معماری

روش‌های عملی در Time PCR – Real

Real-time PCR تکنیکی برای مشاهده بی‌وقفه‌ی پیشرفت واکنش PCR در طول زمان می‌باشد، همچنین با این روش می‌توان مقادیر تولیدات PCR(DNA، cDNA یا RNA) را نیز اندازه‌گیری نمود. این روش بر مبنای فلوروسنت تولیدی از مولکول گزارشگر (Reporter) می‌باشد که در طول واکنش افزایش می‌یابد. مولکول‌های گزارشگر فلوروسنت به صورت رنگ‌هایی می‌باشند که به DNA دو رشته‌ای باند می‌شوند مانند SYBR® Green و یا بصورت شناساگرهای توالی‌های خاص مانندTaqMan® Probes می‌باشند. این تکنیک می‌تواند با حداقل اسید نوکلئیک آغاز شده و مقدار تولید نهایی را با دقت زیادی تعیین نماید. همچنین محدود به زمان و ذخیره منابع نبوده، به راحتی قابل اجرا است و دقت و حساسیت بالاتر از PCR معمولی دارد. این روش توانایی تشخیص توسعه PCR را در مراحل اولیه واکنش دارد، در حالی که تشخیص در PCR معمولی در مرحله نهایی واکنش می‌باشد.

تاریخچه و معرفی Real-Time PCR

در سال‌های ۱۹۹۲ و ۱۹۹۳، Higuchi و همکاران روشی ابداع کردند که امکان تشخیص محصول PCR را هنگام انجام واکنش می‌داد؛ آنها با محاسباتی که در انتهای واکنش انجام می‌دادند، اطلاعات کلیه واکنش‌ها را استخراج می‌کردند. در این سیستم از رنگ اتیدیوم بروماید در واکنش PCR استفاده می‌شد و تغییراتی در ترموسایکلر ایجاد شده بود که می‌توانست نمونه‌ها را با نور ماوراء بنفش تحریک کرده، فلوروسنت بازتاب شده را با استفاده از یک دوربین Cooled CCD متصل به یک کامپیوتر بررسی کند. با مقایسه افزایش فلوروسنس در هر سیکل PCR، نموداری به دست می‌آمد که بسیار بهتر از بررسی محصول PCR در انتهای واکنش بود.

با ایده گرفتن از این روش ابداعی، شرکت (ABI) Applied Biosystems در سال ۱۹۹۶ اولین دستگاه Real-time PCR را با مدل ۷۷۰۰ SDS وارد بازار کرد (شکل ۱). آن دستگاه در زمان خود صحیح‌ترین و حساس‌ترین روش در تشخیص اسیدهای نوکلئیک بود، زیرا توانسته بود بر مشکلات PCR معمولی فایق آید و اختصاصیت و حساس بودن روش PCR را داشت و در عین حال نیاز به الکتروفورز و هیبریداسیون با مواد رادیواکتیو برای تشخیص نیمه کمی را حذف کرده بود .از آن پس شرکت‌های دیگری نیز به استفاده کنندگان این روش پیوستند و آن را ارتقاء دادند. برخی فکر می‌کنند نام Real-time به خاطر توانایی مشاهده منحنی روند پیشرفت واکنش، حین انجام PCR می‌باشد که البته این طور نیست چون نرم افزار ABI 7700 SDS، اولین نرم افزاری که در این دستگاه به کار رفت قادر به نشان دادن منحنی پیشرفت واکنش، در حال انجام برنامه نبود. اصطلاح Real-time به این خاطر به آن اطلاق شد که نرم افزار SDS قادر بود اطلاعات نهایی تمام نمونه‌ها را به صورت یکجا و بلافاصله پس از اتمام واکنش، محاسبه کرده و ارائه نماید، به گونه‌ای که برای کارهای بعدی نیازی به کار اضافی روی اطلاعات نبود. این در حالی بود که پیشرفته‌ترین نرم افزارها در آن زمان پس از اتمام واکنش، اطلاعاتی تولید می‌کردند که نیاز به پردازش و نتیجه‌گیری داشت. از این رو وجه تسمیه Real-time برای این دستگاه، توانایی تولید اطلاعات نهایی بلافاصله پس از اتمام واکنش بوده و قابلیت نمایش پیشرفت واکنش در زمـــــان واقعی Real-time را نرم افزارهای بعدی که در دستگاه نصب شدند، به سیستم اضافه نمودند. در واقع Real-time PCR جمع‌آوری منظم سیگنال‌های فلوروسنت از یک یا چندین واکنش PCR، طی سیکل‌های مختلف یک واکنش می‌باشد و تبدیل این سیگنال‌ها به مقدارهای عددی و اندازه‌گیری غلظت نمونه به کمک آن را qRT- PCR[1] می‌گویند. به این نوع PCR همچنین kinetic polymerase chain reaction (KPCR) گویند.

 

 

کاربردهای مهم Real-time PCR

  • اندازه‌گیری مقدار یا لود ویروس:

همانطورکه ذکر شد در روش Real-time مقدار ژن به صورت کمی قابل جداسازی می‌باشد، لذا از این تکنیک جهت پیگیری اثرات درمانی داروهای خاص می‌توان بخوبی بهره گرفت؛ بطور مثال در بیماری که HBS Ag+ است استفاده از متدهایی مانند PCR معمولی و یا الیزا که روش‌هایی کیفی می‌باشند رهگشا نیست و در عین حال HBS Ag بیمار مثبت گزارش می‌شود، ولی با استفاده از متد Real-time می‌توان Lode یا مقدار ویروس را پس از دریافت دارو رصد کرد که بسیار ارزشمند می‌باشد.

  • کنترل غذاها و داروها
  • بررسی بیان ژن
  • پیش‌ آگهی در مورد سرطان‌ها
  • انگشت نگاری DNA
  • ژن تراپی
  • موفقیت پیوندها
  • ارزیابی کانسرهای خونی

مزیت‌ها و معایب:

Real-time PCR نسبت به سایر روش‌های متداول PCR مزایایی دارد که مهم‌ترین آن‌ها شامل:

۱- میزان محصول در هر چرخه قابل ردیابی است در حالی که محصول روش‌های سنتی پس از پایان واکنش و الکتروفورز مشخص می‌شود.

۲- امکان بررسی و آنالیز چند رونوشت متفاوت در یک تیوپ امکان پذیر است.

۳- حساسیت و دامنۀ دینامیکی آن ۱۰۰۰ برابر RT- PCR (Reverse transcription PCR) معمولی است.

۴- به کمک این تکنیک می‌توان ارزش گذاری کمی انجام داده و میزان الگوی اولیه را دقیقاً تخمین زد.

اما در کنار این مزایا می‌توان به ناتوانی این تکنیک در برآورد اندازۀ محصول تکثیر شده و پرهزینه بودن آن اشاره کرد.

اساس تکنیک Real-time

تکنیک Real-time از بسیاری جهات شبیه PCR معمولی می‌باشد. برنامه واکنش از یک سیکل آغازی و تعداد ۳۰ تا ۴۰ سیکل زنجیره‌ای شامل واسرشت شدن DNA ، اتصال پرایمر و پلیمریزه شدن رشته جدید یا گسترش DNA تشکیل شده است. مواد مورد استفاده برای انجام واکنش همان ترکیبی را دارند که واکنش PCR معمولی دارد. مکانیسم واکنش مشابه PCR است به گونه‌ای که در هر سیکل تعداد نسخه‌های تکثیر شده دو برابر می‌شود. تفاوت آن دو در این است که در سیستم Real-time با به کار بردن رنگ‌های فلوروسنت و پیگیری آنها در خلال واکنش و مشاهده تغییرات جذب فلوروسنت می‌توان پیشرفت واکنش را لحظه به لحظه دنبال کرد و در پایان برنامه، نتایج واکنش‌ها را مشاهده نمود، در صورتی که در واکنش PCR معمولی، بعد از اتمام واکنش، نتایج را با انتقال نمونه‌ها بر روی ژل می‌توان مشاهده کرد. سیستم تشخیص درReal-time، علاوه بر حذف مراحلی که بعد از واکنش PCR برای تأیید صحت آزمایش صورت می‌گیرد، این امکان را فراهم می‌سازد که بتوان میزان DNA تکثیر شده را نیز اندازه‌گیری نمود. برای این منظور دستگاه‌های Real-time علاوه بر داشتن یک بخش تولید کننده گرما، دارای یک بخش تولید و سنجش نور نیز هستند.

به طور کلی دستگاه Real-time از دو بخش مختلف تشکیل شده است: یک بخش چرخاننده گرمایی و یک بخش فلوریمتر. بخش چرخاننده برای اجرای سریع واکنش PCR طراحی شده و برخلاف دستگا‌ه‌های معمول PCR که واکنش در آنها چند ساعت طول می‌کشد در سیستم Real-time، واکنش PCR ظرف ۴۵ تا ۶۰ دقیقه صورت می‌گیرد. بخش فلوریمتر شامل یک منبع نور، فیلترهای نوری و تجهیزات سنجش نور می‌باشد که با کمک آن ابتدا به محلولی که در آن واکنش PCR در حال انجام است نور تابش داده، باعث تحریک ماده فلوروسنت می‌شود و سپس میزان فلوروسنت منتشر شده را اندازه‌گیری می‌کند. این دو بخش به گونه‌ای در کنار یکدیگر قرار داده شده‌اند که قادر هستند کارکردهای ویژه‌ای مثل تشخیص محصول، بررسی کمی و شناسایی جهش‌ها را انجام دهند. دستگاه Real-time قادر است حالت افزایش نمایی پیشرفت واکنش PCR را تشخیص داده، از آن برای کمیت سنجی DNA استفاده کند. این توان منحصر به فرد را رنگ‌های فلوروسنت به دستگاه Real-time می‌دهند. به این ترتیب که آنها با آشکار سازی DNA ازطریق تابش فلوروسنتی که از خود ساطع می‌کنند، باعث تبدیل افزایش نمایی DNA به افزایش تابش فلوروسنت در هر سیکل واکنش PCR می‌شوند که این افزایش با سیستم فلوریمتری دستگاه اندازه‌گیری و ثبت شده، با کمک نرم افزار کامپیوتری مجدداً به اطلاعاتی کمی برای سنجش DNA تبدیل می‌شود .

 

اصول کار Real-time PCR

همانگونه که گفته شــد تمامی اصول و واکنش‌گرهایی که برای یک PCR-RT معمولی نیاز است در time PCR Real – هم بکار می‌رود، اما یک گزارشگر فلوروسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارشگرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر محصول، نور تولید کنند، لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. معمولاً اگر واکنش خود را بهینه کرده باشید در ۳ تا ۱۵ چرخۀ ابتدایی تغییر چندانی در شدت فلوروسنت نمی‌بینید که به این منطقه خط پایه (Base line) گویند. در ادامه شدت فلوروسنت رو به افزایش می‌گذارد. به اولین چرخه‌هایی که شدت فلوروسنت بیشتر از خط پایه باشد، سیکل آستانه (Threshold cycle) یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی‌دار دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد. هر چه مقدار الگوی اولیه بیشتر باشد مقدار CT کم می‌شود. اگر بخواهید با کمک این تکنیک یک برآورد کمی از مقدار الگوی اولیه داشته باشید باید یک نمودار استاندارد رسم نمائید. بدین منظور ابتدا از یک نمونه معلوم، غلظت‌های مشخصی تهیه کرده و به کمک دستگاه، منحنی‌های استاندارد رسم نمائید. در ادامه با تکثیر و ارزیابی CT نمونۀ مجهول و مقایسه آن با منحنی‌های استاندارد، غلظت رونوشت اولیۀ آن را تعیین کنید.

در مقالات بعدی ادامه این مبحث ارائه می‌گردد.

[۱] ) Quantitative Real-Time PCR

روش‌های عملی در Time PCR Real

 اصطلاحات متداول در Time PCRReal :

Amplification plate یا نمودار تکثیر، نموداری است که در آن تعداد چرخه‌ها در مقابل شدت نور فلورسنت رسم می‌شود. منحنی تکثیر تغییرات فلورسانس را روی محور y نشان می‌دهد و محور افقی تعداد سیکل می‌باشد.
Base line  خط پایه، به چرخه‌های ابتدایی گویند که در آن‌ها شدت نور فلورسنت تغییر معنی‌داری نکرده است که معمولاً بین ۳ تا ۱۵ سیکل اول می‌باشد.
Number CT چرخۀ آستانه، به اولین چرخه‌هایی گویند که شدت نور فلورسنت در آن‌ها به صورت معنی‌داری بیشتر از خط پایه است.
Normalization نرمال سازی، عبارت است از بکار بردن یک استاندارد بی‌اثر و بدون تغییر در واکنش، تا به کمک آن بتوان خطاهای مراحل آزمایش را کم کرد یا از بین برد.
Passive reference رفرانس بی‌اثر، یک رنگ برای نرمال سازی به شمار می‌آید. معمولاً از رنگ ROX برای حذف نوسانات تابش و دریافت نور در لوله‌های متفاوت PCR استفاده می‌شود، در واقع ROX رنگی Reference dye می‌باشد، که باعث تصحیح نوسانات فلورسانس می‌گردد و در ایجاد سطحی از فلورسانس جهت تعیینBack Grand بکار می‌رود.
Standard curve منحنی استاندارد، تعداد CT  در مقابل لگاریتم غلظت یک نمونه استاندارد را نمایش می‌دهد و از این نمودار برای تخمین غلظت نمونه‌های مجهول استفاده می‌شود.
Threshold آستانه، خطی است که منحنی تکثیر را در فاز لگاریتمی قطع می‌کند.
ΔRn اختلاف بین میزان بالاترین فلورسانس با پایین‌ترین میزان فلورسانس است. نمونه‌های مثبت باید ΔRn مثبت داشته باشند.
Slope شیب یا انحراف، کارایی و راندمان منحنی Time PCR –Real را نشان می‌دهد، بطوری که در یک منحنی خوب وقتی آستانه و خط پایه را تنظیم می‌کنیم شیبی معادل۲۳/۳- داشته باشد؛ بدین معنی که (۲/۳- تا ۶/۳- ) بهترین محدوده شیب باشد.
CT محل تلاقی منحنی استاندارد با خط Threshold یا آستانه را می‌گویند.
NTC کنترل منفی که فاقد ژن الگو (Template) است.

 آنالیزهای کمی درPCR Real- Time

دو روش عمده برای بررسی کمی درPCR Real- Time وجود دارد که در ادامه به شرح مختصر هر کدام پرداخته می‌شود.

روش منحنی استاندارد (مقایسۀ مطلق)

در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفتومتر (در طول موج nm260) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌گردد. لازم بذکر است که استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است، هر چند که بسیار گران قیمت‌اند.

برای حذف نوسانات مقادیر RNA وارد شده در واکنش و خطاهای عملکرد دستگاه‌ها و فرد از استانداردهای داخلی استفاده می‌شود. این استانداردها باید در همۀ بافت‌ها بیان ثابت داشته باشند و آزمایش ما نباید بیان آن را نسبت به نمونۀ کنترل تغییر دهد. بدین منظور از ژن بتا اکتین (Beta actin) و       Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) استفاده می‌شود. به این ژن‌ها Housekeeping گویند. علاوه بر برپایی PCR با پرایمر اختصاصی ژن برای هر نمونه یک PCR همزمان با پرایمر بتا اکتین یا GAPDH هم انجام می‌شود و داده‌های هر نمونه با ژن Housekeeping همان نمونه نرمالایز می‌شود، سپس با استفاده از نمودار استاندارد می‌توان به غلظت نمونۀ مجهول پی برد.

روش آستانه نسبی (مقایسۀ نسبی)

در این روش نیازی به رسم منحنی استاندارد نیست و مقدار نرمالایز شدۀ CT نسبت به یک نمونۀ تیمار نشده سنجیده می‌شود. در این روش نیز به استانداردهای داخلی نیازمندیم و باید مقدار CT آن‌ها از مقدار CT نمونۀ مورد نظر کسر گردد (نرمالایز کردن).

تفاوت نسبی نمونۀ آزمایش در مقابل کنترل با فرمول ۲ -ΔΔCT محاسبه می‌شود.

ΔΔCT = ΔCT) نمونه هدف ΔCT – کالیبره کننده(

ΔCT عبارت است از CT ژن هدف (یا کالیبراتور) که از CT ژن خانه‌زاد کسر شده است.

طبق مقالۀ Pfaffle و همکارانش بهتر است برای هر تیمار سه تیوب تهیه شود و هر آزمایش سه بار تکرار شود (۹ داده برای هر تیمار) سپس میانگین آن برای معادله بکار برده شود؛ به عنوان مثال اگر میانگین اختلاف CT یک تیمار با استاندارد داخلی ۱۷ و میانگین اختلاف نمونۀ شاهد با استاندارد داخلی‌اش ۱۹ شود داریم:

۲ -ΔΔCT = 2 – (۱۷ – ۱۹ ) = ۲ ۲ = ۴

این عدد بازگو می‌کند که تیمار ما موجب افزایش ۴ برابری ساخت mRNA هدف شده است.

 

کارایی Real- time PCR

قبل از اندازه‌گیری کمی باید کارایی PCR سنجیده شود. کیفیت و طراحی پرایمرها مهم‌ترین عامل اثرگذار بر کارایی PCR است. علاوه بر آن نوع دستگاه، نوع کیت مصرفی و پروتکل آزمایش نیز بر کارایی PCR اثر می‌گذارند. بدین منظور باید از ژن مورد مطالعۀ خود یک سریال رقت تهیه گردد (دانستن غلظت اولیه اهمیت ندارد). این سریال رقت را Real- time PCR کنید. کارایی دستگاه طبق معادلۀ پافل بین ۹۰ تا ۱۱۰ درصد و رگرسیون خط باید حداقل ۹۵/۰ شود. همین آزمایشات را برای استاندارد داخلی نیز تکرار کنید. اعداد بدست آمده باید به هم نزدیک باشند و در رنج نرمال قرار بگیرند (به مقالۀ Pfaffle مراجعه کنید).

 

نکاتی کاربردی در مورد طراحی پرایمر و پروب در تکنیک Real –Time PCR

در فصل‌های گذشته اصول طراحی پرایمر در PCR ساده و همچنین نرم افزاری که برای این منظور استفاده می‌شود بصورت مشروح آورده شد. ضمن در نظر داشتن تمامی آن موارد در هنگام طراحی پرایمر و پروب می‌بایستی به نکات زیر نیز توجه گردد:

۱-پروب به گونه‌ای طراحی شود که دمای Tm آن ۱۰-۸ درجه بالاتر از Tm پرایمر باشد.

۲- در روش TaqMan پرایمر طوری طراحی گردد که طول محصولات بین ۱۵۰bp-200bp باشد و در روش Sybr Green حداکثر طول محصولات ۲۵۰bp-300bp باشد، زیرا طول بیشتر از حد محصول، موجب اشباع شدن قسمت خوانشگر (دوربین دستگاه) می‌گردد.

۳- همیشه ابتدا پروب قبل از پرایمر طراحی گردد و طول پروب حدود ۲۵bp باشد، در قسمت انتهای ۵′ پروب یک رنگ فلورسانس مانند FAM قرار می‌گیرد (کانال رنگی سبز) در صورتی که انجام آزمایش به صورت Multiplex Real-Time PCR باشد، می‌بایستی برای پروب‌های دیگر رنگ‌هایی با کانال رنگی متفاوت در نظر گرفته شود مانند رنگ joe و Hex (کانال رنگی زرد)، ولی خاموشگر نظیر TAMRA که در ناحیه انتهای ۳′ قرار دارد می‌تواند در تمامی پروب‌ها مشترک انتخاب گردد. دقت شود بین رنگ فلورسانس گزارشگر و قسمت خاموشگر ۱۸bp- 25bpفاصله باشد.

۴- با توجه به اینکه گوانین (G) می‌تواند دارای اثر خاموش کننده‌ای باشد، در طراحی پروب دقت شود از قرار گرفتن ۴ تا گوانین پشت سر هم اجتناب گردد. همچنین گوانین نباید خیلی نزدیک به انتهای ۵′ پروب باشد زیرا باعث خاموش شدن رنگ فلورسانس گزارشگر (Reporter) می‌گردد.

 

مرور چند نکته عملی مهم

همین طور که ذکر شد تکنیکReal –Time PCR روشی بسیار دقیق است و به همین جهت از نظر آلودگی بسیار حساس بوده و در صورت کم دقتی در مر احل انجام آزمایش، احتمال آلوده شدن مواد آزمایش و ایجاد خطا در نتیجه بسیار بالا می‌باشد، از این رو توجه به نکات زیر ضروری است:

۱- ابتدا تمام وسایل از قبیل سمپلرها را با وایتکس ۱۰% تازه تهیه شده استریل کنید و همچنین تمام میکروتیوب‌ها و سر سمپلرها را به اندازه لازم استریل کرده و زیر هود قرار دهید.

۲- قبل از اینکه درب هود باز شود موتور هود به مدت ۵-۳ دقیقه روشن گردد تا دستگاه شروع به مکش نماید.

۳- از برخورد محلول‌های آزمایش با موادی که اثر مهارکنندگی (Inhibitor ) دارند اجتناب شود؛ بعنوان مثال از استفاده دستکش‌های واجد پودر خودداری گردد، همین طور از استخراج DNA با روش‌هایی که در آنها از کلروفرم استفاده می‌شود جداً اجتناب شود.

۴- در هنگام کار ابتدا میکروتیوب حاوی مواد واکنش را برداشته و سپس نوک سمپلر برداشته شود و چنانچه نوک سمپلر در حین حرکت به هر کجا برخورد کرد دور انداخته شود.

۵- پرایمر و پروب‌ها را قبل از انجام آزمایش از فریزر خارج کرده و در مجاورت یخ قرار دهید تا به آرامی آب شوند و از آب کردن آنها با دست یا هیتر خودداری کنید.

۶- بهتر است همیشه تعداد آزمون‌هایی که قرار است انجام شود از قبل پیش بینی گردد و به همان اندازه از پروب و پرایمر در حجم‌های کوچک الیکوت کرده و داخل فریزر قرار گیرد و پس از هر بار مصرف مقدار باقی مانده دور ریخته شود.

۷- جهت ساخت Master Mix به گونه‌ای عمل گردد که ابتدا پرایمرها و پروب‌ها و سایر اجزاء واکنش با هم مخلوط گردند و پس از انتقال به فریزر Template DNA یا RNA به زیر هود منتقل شوند. بسیار مهم است که اجزاء واکنش Real-Time PCR و نمونه‌های مورد آزمایش با هم تداخلی نداشته باشند. این قضیه در ممانعت از آلوده شدن محلول‌ها (Reagent contamination) بسیار ضروری است.

۸- تمامی مراحل آزمایش دقیقاً طبق کیت یا پروتکل انجام شود.

۹- دقت در Pipetting و همچنین مخلوط کردن وSpin محلول‌ها در بدست آوردن نتیجه خوب تأثیرگذار است.

۱۰- نتیجه کارها بصورت مرحله به مرحله پیگیری شود و پس از نوشتن گزارش کار روزانه، گراف‌های بدست آمده همراه با تفسیر نتایج ثبت گردد.

۱۱- میزان پروب و پرایمرها هر کدام به تنهایی از جهت مقدار ΔRnاپتیمایز گردد. همچنین اپتیمایز کردن میزان Template DNA یا RNA بسیار مهم می‌باشد.

۱۲- به لحاظ حساسیت بالای این تکنیک توصیه مهم این است در هنگام کمبود وقت و یا بی حوصلگی از انجام آزمایش خودداری گردد.

 

 

راه‌اندازی یک پلیت به روش Absolute Quantitation در دستگاه ABI7500

  • ابتدا از منوی start بر روی نرم افزار برنامه کلیک کنید تا پنجره Quick start document باز گردد. (شکل ۱)

 

  • سپس در همین پنجره بر روی باکس Create New Document کلیک کرده تا پنــــجره New Document Wizard باز شود.
  • سپس در پنجره New Document Wizard از قسمت Assay نـــــــــــــــــــوع آزمون (Absolute Quantitation) را انتخاب کنید. در قسمت Comment می‌توانید هرگونه یاداشتی که داشته باشید را مرقوم نمائید.
  • در قسمت Plate Name برای آزمون خود یک نام انتخاب و سپس Next را کلیک کنید. (شکل۲)

 

  • در پنجره New Document Wizard جدیدی که باز می‌شود، در قسـمت باکس Reference dye رنگ مرجع مورد استفاده در آزمون خود را انتخاب کنید. بر روی Detector مورد نظرتان را های‌لایت کرده و کلمه Add را کلیک کنید تا Detector مورد نظرتان برای آزمون انتخاب گردد. چنانچه Detector مورد نظر وجود ندارد برای ایجاد Detector جدید به قسمت بعد رفته و در پایان این مرحله کلمه Next را کلیک نمایید. (شکل ۳)

 

 

 

  • در پنجره New Document Wizard جدیدی که باز می‌شود برای هر چاهک آزمون نوع Detector و وظیفه آن را می‌توان انتخاب کرد.

برای این منظور چاهک و یا چاهک‌های مورد نظر را با ctrl-click انتخاب ‌کنید (۶a). سپس نام Detector‌ها برای چاهک‌های انتخاب شده را انتخاب نموده (۶b)، سپس از گزینه Task نوع نمونه (Unknown یا standardیا NTC) انتخاب می‌شود (۶c). در باکس Quantity غلظت نمونه استاندارد را وارد و در پایان کلمه Finish را کلیک کنید. (شکل ۴)

 

 

  • سپس در پنجره جدیدی که باز می‌شود کلمه Setup را انتخاب کرده و بر روی کلمه plate کلیک کنید تا پنجره آن باز شود. چاهک و یا چاهک‌های مورد نـظرتان را انتخاب نموده و بـا Right click بر روی دکمه موس گزینه well Inspector را انتخاب کرده و کلیک نمایید. سپس در باکس sample name نام نمونه را انتخاب کنید. در قسمت Detector تیک آن را بزنید و در قسمت باکس reference day نام رنگ مرجع بکار رفته در آزمون را انتخاب کنید و در پایان بر روی Close کلیک نمائید.
  • در پایان برای بکار انداختن سیکل‌های حرارتی بر روی Instrument کلیک کرده و در این صفحه بر حسب اینکه آزمون شماOne step RT- PCR یاTwo step باشد سیکل‌های حرارت را در قسمت مربوطه تنظیم کرده و سپس در قسمت Sample Volume حجم واکنش و در قسمت Data Collection مشخص کنید که فلورسانس تابشی در کدام Stage@ step جمع‌آوری گردد. در پایان کلید Start را بزنید که دستگاه ضمن درخواست Save برنامه به کار می‌افتد. (شکل ۵)

 

 

 

 

بـــــــــرای مشاهده لحظه به لحظه پیشرفت واکنش قسمت Result را کلیک کرده و سپس Plot amplification را کلیک کنید و بر روی صفحه مانیتور لحظه به لحظه پیشرفت واکنش را مشاهده کنید. معمولاً بر اساس اینکه تعداد کپی اولیه موجود در نمونه چقدر باشد می‌توان منحنی تکثیری نمونه را مشاهده کرد. هرچه تعداد کپی اولیه عامل مورد نظر در نمونه بیشتر باشد در نتیجه Ct کاهش یافته و منحنی زودتر رؤیت می‌گردد. (شکل ۶)

 

 

آنالیز داده‌ها و گزارش جواب‌ها:

بطور کلی هر نمونه مثبت باید دارای منحنی تکثیر (Amplification plot) با ویژگی و تعاریف زیر باشد:

هر منحنی باید دارای سه فازBaseline ، Exponential وplateau باشد، در غیر این صورت جواب قابل قبول نیست (شکل ۸).

 

 

 

تنظیم Baseline:

همانگونه که ذکر شد تنظیم Baseline و Thresholdدر کسب یک نتیجه درست و همچنین تفسیر صحیح نتایج بسیار مهم می‌باشد، برای این منظور به (شکل ۹) دقت کنید.

در شکل مقابل baseline به خوبی تنظیم شده و بلافاصله چند سیکل بعد از Baseline منحنی‌های تکثیری شروع شده است.
در شکل مقابل baseline خیلی پائین انتخاب شده است که در این حالت باید End cycle را افزایش داد.
در شکل مقابل Baseline خیلی بالا انتخاب شده که در این حالت باید End cycle را کاهش داد.

 

تنظیمThreshold Line  

روش تنظیمThreshold Line در شکل شماره ۱۰ نشان داده شده است:

Threshold Line به خوبی تنظیم شده است
Threshold Line بالا کشیده شود.
Threshold Line پائین کشیده شود.

 

 

سایر پارامترها که باید ملاحظه گردد:

  • قسمت Component Tab، کنترل کنید اگر نمودار رنگ‌های فلورسانس مورد در آزمون به شکل شماره ۱۱ باشد، طبیعی است.

در موارد غیر طبیعی ممکن است FAM creepو ROX drop اتفاق بیفتد. (شکل ۱۲)

 

  • Rn vs. Cycle (Linear) View

تشخیص تکثیرهای واقعی باید به شکل ۱۳ باشد که با مشاهده Rn vs. Cycle (Linear) View مشخص می‌گردد و هرگونه نمودار تکثیری که مغایرت با آن داشته باشد باید غیر طبیعی در نظر گرفته شود.

  • Rn vs. Cycle (Linear) View

با تنظیم این پنجره Outlier مشخص می‌شود و نشان می‌دهد در کدام چاهک نمونه ما فاقد تکثیر واقعی بوده است.

و در پایان بعد از کنترل و تنظیم موارد بالا باید منحنی استاندارد به فرم طبیعی زیر بدست آید

 

یعنی اینکه نمونه‌ها و استـــــانداردها روی یک خط قرار گرفته باشند و Slop یا شیب منحنی باید -۳٫۳ تا -۳٫۶ باشد و بهترین شیب -۳٫۳۲ است و R آزمون بالای ۰٫۹۸ باشد.

همچنین در یک آزمون نرمال بایستی نمونه‌های استاندارد که یک لگاریتم اختلاف غلظت دارند اختلاف Ct آنها ۳٫۳ باشد.

 

نویسندگان:

شهرام شجاع (دانشجوی کارشناسی ارشد)

دکتر رضا میرنژاد (باکتریولوژیست- استادیار دانشگاه)

 ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

همانطور که می‌دانید پایه و اساس زندگی به سلول استوار بوده و در حقیقت حیات هر سلول به مواد موجود در هسته سلول وابسته است. اولین بار در سال ۱۷۱۰ م. آقای وان لوک هوک منطقه مشخصی را که هسته نامیده شد در مرکز سلول‌های زنده یافت، اما اساساً اولین توصیف دقیق در مورد هسته را در سال ۱۸۳۱ م. آقای رابرت بران ارائه داد.
کشف ماده وراثتی DNA که زیربنای تمام مطالعات سلولی و هسته سلول است اولین بار توسط آقایان واتسون و کریک مطرح شد.

DNA یک مولکول دورشته‌ای موازی معکوس و حاوی ترادف‌های نوکلئوتیدی است که آنتی‌پارالل نامیده می‌شود

هدف PCR:
هدف PCR تکثیر یک نسخه از ژن می‌باشد.
PCR نخستین بار در سال ۱۹۸۳ توسط آقای کاری مولیس ابداع شد و انقلابی در ژنتیک مولکولی بوجود آورد. همانندسازی DNA درواقع راز بقای موجود زنده است، چرا که طی این فرآیند محتوای ژنتیکی سلول مضاعف شده و به دو سلول دختر حاصل از تقسیم سلولی وارد می‌گردد. مکانیسم و روش کار در PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و درواقع برگرفته از آن است.
برای انجام آزمایش PCR در مرحله اول Pre-PCR (DNA Extraction)، با استخراج DNA از نمونه مورد آزمایش شرایط را برای مرحله بعد، فرایند PCR آماده می‌کنیم در این مرحله از انجام آزمایش، برای همانندسازی از ژن یا DNA استخراج شده در مرحله قبل، موارد ذیل موردنیاز است:
a ـ الگو DNA Template؛ یعنی آن چیزی که باید همانندسازی شود.
b ـ بازهای A=T و C=G نوکلئوتید تری فسفات (ATP-CTP-GTP-TTP) dNTP
c ـ پرایمر (قطعه اولیه DNA) که محل تکثیر و البته اندازه قطعات تکثیرشونده را مشخص می‌کند.
d ـ DNA پلیمراز (DNA پلیمراز همان ماشین کپی‌کننده است که تنها قطعات بین پرایمر و DNA اولیه را همانندسازی می‌کند).

در هر سیکل PCR آن‌طور که در تصویر زیر مشاهده می‌شود:
در مرحله جداسازی (Denturation) دو رشته DNA در شرایط مناسب در دمای ۹۶ درجه از هم جدا می‌شوند، آنگاه در مرحله (Annealing) در دمای ۶۵ ـ ۳۰ درجه اتصال یا چسبندگی پرایمر به بازهای ‘۵ و “۳ رشته‌های بازشده DNA صورت می‌گیرد و در پایان مرحله تکثیر یا همانندسازی در شرایط مناسب دمای ۷۵ ـ ۶۵ درجه نسخه جدید رونویسی می‌شود که می‌تواند بارها تکرار شود تا از یک رشته DNA با هر سیکل حرارتی به‌طور تصاعدی ژن یا قطعه موردنظر تکثیر یابد.

Copie
Target gone    PCR
Cycle    c ـ همانندسازی    b ـ اتصال پرایمر    a ـ جداسازی    Target genes
۲    ۱
۴    ۲
۸    ۳
نمایی ساده و کلی از یک فرایند PCR

در گذشته تأمین این حرارت‌های پشت سر هم از سه بن ماری با سه دمای متفاوت انجام می‌گرفت ولی امروزه با پیشرفت تکنولوژی می‌توان این درجه حرارت‌های بالا و متوالی را به‌طور سریع با دستگاهی به نام ترموسایکلرکه به کمک این تکنیک آمده است، بدست آورد و البته می‌توان دمای مناسب و تعداد سیکل‌های موردنیاز را قبل از انجام کار، برنامه‌ریزی نمود. واکنش زنجیره پلیمراز PCR یک روش فنی بسیار قوی برای تکثیر و ازدیاد قطعات DNA در مدت‌زمان کوتاه و در یک محیط غیرحیاتی است.
این واکنش نظیر یک دستگاه فتوکپی زیستی تمام خودکار است که از روی یک نسخه DNA اولیه ظرف مدت کوتاهی میلیون‌ها نسخه تکثیر می‌یابد تا در تشخیص بیماری‌های عفونی، وراثتی، جرم‌شناسی و … در اختیار پزشک یا پژوهشگر قرار گیرد.
مرحله آخر در یک آزمایش،PCR ، Electrophoresis است؛ که برای مشاهده و یا به عبارتی detect نمودن قطعات تکثیرشده محصول PCR می‌توان از الکتروفورز بر روی ژل آگارز و رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید استفاده نمود. اتیدیوم بروماید در کنار نفوذ بالایی که در رشته‌های DNA دارد با خاصیت فلورسنتی خود می‌تواند به‌عنوان یک نشانگر عمل کند.

آن‌طور که در تصویر مقابل مشاهده می‌شود بر اساس تابش نور U.V به ژل آگارز در دستگاه ترانس‌لومیناتور در صورت حضور اتدیوم بروماید و البته DNA تکثیرشده در مراحل PCR، رنگ نارنجی اتیدیوم که با رشته تکثیری باند شده، نور فلورسنتی ساطع می‌شود که در مقایسه با محل توقف کنترل مثبت، منفی و نیز Lader (خط کش یا شاخصی با وزن مولکولی معین) می‌توان جایگاه احتمالی قطعه DNA تکثیری را تشخیص داد.

اهداف آموزشی: آشنایی مختصری از کاربرد تکنیک PCR:
تشخیص بیماری‌های ژنتیکی، بیولوژی مولکولی، ‌میکروب‌شناسی تشخیصی، تشخیص سرطان و …

تشخیص قبل از تولد جهت بیماری‌های ژنتیکی:
پس از تهیه سلول‌های جنینی و تکثیر پرایمرهای ژن بیمار با پرایمرهای ژن سالم که با روش‌های ایمنومولکولار صورت می‌گیرد، نتایج گزارش می‌گردد. با توجه به اینکه می‌توان از یک کپی  DNAمیلیون‌ها کپی تهیه نمود، از این روش برای تشخیص قبل از لانه‌گزینی استفاده می‌شود. در این روش لقاح خارج از رحم اتفاق افتاده و پس از تکثیر در مرحله ۸ یا ۱۶ سلولی ۱ یا ۲ سلول آن را جهت آزمایش PCR و پیدا نمودن نقص ژنتیکی که قبلاً در خانواده مشخص شده است، انجام می‌دهند.

در پزشک قانونی و آسیب‌شناسی جنایی:
کمترین مقدار DNA بدست آمده از یک قطره خون، یک مو و … با PCR تکثیر و با نقشه ژنتیکی یا DNA فرد مظنون مقایسه می‌گردد. در جرم‌شناسی بعد از انگشت‌نگاری روش PCR بزرگترین تحول را ایجاد کرده است. همچنین در بدست آوردن نسبت پدر فرزندی یا مادری از این روش استفاده می‌گردد.

بررسی عفونت‌های باکتریایی و ویروسی:
تشخیص عفونت‌های میکروبی در آزمایشگاه معمولاً با انجام کشت و یا بررسی وجود آنتی‌بادی در خون بیمار صورت می‌گیرد که وقت‌گیر است و بررسی‌های ایمنولوژیکی نیز گاهی بدلیل عدم حساسیت لازم و نیز در مواقعی که بیمار در مراحل اولیه بیماری باشد هم قابل انجام نیست، از این رو برای تشخیص مثلاً HIV پس از نمونه‌گیری از خون محیطی، از توالی اختصاصی ویروس HIV به‌عنوان پرایمر همانندسازی آن قطعه ژن موردنظر در صورت وجود عفونت استفاده می‌گردد و تشخیص HIV با حساسیت بالا و در سریع‌ترین زمان انجام می‌شود. در تشخیص بیماری سل نیز به همین ترتیب نمونه خلط و یا هر نمونه که پزشک احتمال عفونت سلی را می‌دهد با شرایط صحیح گرفته می‌شود و به همراه پرایمرهای اختصاصی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس طبق یک دستورالعمل مشخص استخراج و PCR انجام می‌گردد و قطعات DNA تکثیریافته مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. این تکنیک علاوه بر سرعت بالایی که به تشخیص می‌دهد از خطرات آلودگی برای پرسنل در حین هضم و تهیه لام از نمونه موردنظر بسیار می‌کاهد.

مشکلات و موانع احتمالی در انجام PCR:
آلودگی نمونه مورد بررسی یکی از مهم‌ترین مشکلات PCR است که به دلیل حساسیت فوق‌العاده و قدرت همانندسازی بالا، هر قطعه خارجی که وارد محیط شود ممکن است مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج دور از واقعیت را بوجود آورد، ازاین‌رو می‌بایست بسیار ایزوله و با دقت در این روش کار کرد و همچنین باید از شاهدهای مثبت و منفی و Lader استفاده نمود تا حتی‌المقدور از اشتباهات احتمالی آگاه شویم. البته در روش Nested PCR که با دو نوع پرایمر کار می‌شود (جهت بالا بردن اختصاصیت روش) نیز از ایجاد آلودگی در نتایج آزمایش کاسته می‌شود.
امروزه PCR در تشخیص جهش‌ها و سرطان‌ها نیز بسیار کاربردی است و کمک فراوانی به پزشک در پیش‌آگهی بیماری می‌دهد.

تصاویر در فایل پیوست موجود است

[gview file=”http://persianlab.com/wp-content/uploads/شماره-۲٫doc”] [gview file=”http://persianlab.com/wp-content/uploads/pcr.doc”]