معماری

روش‌هاي شناسايي آنزيم‌هاي بتالاکتامازهای وسیع‌الطیف (ESBL)

روش‌هاي شناسايي آنزيم‌هاي بتالاکتامازهای وسیع‌الطیف (ESBL)

ظهور فزاينده‌ي سويه‌هاي توليد کننده‌ي آنزيم‌هايESBL ايجاد روش‌هاي آزمايشگاهي مناسب را به صورت نياز ضروري رشته ميکروب شناسي در آورده است که در زیر به برخی از مهم‌ترین و پرکاربردترین آنها اشاره می‌شود.

پيش‌بيني تيپ آنزيم از طریق تست حساسيت (آنتي بيوگرام)

اگر الگوی مقاومت وابسته به بتالاکتامازهاي ويژه‌ای باشد، بررسی آن، پيش‌بيني تيپ آنزيم جدا شده از آنتي‌بيوگرام آن را امکان‌پذير مي‌سازد و اين موضوع در واقع همان نامي است که Courvalin و همکارانش در خواندن و تفسير آزمايش حساسيت برای این آزمایش انتخاب کردند. ارزش اين آزمايش از دو جنبه مطرح است: اول آن که، هنگامی که مکانيسم مقاومت باکتري جدا شده مشخص شد، پژوهشگر مي‌تواند به طور دقیق، آنتي‌بيوگرام گزارش شده به پزشک را اصلاح نمايد و دوم آن که مي‌توان آزمايش را با عوامل ضد ميکروبي بيشتر در آنتي‌بيوگرام تکرار کرد؛ به طور مثال اگر يک سويه‌ي کلبسيلا به پنيسيلين‌ها، سفالوسپورين‌هاي وسیع‌الطیف مانند سفتازيديم و آزترئونام مقاوم و نسبت به سفوکستين و سفوتاکسيم حساس باشد، فرد به طور مستدل مي‌تواند حدس بزند که اين سويه‌ی ESBL ترجيح دهنده سفتازيديم تولید کننده‌ی بتالاکتامازهایی نظير TEM-10 و يا TEM-26 است (Livermore, 1994). تجربيات نشان داده است که استفاده از سفوتاکسيم برای درمان سويه‌هاي توليد کننده اين آنزيم، با شکست مواجه خواهد شد و در نتيجه اين دارو را در آنتي‌بيوگرام بعنوان مقاوم بايد گزارش کرد و به جاي استفاده از سفالوسپورين‌هاي وسیع‌الطیف، باید از کارباپنم‌ها و ترکيبات مهار کننده استفاده نمود. از طرف ديگر، اگر سويه‌ی کلبسيلاي جدا شده نسبت به سفوکستين و سفوتاکسيم مقاوم باشد، مکانيسم احتمالي آن در ارتباط با آنزيم بتالاکتامازهاي Ampc وابسته به پلاسميد خواهد بود و نياز کمي براي آزمايش مهار کننده‌ها وجود دارد، زيرا اين آنزيم‌ها نسبت به همه مهار کننده‌هاي بتالاکتاماز مقاوم هستند. با چنين تفسيرهايي در خواندن نتايج آنتي‌بيوگرام، مي‌توان در زمان، مواد و هزينه‌ها صرفه‌جویی کرد و مهم‌تر از اينها مي‌توان به دريافت درمان مناسب براي بيماران کمک کرد. در مطالعات ضروري است که طيف وسيعي از بتالاکتام‌ها مورد آزمايش قرار بگيرند، به خصوص برخي از آنهائی که در درمان انتخابي نقش خاصي ندارند. در ادامه آنتي‌بيوتيک‌هاي مهمی که بایستی در نظر گرفته شوند، عبارتند از:

1) مقايسه پنيسيلين‌ها همراه و يا بدون مهار کننده آنها

2) سفتازيديم که بهترين انديکاتور براي شناسایی ESBL ها می‌باشد و به تمايز اين آنزيم‌ها از بتالاکتامازهای K1 که به طور فوق‌العاده در کلبسيلا اکسي‌توکا توليد مي‌شوند، کمک مي‌کند.

3) سفوکستين که يک انديکاتور خوب براي شناسایی بتالاکتامازهاي قابل القاء در سويه‌های انتروباکتر و سيتروباکتر فروندي است و همچنین به تمايز سويه‌های کلبسيلاي مولد ESBL و يا مولد AmpC کمک مي‌کند.

4) کارباپنم‌ها که از مقاومت وابسته به اغلب بتالاکتامازها دور مانده‌اند (Livermore, 1994).

 

آزمايش تأييدي (Confirmatory tests)

ترکيب دو ديسک (Combined disks)

در سال 1999، کمیته ملی استاندارد سازی آزمایشگاه‌های بالینی
(=National Committee on Clinical Laboratory Standards NCCLS) که جدیداً به انستیتـــو استاندارد سازی آزمایشگاه و بالین (Clinical and Laboratory Standards Institute= CLSI) تغییر نام یافته است، جهت تأييد آزمايش‌هاي غربالگري باکتري‌هاي توليد کننده‌ي بتالاکتاماز، راهنمايي‌هاي لازم را ارائه کرده است؛ بدين ترتيب که از سفتازيديم gµ30 درمقابل سفتازيديم/ کلاولانيک اسيد gµ10/gµ30 و سفوتاکسيم gµ30 در مقابل سفوتاکسيم/ کلاولانيک اسيد gµ10/gµ30 استفاده شود و بدون در نظرگرفتن قطر هاله‌ي عدم رشد قبلي، افزايش mm5≤ در قطر هاله عدم رشد براي يک عامل ضد ميکروبي به کار گرفته شده در مقايسه با قطر هاله مهار رشد ناشي از همان عامل در ترکيب با کلاولانيک اسيد نشانگر توليد احتماليESBL مي‌باشد. در اين تحقيق ابتدا باکتري به صورت متراکم بر روي محيط کشت مولر هينتون آگار کشت داده شده و سپس چهار ديسک سفتازيديم، سفوتاکسيم، سفتازيديم/ کلاولانيک اسيد و سفوتاکسيم/ کلاولانيک اسيد با فاصله‌ي 15 ميليمتر از يکديگر روي آنها قرار داده شدند، بعد از 24 ساعت انکوبه کردن پليت‌ها در دماي 37 درجه سلسيوس، در صورت مشاهده‌ي افزايش بيش از 5 ميليمتر در قطر هاله هرکدام از آنتي‌بيوتيک‌هاي فوق در ترکيب با کلاولانيک اسيد نسبت به آنتي‌بيوتيک تنها، ارگانيسمESBL مثبت و در غير اين صورت ارگانيسم ESBL منفي گزارش مي‌شود.

با انجام اين آزمايشات، آنزيم‌هاي AmpC (که توسط مهار کنندگان بتالاکتاماز مهار نمي‌شوند) از آنزيم‌هاي ESBL متمايز مي‌گردند. براي انجام اين کار مي‌توان بر اساس راهنمايي NCCLS M100S 222012،
gµ10 از کلاولانيک اسيد به gµ30 از سفوتاکسيم و gµ30 از سفتازيديم اضافه نمود و سپس تغييري در اين آزمايش داده شود، بدين ترتيب که در اين روش، هاله‌ي مهار رشد سفپودوکسيم gµ 10 با هاله‌ي مهار رشد سفپودوکسيم/ کلاولانات µg1/µg10 مورد مقايسه واقع مي‌شوند که تفاوت قطر برابر با mm5 و يا بيش از آن در هاله‌ي مهار رشد دليل توليد ESBL مي‌باشد و نيز نسبت قطر هاله‌ي مهار رشد با مهار کننده و يا بدون آن مي‌تواند محاسبه گردد و نسبت 5/1 و يا بيشتر وجود فعاليت ESBL را تأييـــــد مي‌کند (CLSI, 2012).

 

 

 

آزمايش مجاورت دو ديسک (Double disk approximation test:DDT) :

يک روش ديگر در تأييد توليد ESBL، روش مجاورت دو ديسک (DDT) مي‌باشد. در اين روش ارگانيسم مورد آزمايش همانند آزمايش روتين حساسيت ضد ميکروبي روي محيط کشت مولر هينتون آگار پخش مي‌شود و يک ديسک حاوي آموکسي‌سيلين/ کلاولانات µg10/µg20 در وسط پليت قرار داده مي‌شود و ديسک‌هاي حاوي gµ30 از سفتازيديم، سفترياکسون، سفوتاکسيم و يا آزترئونام و يا سفپودوکسيم µg10به فاصله‌ي 25 تا 30 ميليمتري از آن قرار داده مي‌شود. افزايش و يا نامنظمي هاله مهار رشد مابين ديسک سفالوسپورين‌ها و ديسک حاوي کلاولانات نشان دهنده وجود ESBL مي‌باشد. اين روش، اولين تست بيان شده توسط Jarlier و همکارانش در شناسايي اين آنزيم‌ها مي‌باشد. اين روش معمول بوده و انجام آن آسان و مقرون به صرفه است ولي عيب اين روش آن است که اگر تلقيح باکتري خيلي زياد باشد و يا اگر ديسک‌ها خيلي دور از هم قرار داده شوند سينرژي مابين ديسک آموکسي‌سيلين/ کلاولانات و سفالوسپورين به طور غير عمد ناديده گرفته مي‌شود، لذا برخي از محققين فاصله لبه به لبه mm15 بين ديسک‌ها را مطرح کرده‌اند که در اين صورت حساسيت آزمايش خيلي بيش از زماني است که فاصله بين ديسک‌ها 30-25 ميليمتر در نظر گرفته شود (CLSI, 2012).

 

آزمايش سه بعدي (Three – Dimensional test)

در اين روش ابتدا باکتري حساس نسبت به تمامي داروهاي بتالاکتام که بتالاکتاماز منفي نيز مي‌باشند به صورت متراکم بر روي محيط کشت مولر هينتون آگار کشت داده شده و يک ديسک سفترياکسون در مرکز پليت قرار داده مي‌شود. چاهکي به فاصله‌ي 3-2 ميليمتري ديسک مذکور در پليت ايجاد مي‌شود و ژلوز آن قسمت تخليه مي‌گردد. داخل چاهک توسط سوسپانسيوني از باکتري مورد آزمايش با کدورت نيم مک فارلند پر شده و پس از انکوباسيون 24 ساعته نتايج آزمايش مشاهده مي‌شود. در صورتي که باکتري مورد آزمايش بتالاکتاماز مثبت باشد گسترش هاله‌ي عدم رشد باکتري حساس، به سمت ديسک مرکزي سفترياکسون، در نواحي اطراف منطقه‌ي چاهک نشان دهنده‌ي تخريب دارو توسط اين آنزيم و ايجاد امکان رشد براي باکتري حساس در حضور دارو مي‌باشد (CLSI, 2012).

 

 

روش حداقل غلظت مهارکننده (Minimum Inhibitory Concentration) :

در اين تحقيق به روش رقت سازي متوالي (Serial Dilution)، حداقل غلظتي از آنتي‌بيوتيک که قادر به حذف باکتري مي‌باشد تعيين می‌گردد.

در ميان آزمايش‌هاي معرفي شده تاکنون، آزمايش مجاورت دو ديسک پيشنهادي Jarlier و روشMIC پيشنهاديNCCLS آسان‌ترين و مقرون به صرفه‌ترين روش جهت استفاده در بسياري از آزمايشگاه‌هاي باليني مي‌باشد (CLSI, 2012).

روش‌های مولکولی

امروزه با توسعه تکنیک‌های مولکولی به خصوص تکنیک PCR به راحتی می‌توان ژن‌های کد کننده بتالاکتامازهای وسیع‌الطیف را به راحتی و با سرعت و دقت بالا شناسائی کرد. باید توجه داشت با توجه به تغییرات ژنتیکی زیاد در ژن‌های مذکور طراحی یک پرایمر مناسب جهت جداسازی یک ژن خاص بسیار با اهمیت می‌باشد.