داخل سيتوپلاسم تخمك (ICSI)، لقاح در محيط آزمايشگاهي (IVF)، انتقال گامت به لوله‌هاي فالوپ (GIFT) وتلقیح مصنوعی (AI) ‌ از آلبومين انساني براي غني سازي نمونه استفاده مي‌شود. اين آلبومين بايد خالص بوده و عاري از ويروس، باكتري يا پريون باشد. انواع تجاري آلبومين نيز وجود دارد. اگر انكوباتور فقط حاوي هواي اتمسفر بوده و دماي آن C˚37 باشد بايد از بافر Hepes يا مشابه آن استفاده كرد و در لوله‌ها را محكم بست اما اگر هواي انكوباتور حاوي CO2 5% باشد آنگاه از سديم بيكربنات يا يك تركيب بافري مشابه استفاده مي‌نماييم و در لوله‌ها را شل گذاشته تا گاز خارج شود.

زماني كه بخواهيم از آماده سازي اسپرم براي مقاصد درماني استفاده كنيم بايد مواد و روش‌هاي استريل بكار گرفته شوند. در ادامه به سه تكنيك آماده سازي اسپرم مي‌پردازيم.

3-5 روش شستشوي ساده:

در صورتي كه كيفيت مايع مني مناسب باشد از اين روش استفاده مي‌كنيم. روش شستشوي ساده بيشتر براي تكنيك IUI (تلقيح داخل رحمي اسپرم) استفاده مي‌شود.

1-3-5 معرف‌ها و مواد مورد نياز

1) محيط BWW، Earle، Ham’s F-10 يا HTF (ضميمه 4 بخش‌هاي 1-4، 3-4، 4-4 و6-4) كه ترجيحاً با آلبومين سرم انساني (HSA) يا سرم، غني شده باشد ( به شرح زير):

2) HSAكاملاً تصفيه شده از عوامل ويروسي، باكتريايي يا پريون‌ها

3) غني سازي با HSA: mg 300 از HSA، mg 1.5 پيروات سدیم، 0.18 گرم لاكتات سدیم V/V) 60% (و mg100 بیکربنات سدیم را به ml 50 از يكي از محيط‌هاي پايه (ذكر شده در قسمت 1) اضافه كنيد.

4) غني سازي با سرم: ml 4 از سرم غيرفعال شده* فرد مراجعه كننده، mg ‌1.5 پيروات سديم، ml‌0.18 لاكتات سديمV/V) 60%( و mg 100 بيكربنات سديم را به ml 46 از محيط پايه بيفزاييد.

*(برای غیرفعال کردن،سرم را 20-30 دقیقه در 56 درجه قرار دهید)

2-3-5 روش كار:

  • نمونه مني را بخوبي مخلوط كنيد.
  • نمونه را به نسبت 1 + 1 با محيط غني شده مخلوط كرده تا جداسازي پلاسماي سمينال راحت‌تر انجام شود.

 

 

  • سوسپانسيون فوق را به لوله‌هاي سانتريفوژ انتقال داده به نحوي كه در هر لوله بيش از ml 3 نباشد.
  • به مدت 5 تا 10 دقيقه در g 500- 300 سانتريفوژ نماييد.
  • محلول رويي را به آرامي تخليه كنيد.
  • رسوب حاصل را مجدداً در ml 1 از محيط غني شده حل كرده و به آرامي تكان دهيد.
  • به مدت 3 تا 5 دقيقه در g 500 – 300 سانتريفوژ نماييد.
  • محلول رويي را به آرامي تخليه كنيد.
  • رسوب حاصل را در مقدار مناسبي از محيط غني شده حل كرده تا براي استفاده نهايي آماده شود.

نكته: براي كاستن از تعداد لوله‌ها و افزايش حجم اسپرم در هر لوله مي‌توان دفعات شستشو را كاهش داد. در اين حالت بايد زمان و دور سانتريفوژ را زيادتر كرد تا اسپرم‌ها كاملاً رسوب نمايند (8 تا 10 دقيقه در دور g 800 – 600)

 

4-5 روش Swim – Up مستقيم:

در اين روش نمونه مني را پس از سيال شدن داخل لوله ريخته و به روي آن محيط غني شده اضافه مي‌ کنیم. اسپرم‌هاي متحرك به طرف بالا شنا كرده (Swim – Up) و در محلول رويي قرار مي‌گيرند. قبل از آزمايش بهتر است نمونه رقيق يا سانتريفوژ نشود زيرا اين كار باعث آسيب پراكسيدازي غشاء اسپرم‌ها مي‌شود. مي‌توان محيط غني شده را ابتدا در لوله آزمايش ريخته، سپس نمونه منی را در زیر آن تلقیح نمود.در روش Swim – Up نسبت به شستشوي مستقيم، تعداد كمتري اسپرم استخراج مي‌گردد اما اسپرم‌هايي كه جدا مي‌شوند همگي متحرك هستند و لذا در مواردي كه تعداد اسپرم متحرك نمونه پايين است و قصد انجام IVF يا ICSI را داريم مي‌تواند مفيد باشد.

1-4-5 معرف‌ها و مواد مورد نياز:

1) محيط BWW، Earle، Ham’s F-10 يا HTF (ضميمه 4 بخش‌هاي 1-4، 3-4، 4-4 و6-4) كه ترجيحاً با آلبومين سرم انساني (HSA) يا سرم، غني شده باشد ( به شرح زير):

2) HSAكاملاً تصفيه شده از عوامل ويروسي، باكتريايي، پريون‌ها و اندوتوكسين ميكروب‌ها

3) غني سازي با HSA: mg 300 از HSA، mg 1.5 پيروات سدیم، 0.18 گرم لاكتات سدیم V/V) 60% (و mg100 بيكربنات سديم را به ml 50 از يكي از محيط‌هاي پايه (ذكر شده در قسمت 1) اضافه كنيد.

4) غني سازي با سرم: ml 4 از سرم غيرفعال شده فرد مراجــــعه كننده (20 دقيقه درC˚56)، mg ‌1.5 پيروات سديم، ml ‌0.18 لاكتات سديمV/V) 60%( و mg 100 بيكربنات سديم را به ml 46 از محيط اضافه كنيد.

 

2-4-5 روش كار:

  • نمونه را بخوبي مخلوط كنيد.
  • يك ميلي‌ليتر مايع مني را داخل لوله 15 ميلي‌ليتري مخروطي شكل سانتريفوژ ريخته و به آرامي ml 2 از محيط غني شده را به آن اضافه كنيد. بجاي اين كار مي‌توان مايع مني را به زير محيط كشت پی پت نمود.
  • لوله‌ها را يك ساعت بطور مايل و با زاويه˚45 قرار دهيد. با اين كار سطح تماس بيشتري بين محيط غني شده و مايع مني ايجاد مي‌شود.
  • پس از يك ساعت لوله‌ها را به آرامي به وضعيت عمودي برگردانيد و ml 1 از مايع رويي را برداريد. در اين قسمت از مايع برداشته شده اسپرم‌هاي شديداً متحرك وجود دارند.
  • نمونه جدا شده را با ml 2- 1.5 از محيط غني شده مخلوط کنید.
  • به مدت 5 دقيقه در g 500 – 300 سانتريفوژ نموده و محلول رويي را دور بریزید.
  • توده اسپرم كه در ته لوله ايجاد شده را با ml5 از محيط غني شده مخلوط نمایید.
  • اسپرم‌هاي حاصل را مي‌توان براي مقاصد درماني يا تحقيقاتي استفاده نمود.

5-5 روش Discontinuous density – gradients

بهترين روش براي جداسازي اسپرم‌هاي باكيفيت بوده و آنها را از سلول‌ها و ذرات غير اسپرم جدا مي‌كند. استاندارد كردن اين روش ساده‌تر ازروش Swim – Up است و لذا نتايج حاصل بهتر خواهد بود. از اين روش جهت جداسازي و آماده سازي اسپرم در روش IVF و ICSI استفاده مي‌شود.

در اين روش نمونه مايع مني بر روي يك محيط دانسيته- گراديانت (سيليكاي كلوئيد كه با سيالن پوشيده شده است) سانتريفوژ مي‌شود و سلول‌ها بر اساس دانسيته خود جدا مي‌شوند. بعلاوه اسپرم‌هاي متحرك فعالانه در داخل ماده گراديانت حركت كرده و يك توده نرم اسپرماتوزوئيدي در انتهاي لوله تشكيل مي‌دهند. اسپرم‌هاي حاصل از اين روش تحرك بسيار زيادي داشته و عاري از لكوسيت‌ها، سلول‌هاي غيرزايا، سلول‌هاي زاياي تخريب شده و يا ساير ذرات هستند. كيت‌هاي تجاري مختلفي براي اين روش وجود دارند كه بايد به دستورالعمل مربوطه هر كدام توجه نمود.

1-5-5 معرف‌ها و مواد مورد نياز:

1) محيط BWW، Earle، Ham’s F-10 يا HTF (ضميمه 4 بخش‌هاي 1-4، 3-4، 4-4 و6-4) كه ترجيحاً با آلبومين سرم انساني (HSA) يا سرم، غني شده باشد ( به شرح زير):

2) HSAكاملاً تصفيه شده از عوامل ويروسي، باكتريايي، پريون‌ها و اندوتوكسين ميكروب‌ها

3) غني سازي با HSA: mg 300 از HSA، mg 1.5 پيروات سدیم،ml 0.18 لاكتات سدیم V/V) 60% (و mg100 بيكربنات سديم را به ml 50 از محيط‌هاي فوق‌الذكر اضافه كنيد.

4) غني سازي با سرم: ml 4 از سرم غيرفعال شده بيمار(40 – 30 دقيقه درC˚56)، mg ‌1.5 پيروات سديم، ml ‌0.18 لاكتات سديمV/V) 60%( و mg 100 بيكربنات سديم را به ml 46 از محيط بيفزاييد.

5- محيط دانسيته-گرادیانت ايزوتونيك: به ml 10 ‌از محيط‌هاي غليظ (×10) كه بطور تجاري موجودند (ضميمه 4 بخش‌هاي A 4-6, A 4-4, A 4-3, A 4-1) مقدار ml 90 محيط دانسيته- گراديانت، mg 300 HSA، mg 3 پيروات سديم، ml 0.37 لاكتات سديم V/V) 60%( و 200 mg بيكربنات سديم اضافه كنيد.

2-5-5 روش كار:

  • براي تهيه محيط دانسيته– گراديانت، در يك لوله آزمايش ml1 از محيط 80% ريخته و به روي آن ml1 از محيط 40% را به آرامي اضافه كنيد.
  • نمونه مايع مني را بخوبي مخلوط كنيد.
  • يك ميلي‌ليتر از مايع مني را به روي محيط گراديان افزوده و در g 400- 300 به مدت 15 تا 30 دقيقه سانتريفوژ نماييد. در صورت نياز مي‌توان بيش از يك لوله براي هر مايع مني استفاده كرد.
  • قسمت عمده مايع فوقاني را تخليه كنيد.
  • توده رسوب كرده اسپرم را مجدداً در ml 5 محيط غني شده حل نماييد و 10 – 4 دقيقه در g200 سانتريفوژ كنيد.
  • عمل شستشو را تكرار كنيد (مراحل 4 و 5)
  • توده اسپرماتوزوئيدي حاصل را مجدداً بحالت محلول درآوريد.

 

6-5 آماده سازي نمونه‌هاي آلوده به HIV

اگر فردي به HIV آلوده شده باشد، RNA ويروس و DNA پروويرال را مي‌توان در پلاسماي مني و سلول‌هاي غيراسپرم يافت. از آنجا كه گيرنده‌هاي HIV (CXCR4, CCR5, CD4) فقط بر روي سلول‌هاي غير اسپرم يافت مي‌شوند بنظر مي‌رسد تركيب روش دانسيته – گرادیانت و روش Swim – Up مي‌تواند مانع از انتقال عفونت به خانم‌هاي سالم گردد. در اين روش ابتدا دانسيته-گرادیانت بر روي نمونه انجام می شود كه سلول‌هاي غیراسپرم آلوده به ويروس و پلاسماي مني را جدا مي‌كند و سپس روش Swim – Up بر روي نمونه استخراج شده انجام گرفته و اسپرم‌هاي عاري از HIV ايجاد مي‌كند. نمونه‌هاي حاصل را قبل از استفاده به روش RT-PCR آزمايش نموده و فقط موارد عاري از HIV را استفاده مي‌نماييم.

اگرچه نتايج حاصل اميدواركننده بوده اما هنوز دلايل كافي مبني بر حذف كامل عفونت HIV در طي آماده سازي اسپرم وجود ندارد.

توجه: براي انجام آزمايش فوق بايد نكات ايمني كاملاً رعايت شود تا از خطر انتقال عفونت به افراد سالمي كه وظيفه انجام آزمايش را دارند جلوگيري شود.