معماری

شناسایی موتاسیون‌های BRAF V600E و متیلاسیون پروموتر MLH1 در سرطان کولورکتال

برای تمایز سرطان‌های پراکنده کولورکتال با ناپایداری میکروستلایت (ضایعه مختصری که در نزدیکی ضایعه اصلی وجود دارد)، از اشکال وراثتی سرطان‌های کولورکتال (سندرم لینچ/سرطان وراثتی کولورکتال بدون پولیپوز {HNPCC})

 

نکات برجسته تست

  • شناسایی وجود موتاسیون BRAF V600E در تومورهای کولورکتال
  • شناسایی متیلاسیون در ژن MLH1
  • کمک به تصمیم گیری درباره اینکه آیا بررسی‌ها بیشتر برای سندرم لینچ نیاز است یا خیر

 

پیشینه بالینی

  • ناپایداری میکروستلایت می‌تواند شاخصی برای سندرم لینچ باشد؛ با این حال، این مورد در تومورهای اسپورادیک یا پراکنده نیز دیده می‌شود.
  • BRAF، ژن رمز کننده کیناز در مسیر بیولوژیک RAS/RAF/MAPK است. مطالعات نشان داده‌اند که وجود موتاسیون BRAF V600E در توموری با ناپایداری میکروستلایت بیانگر این موضوع است که تومور احتمالاً پراکنده است و با سندرم لینچ در ارتباط نیست.
  • متیلاسیون پروموتر MLH1 نیز مشخص می‌کند که تومور دارای ناپایداری میکروستلایت، احتمالاً پراکنده بوده و با سندرم لینچ مرتبط نیست.

 

موارد درخواست تست

  • زمانی که به وسیله رنگ آمیزی ایمونولوژیکی مشخص می‌شود که نمونه بافتی تومور کولورکتال MLH1 ندارد، و یا ناپایداری میکروستلایت با روش PCR مشخص می‌گردد، آنالیز موتاسیون BRAF V600E و آنالیز متیلاسیون MLH1 باید انجام شود. سپس نتایج تست می‌تواند برای تعیین اینکه آیا بررسی بیشتر برای تشخیص سندرم لینچ مورد نیاز است یا خیر، مورد استفاده قرار گیرد.
  • نمونه بافتی توموری که برای آنالیز موتاسیون ژن BRAF مورد استفاده قرار می‌گیرد، در صورتی که فاقد موتاسیون BRAF V600E باشد، به صورت خودکار به آنالیز متیلاسیون MLH1 منعکس می‌شود.

 

تفسیر آزمایش

  • اگر موتاسیون BRAF V600E یا متیلاسیون پروموتر MLH1 در یک نمونه بافتی تومور یافت شود که نشان دهنده ناپایداری میکروستلایت است، بنابراین احتمالاً تومور پراکنده بوده و انجام بررسی‌های بیشتر برای تشخیص سندرم لینچ منطقی نیست.
  • در صورتی که نه موتاسیون BRAF V600E و نه متیلاسیون MLH1 یافت شود، تومور به احتمال بیشتر اسپورادیک نبوده و بررسی‌های بیشتر برای شناسایی سندرم لینچ باید صورت پذیرد. از آنجا که گزارشات بسیار نادری از موتاسیون BRAF V600E یا متیلاسیون MLH1 در تومورهای مرتبط با سندرم لینچ وجود دارد، تمامی نتایج باید در زمینه سابقه بالینی بیمار مورد تفسیر قرار گیرند.

 

محدودیت‌های تست

  • موتاسیون‌هایی غیر از آنهایی که درون کدون 600 ژن BRAF قرار دارند، قابل شناسایی نیستند.
  • موتاسیون‌های بیشتر درون پرایمر یا نواحی جایگاه پروب می‌تواند این تست را تحت تأثیر قرار دهد.
  • وجود کمتر از 10% آلل جهش یافته قابل شناسایی نیست. متیلاسیون در جایگاه‌هایی غیر از آنهایی توسط پرایمرها و پروب‌ها پوشانده می‌شوند، قابل شناسایی نیست.
  • سطوح متیلاسیون کمتر از 10% گزارش نشده است.
  • نتایج این تست‌ها همیشه باید در ارتباط با پیشینه بالینی بیمار و با استفاده از دیگر داده‌های مرتبط تفسیر شوند و نباید به تنهایی برای تشخیص بدخیمی مورد استفاده قرار گیرند.
  • این تست برای شناسایی حداقل باقیمانده بیماری (MRD) کاربرد ندارد.
  • این تست برای تومورها با رنگ آمیزی ایمونولوژیکی MLH1 دست نخورده و کامل، کاربرد ندارد.

 

مواد و روش‌ها

  • اسلایدها از قطعات بلوک‌های بافتی فیکس شده با فرمالین و قرار گرفته در پارافین (FFPE) تهیه می‌شوند.
  • DNA از بافت توموری که از قطعه قطعه شدن اسلایدهای آماده شده بدست می‌آید، جدا می‌گردد.
  • اگزون 15 ژن BRAF با استفاده از PCR تکثیر می‌شود که برای تعیین وضعیت موتاسیون، توسط پیروسکانسینگ دنبال می‌شود.
  • اگر نمونه بافتی برای موتاسیون BRAF V600E منفی باشد، سپس برای متیلاسیون MLH1 مورد آزمایش قرار می‌گیرد. DNA با سدیم بی‌سولفیت تیمار می‌شود، و کار بوسیله تکثیر یک قطعه از ناحیه پروموتر MLH1 توسط real-time PCR ویژه متیلاسیون، دنبال می‌گردد. سطح متیلاسیون MLH1 توسط مقایسه با تقویت یک ژن مرجع، محاسبه می‌شود.

 

تست‌های مرتبط

  • سندرم HNPCC/لینچ، ناپایداری میکروستلایت با PCR
  • ترمیم عدم تطابق توسط ایمونوهیستوشیمی
  • شناسایی موتاسیون کدون 600 BRFA بوسیله پیروسکانسینگ

 

رفرانس‌ها

  1. Funkhouser WK Jr, et al. Relevance, pathogenesis, and testing algorithm for mismatch repair-defective colorectal carcinomas: a report of the Association for Molecular Pathology. J Mole Diagn. 2012;14:91–103.
  2. Gudgeon JM, et al. Lynch syndrome screening implementation: business analysis by a healthcare system. Am J Manag Care. 2011; 17:e288–300.
  3. Parsons MT, et al. Correlation of tumour BRAF mutations and MLH1 methylation with germline mismatch repair (MMR) gene mutation status: a literature review assessing utility of tumour features for MMR variant classification. J Med Genet. 2012;49:151–157.