معماری
سلول استم سل

سلول استم سل (stem cell)

سلول های بنیادین (stem cells) ومشخصاتسلول های بنیادی (stem cells) دو ویژگی اساسی یعنی توان تقسیم و تولید سلول هایی با خواص یکسان (خود نو زایی : self-renewal)و ایجاد انواع سلولهای تمایز یافته دارند بر اساس توان تمایز و برگشت پذیری انها سلولها را میتوان به انواع زیر تقسیم نمود :

سلول های بنیادی (stem cells) دو ویژگی اساسی یعنی توان تقسیم و تولید سلول هایی با خواص یکسان (خود نو زایی : self-renewal)و ایجاد انواع سلولهای تمایز یافته دارند بر اساس توان تمایز و برگشت پذیری انها سلولها را میتوان به انواع زیر تقسیم نمود :

1)همه توان (totipotent ) این سلولها میتوانند همه ی سلولها اعم از سلولهای فرد و سلول های برون جنینی (جفت) را بسازند مانند بلاستومرهای یک جنین دو سلوای که هر سلول آن میتواند یک فرد کامل را بسازد.
2)پرتوان (pluripotent) سلول های هستند که میتوانند همه یا غالب سلول های بدن فرد را بسازند. مثلا سلولهای بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلولهای برون جنینی نیستند سلولهایی که از گنادهای جنینی( (fetus به دست می آیند و به آنها سلولهای زاینده جنینی (Embryonic Germ cells; EG) گفته می شودنیز جز این دسته هستند سلولهای تمایز نیافته ی کارسینومای جنینی (Embryonal Carcinoma Cells; EC) مشتق از تراتوکارسینومس ها نیز پرتوان هستند. تراتوکاسینومس ها تومورهای تمایز یافته ی خوش خیم هستند که دارای جمعیت های تمایزنیافته ی زیادی هستند. مطالعات قبلی رخداد تراتوکارسینوما را به صمرت خود به خودی نشان داده است. این سلولها قابلیت تمایز در محیط ازمایشگاهی و یا به صورت تشکیل تراتوکارسینوما را دارند. تک تک این سلول ها قادر به تشکیل کلونی هستند و با تمایز می توانند مشتقات سه لایه ی زاینده (اکتودرم مزودرم اندودرم) را به وجود اورند.
3)چند توان (multipotent) تعداد محدودی ازانواع سلول را ایجاد می کنند (مانند سلولهای بنیادی واقع در بافتهای بزرگسالان).
به طور کلی سلول های بنیادی دارای دو منشا جنینی (embryonic) و بزرگسالان (adult) هستند. سلول های بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (inner cell mass: ICM) جنین در مرحله بلاستوسیست به دست می آیند دسته دیگر سلولهای بنیادی بزرگسالان هستند که در بسیاری از سلول های تخصص یافته بدن از جمله مغز مغز استخوان کبد پوست لوله گوارش قرنیه و شبکیه چشم و حتی پالپ عاج دندان یافت می شوند. در بزرگسالان در هنگام جراحت و حتی در غیاب ان به طور مداوم این سلول ها فعال هستند. قبلا دانشمندان فکر می کردند که سلولهای بنیادی بزرگسالان تنها سلول های همان بافت را ایجاد میکنند اما امروزه معتقدند پلاستیسیته این سلول ها بیش از ان است و این سلولها می توانند انواع دیگری از سلول ها را نیز بسازند. برای مثال سلول های بنیادی بزرگسالان مشتق از مغز استخوان علاوه بر انکه می توانند سلول های خونی و ایمنی را بسازند قادرند به صورت transdifferentiation و یا تمایز مستقیم انواع دیگری از سلولها نظیر سلول های ماهیچه اسکلتی میکرو گلیا و استروگلیا در مغز و هپاتوسیت های کبدی را بسازند بر اساس این مشاهدات پیشنهاد شده که ممکن است این سلول هایدر طب پیوند قابل کاربرد باشند. اما دانشمندان دیگر در این مورد شک دارند و نشان داده اند که این سلولهای بنیادی مغز استخوان به بافت های غیر خونی کم دیده شده است بنابراین به این سوال که ایا سلولهای بنیادی بزرگسالان سلول های پر توان حقیقی هستند و قادر به تکثیر نامحدود در محیط کشت می باشند هنوز پاسخ مشخصی داده نشده است سلول های بنیادی و به خصوص سلول های بنیادی جنینی در مطالعات زیست شناسی تکوینی طب پیوند توسعه داروسازی ناهنجاری شناسی تولید موشهای ترانس ژن وknockout اهمیت دارند در اینجا به بیان نحوه تولید و کاربرد بالقوه سلول های بنیادی جنینی پرداخته می شود
درحقیقت منشا سلول های بنیادی جنینی مشخص نیست و معلوم نیست که ایا سلول های بنیادی جنینی ٬ سلول هایی در توده سلولی بلاستوسیست هستند ویا ان که همان توده سلولی داخلی بلاستوسیست تحت شرایط ازمایشگاهی تبدیل به سلول های بنیادی جنینی می شوند. به هرحال برای اهداف تحقیقاتی تعریف یک سلول بنیادی جنینی بیش از سلول بنیادی با توان تقسیم زیاد مشتق ازجنین است که می تواند تقریبا به تمام سلول های بدن تمایزیابد. بنابراین بیان نکات با اهمیت و خاص در تعریف سلول های بنیادی جنینی ضروری است. بر اساس تعریف استین اسمیت که مطالعات زیادی بر سلول های بنیادی جنینی موش دارد مشخصات ذیل را برای تعریف سلول های بنیادی جنینی ضروری می داند.
1)از توده سلولی داخلیICM))و یا اپی بلاست بلاستوسیست مشتق شده است.(a)
2) دارای توان تقسیم متقارن نامحدود و بدون تمایز باشد و در این حال توان تمایزی را حفظ نماید( به عبارت دیگر در بلند مدت هم توان خود نوزایی داشته باشد )(a) .
3) دارای کاریوتیپ طبیعی کروموزومی بوده و این حالت را نیز حفظ نماید.
4)سلول های بنیادی جنینی پر توان بتوانند انواع سلول تمایز یافته که مشتق از سه لایه زاینده اولیه جنین (اندودرم٬ مزودرم و اکتودرم )است را به وجود اورند.
5) طی تکوین٬دارای توان ادغام در تمام بافت های جنینی باشد (سلول های بنیادی جنینی موشی به مدت طولانی در محیط آزمایشگاهی حفظ شده اند و هنوز هم پس از انکه به داخل یک جنین دیگر وارد می شوند٬می توانند هر بافتی را به وجود آورند که حاصل ان ایجاد یک جانور کایمرا است )(a,b) .
6) دارای توان تولید دودمان زاینده (germ line) که در نهایت اسپرم و تخمک را می سازند٬باشد. به عبارت دیگر قابلیت germ-line transmission را داشته باشد.
7) کلون زایی (clonogenic) به این معنی که یک سلول منفرد دارای تولید یک کلونی متشکل از سلول های با خواص ژنتیکی یکسان باشد و یا اینکه کلون ها دارای خواص مشابه سلول مبدا باشند(a) .
8) بیان فاکتور نسخه برداری Oct-4. این فاکتور٬ سبب تحریک یا مهار دسته ای از ژنها می شود که سلول های بنیادی جنینی را در حال تکثیری و غیر تمایزی نگه می دارد.
9)بتوان ان را به تکثیر و تمایز القا کرد.
10) فاقد نقطه کنترل ((checkpoint G1 باشد. سلول های بنیادی جنینی بیشتر زمانشان را در فازS (سنتزDNA) هستند. بر خلاف سلول های سوناتیکی تمایز یافته سلول های بنیادی جنینی نیازی به تحریک بیرونی برای آغاز همانند سازی DNA ندارند.
11)سلول های بنیادی جنینی غیر فعال شدن کرموزوم Xرا نشان نمی دهند. در هر سلول سوماتیک پستانداران ماده یکی از دو کروموزوم X به طور دایم غیرفعال می شود. غیر فعال شدن کروموزوم X در سلول های بنیادی جنینی روی نمی دهد.
a )این خصوصیت در سلول های   انسانی نشان داده نشده است.    (b این خصوصیت در سلول های بنیادی جنینی نشان داده نشده است. تمام سلول های بنیادی فوق در سلول های بنیادی جنینی موشی نشان داده شده است.
علاوه بر این سلول های بنیادی جنینی و سلول های کارسینومای جنینی همانند توده سلولی داخلی بلاستوسیست های موشی تعدادی از نشانگرهای سطحی سلول های پرتوان جنینی را نشان می دهند
کلیات تولید سلول های بنیادی جنینی
تولید سلول های بنیادی جنینی از موش یا انسان فرآیندی چند مرحله ای است که به طور شاخص شامل مراحل ذیل می باشد
1)توده  سلولی داخلی بلاستوسیست پیش از لانه گزینی از تروفواکتودرم (لایه سلولی بیرونی )اطراف ان جدا می شود. به طور کلی جداسازی بلاستوسیست به دو روش ذیل صورت می گیرد. هر دو روش در تولید سلول های بنیادی جنینی انسانی و موشی کاربرد دارد
الف)مکانیکی : پس از کشت بلاستوسیست جنین به کف ظرف متصل می شود و سپس سلول های تروفواکتودرمی در سطح شروع به رشد می کنند ولی سلول های بنیادی جنینی که از توده سلولی ذاخلی (ICM)به سمت بالا تکثیر می یابند و بعد از چند روز (5-3)برامدگی گنبدی شکلی درست می شود در این هنگام با کمک یک پیپت می توان به راحتی ICMرا از تروفواکتودرم جدا کرد. البته گاهی نیزICM همراه با تعدادی از سلول های تروفواکتودرم جدا می شود.
ب) جراحی با کمک ابزار ایمنی (immunosurgery) : در این روش از ابزار های ایمنی یعنی کامپلیمان Complement  و آنتی بادی استفاده می شود. به این ترتیب که در ابتدا آنتی بادی خرگوشی علیه سلول های موشی به محیط کشت حاوی بلاستوسیست افزوده می شود و پس از اتصال آنتی بادی ها به سلول های تروفواکتودرمی که در سطح قرار دارند بلاستوسیست ها به محیط حاوی کامپلیمان خوکچه هندی منتقل می شوند. در این زمان کامپلیمان در کنار آنتی بادی فعال می شود  و سلول های تروفواکتودرمی را لیز میکنند. لازم به ذکر است از انجا که ICMدر داخل قرار دارد و و هیچ گونه آنتی بادی به ان متصل نمی شود بنابراین به طور سالم باقی می ماند.
2) کشت ICM برسلول های تغذیه کننده : کشت سلول های تغذیه کننده برای رشد سلول های بنیادی جنینی به منظور تامین مواد ناشناخته مورد نیاز سلول های بنیادی جنینی است البته گاهی سلول های بنیادی جنینی را بدون سلول های تغذیه کننده کشت می دهند ولی در این هنگام کشت سلول های بنیادی جنینی نمی تواند برای مدت طولانی باشد زیرا احتمال تمایز خود به خود انها حتی در حضورLIF (Leukemia Inhibitory Factor) به عنوان عامل ممانعت کننده تمایز زیاد است.در تمامی موارد تقسیم سلول های تغذیه کننده را قبل از هم کشتی با سلول های بنیادی جنینی متوقف می کنند. ممانعت از تقسیم سلول های تغذیه کننده به دو روش تابش اشعه گاما و یا استفاده از مایتومایسین C   انجام می شود. مایتومایسینC  بین دو رشته DNAقرارمی گیرد و از جدا شدن انها برای تقسیم ممانعت می کند. سلول های رایج تغذیه کننده فیبروبلاست های جنینی موش هستند. البته ازدودمان STO که یک رده نامیرا از فیبروبلاست موشی هستند نیز استفاده می شوند. سلول های دیگر مانند سلول های کارسینومای مثانه انسانی 5637 و یا رده نا میرای تخمدان هامستر چینی (CHO) نیز گاهی در مراحل اولیه تولید سلول های بنیادی جنینی بکار می روند.
3) با تکثیر ICM بر سلول های تغذیه کننده و پاساژ انها بعد ازگذشت چند روز بر روی سلول های تغذیه کننده کلونی یا کلونی هایی ظاهر می شود. در این هنگام باید انها را از کف ظرف همراه با سلول های تغذیه کننده جدا کرد و پس از تفکیک سلول ها از یکدیگردوباره ان را کشت داد.
4)حصول سلول های بنیادی جنینی : با پاساز کلونی ها به صورت تک سلولی بر سلول های تغذیه کننده جدید بعد از دو یا سه روز کلونی های بزرگتری تشکیل می شود. از این به بعد هر دو یا سه روز یک بار انها را پاساژ داد. نکته جالب آن است که می توان آنها را به مدت طولانی کشت داد یا برای سالها منجمد نگاه داشت و در شرایط مطلوب حالت غیر تمایزی و کاریوتیپ طبیعی خود را برای سالها حفظ می کنند.
حفظ سلول های بنیادی جنینی در حالت نامتمایز :
همان طور که گفته شد یک سلول بنیادی واقعی قابلیت حفظ نوسازی خود یا به عبارتی توانایی ایستایی در حالت غیر تمایزی را به طور نامحدود دارد. حالت غیر تمایزی سلول های بنیادی جنینی با نشانگرهای سلولی خاص نشان داده می شود این نشانگرها به دانشمندان کمک می کند تا درک بهتری از تکثیر نامحدود سلول های بنیادی جنینی در شرایط مطلوب کشت داده شده باشند. تا کنون دو مسیر اصلی تحقیق شواهدی را نشان داده که یک مسیر شامل کوشش های است که تکثیر فاکتورهای ترشحی نظیر فاکتورهای ترشحی نظیر فاکتور ممانعت کننده لوکمیایی(LIF) بر سلول های بنیادی جنینی موش در محیط آزمایشگاهی را بررسی می کند و مسیر دوم تحقیق فاکتورهای نسخه برداری نظیر Oct-4 را در بر می گیرد.
فاکتور ممانعت کننده لوکومیایی  (LIF)سایتوکاین منعلق به خانواده IL-6 است که برای اولین بار با تاثیر بر القای تمایز سلول های لوکومیایی MI شناخته شد. اما در سال 1988اثر ممانعت کنندگی آن بر سلول های بنیادی جنینی موشی شناخته شد. افزودن LIF بر تولید و حفظ سلول های بنیادی جنینی در حضور سرم جنینی گاوی بدون نیاز به سلول های تغذیه کننده کافی است. این موضوع نشان می دهد که این فاکتور یک فاکتور خارجی منحصر به فرد برای نوسازی دایم سلول های بنیادی جنینی است. عملکرد LIF تنها برای جلوگیری از تمایز سلول های بنیادی جنینی است و عمل تکثیر سلول های بنیادی جنینی است مستقل ازLIF است. جالب ان است که LIF در سلول های لوکمیایی القا کننده تمایز است ولی بر سلول های بنیادی جنینی موش اثر ممانعت کنندگی از تمایز دارد. به همین دلیل به آن فاکتور ممانعت کننده  تمایز (DIF) نیز می گویند. این فاکتور از طریق گیرنده خود به نام stat  3 عمل می کند.
Oct-4 پروتئینی که توسط سلول های بنیادی جنینی انسانی و موشی در محیط آزمایشگاهی بیان می شود. این فاکتور توسط سلول های ICM موشی درin vivo نیز بیان می گردد. Oct-4 در سلول تخم موش وجود دارد و درسراسر بلاستوسیست تا ظهور  ICMوحفظ پرتوانی ICM و اپی بلاست وجود دارد. همچنین Oct-4 در سلول های زاینده موش و سلول های زاینده بالغ وجود دارد. سلول های بنیادی جنینی موشی می توانند به طور نامحدود در محیط آزمایشگاهی همانندسازی کنند و10-1 میلیارد را بدون تمایز به وجود آورند. در محیط آزمایشگاهی سلول های بنیادی جنینی موشی و انسانی Oct-4 را بیان می کنند.
برای حفظ پرتوانی سلول های بنیادی جنینی بیان Oct-4 لازم است. به طوری که اگر از بیان Oct-4جلوگیری نماییم. سلول های نیادی جنینی به تروفواکتودرم تمایز می یابد. اگر بیانOct-4  را به طور مصنوعی زیاد کنیم سلول های بنیادی جنینی موش به اندودرم و مزودرم ابتدایی تمایز می یابند. بنابراین مقدار بیان Oct-4 وضعیت برنامه تکوینی سلول های بنیادی جنینی موش را نشان می دهد. و ان را به عنوان کاندیدای تنظیم کننده اصلی پر توانی سول های نیادی جنینی معرفی می کند.
این که چگونه و چرا فاکتور نسخه برداری Oct-4 چنین نقش مهمی را در جنین زایی ایفا می کند به ژن های تحت کنترل ان بستگی دارد. تا کنون مشخص شده 7تا 8 ژن تحت کنترل Oct-4 هستند. به طوری که Oct-4  بعضی از انها را فعال کرده ویا از فعالیت بعضی دیگر ممانعت می کند. در کل ممکن است Oct-4  سبب ممانعت از عمل ژن هایی شود که برای تمایز لازم هستند.
تا کنون معتقد بودند که موضوع پرتوانی سلول های بنیادی جنینی به چهار بازیگر مهم یعنی  Stat3,Sox2,OCT-4,FoxD3  برمیگردد. اما اجرای کنسرت مزبور با هیچکدام از عوامل ذکر شده به تنهایی شروع نمی شود چرا که ضاهرا به بازیگران دیگری نیاز است. Oct-4  برای تنظیم سرنوشت سلولی در جنین ابتدایی و در توده سلولی داخلی بیان می شود و بیان ان در تروفوبلاست کاهش می یابد.  Sox2وFoxD3 دیرتر در جنین بیان می شوند و در حفظ اپی بلاست بعد از لانه گزینی ضروری هستند. در سلول های بنیادی جنینی،Stat3 با سیتوکین LIF فعال می شود  و این فرایند برای حفظ نوزایی انها ضروری است. اما برای تکوین طبیعی موش به LIF نیازی نیست. تا به امروز دو فاکتور رونویسی Stat3 وOct-4 شناخته شده اند که در نوزایی سلول های بنیادی جنینی شرکت دارند. اما اخیرا یک فاکتور رونویسی همئوباکس شناخته شده که در سلول های داخلی مورولا و بلاستوسیست سلول های بنیادی جنینی و سلول های زاینده جنینی مشتق از انها بیان می شود. نام این فاکتور Nanog است که به معنی سرزمین همیشه جوان می باشد. این فاکتور در دومین رخداد تخصصی شدن (specification) سلول های جنینی نقش حیاتی دارد. Oct-4در این مرحله و قبل از ان ایفا نقش می کند. فنوتیپ جنین های فاقد  Oct-4 وNanog   نشان داده است که هویت سلول های بنیادی جنینی به فعال نگه داشتن سیستم تنظیم کننده سلول بنیادی و خاموش کردن سیستم تمایز بستگی دارد.
شناسایی  Nanog دیدگاه جدیدی را در کشت سلول های بنیادی جنینی مطرح کرد به طور که تا کنون معتقد بودند که حفظ نوزایی سلول های بنیادی جنینی به همکاری Stat3 فعال شده (از طریق LIF ) و تجلی Oct-4 نیازدارد. اما نشان داده شده است که بیان زیادی Nanog (overexpression) خود نوزایی سلول های بنیادی جنینی را از وابستگی به تحریک LIF/Stat3 خلاص می کند. به عبارتی در این شرایط باز هم سلول ها به نوزایی خود ادامه می دهند. علاوه بر این با بیان زیادی Nanog قابلیت تمایز سلول های بنیادی جنینی کاهش می یابد و به تاخیر می افتد. اما حذف بیان زیادی Nanog سبب برگشت سلول ها به حالت بنیادی اولیه می شود. از سوی دیگر حذف Nanog سبب اغاز تمایز سلول های بنیادی جنینی به اندودرم احشایی می گردد واین نشان دهنده نقش ان در دومین رخداد تمایز جنینی است. این نتیجه همراه با این مشاهده که LIF  وNanog اثر افزاینده بر خودنوزایی سلول های بنیادی جنینی دارند پیشنهاد می کند که این دو عامل دو خزانه هدف ژنی متفاوت را کنترل می کنند که  تا اندازه ای بر هم پوشانی دارند.
کمبرز و همکاران گزارش کردند کهNanog  در سلسله مراتب رونویسی مداخله کننده در هویت سلول های بنیادی و حفظ پر توانی انها شرکت دارد. به طوری که بیان زیادی Nanog بر خودنوزایی سلول های بنیادی از طریق فعال کردن Stat3 عمل نمی کند و بر عکس ان فعال کردن Stat3 بر بیان Nanog اثر ندارد. علاوه بر این Nanog  و Oct-4  به صورت کنسرت در حفظ پرتوانی و نوزایی سلول های بنیادی جنینی عمل می کنند. به طوری که ایشان مشاهده نمودند اولا:  Nanogدر جنین هایی که از نظر Oct-4 معیوب هستند بیان می شود ثانیا: بیان زیادی Nanog نمی تواند برنامه تمایزی سلول های بنیادی جنینی را که با کاهش (downregulation) Oct-4 شروع شده است را برگرداند. بنابراین  Nanog,Stat3 و Oct-4  با سه مسیر رونویسی متفاوت در سلول های بنیادی جنینی عمل می کند.
به نظر می رسد چرخه سلولی بنیادی جنینی در ممانعت از تمایز ان دخیل است. از مطالعه انواع مسیرهای پیام رسانی مشخص می شود که فاکتورهای بسیاری باید در تعادل با هم باشند تا سلول های بنیادی جنینی در حالت نوسازی باقی بمانند. اگر در این حالت تغییری به وجود اید سلول های بنیادی جنینی تمایز می یابند.