معماری

فلوسایتومتری

فن‌آوروش رايجي كه بيشتر توسط محققين جهت تشخيص سلول‌هاي طبيعي و نئوپلاستيك بر روي لام فيكس شده صورت مي‌گيرد، بر اساس ارزيابي‌هاي سيتولوژيكي و شكل ظاهري (مرفولوژي) آنها مبتني است. متخصصين آسيب‌شناسي علي‌رغم تهيه رنگ‌هاي متنوع جهت رنگ‌آميزي سلول‌هاي مختلف يك بافت، به سهولت و به سرعت قادر به شمارش انواع سلول‌هاي موجود در مقطع بافت مورد مطالعه نيستند و همچنين نمي‌توانند سلول‌هايي را كه داراي منشأ اجدادي گوناگون و يا در مراحل مختلف تمايز هستند، تشخيص دهند. در طي سال‌هاي دهة 60 ميلادي تلاش جمعي از دانشمندان در زمينه‌هاي مختلف منجر به ابداع تكنيك فلوسايتومتري گرديد، كه اين تكنيك در زمينه برطرف نمودن مشكلات فوق از توانايي‌هاي خاصي برخوردار است.

سيتومتري (Cytometry) يا ياخته سنجي به معني تفكيك اجزاء سلولي متعدد در يك نمونه است. دستگاه فلوسايتومتري اجزاء متعدد سلولي را تعيين كرده و هم‌زمان مورد شمارش قرار مي‌دهد. خصلت‌هايي كه توسط فلوسايتومتري قابل اندازه‌گيري هستند، شامل اندازه سلول، پيچيدگي سيتوپلاسمي، محتوي DNA يا RNA سلول و طيف گسترده‌اي از پروتئين‌هاي داخل سلولي و يا متصل به غشاء مي‌باشد.

در روش فلوسايتومتري سلول‌هاي رنگ‌آميزي شده (چه به وسيله منوكلونال آنتي‌بادي متصل به فلورسنت و چه فلوروكروم‌هاي متصل شونده به اجزاء سلولي) در يك جريان سيال قرار گرفته و به صورت تك تك از مقابل پرتوي نوري (ليزر) عبور مي‌كنند و متعاقب آن، نور پراكنده شده و نور فلورسانس جانبي توسط آشكارسازها جمع‌آوري مي‌شوند. اين آشكارسازها، سيگنال‌هاي نوري را به سيگنال‌هاي الكتريكي متناسب با نور جمع‌آوري شده تبديل مي‌كنند. پراكنش نور در زاويه‌هاي مختلف مي‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در اندازه و پيچيدگي دروني از هم متمايز كند، در حالي كه ساطع شدن نور فلورسانس از آنتي‌بادي نشاندار شده با فلورسنت مي‌تواند سلول‌ها را بر اساس تفاوت در آنتي‌ژن‌هاي سطحي و سيتوپلاسمي از هم تفكيك نمايد. بدين ترتيب سلول‌ها بر اساس خصوصياتي نظير حجم، گرانولاسيون و ميزان رنگ پذيري از هم افتراق داده مي‌شوند.

 

در طول ساليان گذشته، ايمونوفنوتايپينگ توسط فلوسايتومتري، کمک بسياری در تشخيص، طبقه بندی و پیگيری بعد از درمان سرطان‌های خون کرده است. امروزه اساس طبقه بندی بدخيمی‌های خون بر پايه خصوصيات طبيعی سلول‌های رده‌های مختلف در مراحل بلوغ می‌باشد. ايمونوفنوتايپينگ توسط فلوسايتومتری روشی سريع و آسان است. اين روش با خصوصيت منحصر به فردی که دارد، سلول‌های مختلف را بر اساس آناليز چند پارامتری تشخيص می‌دهد.

فلوسايتومتري نقش مهمي در زمينه‌هاي مختلف آسيب شناسي، هماتولوژي، ايمني شناسي، بيماري‌هاي عفوني، بررسي پيوند اعضاء، نئوپلازيا و ژنتيك دارد و از طرفي بررسي وقايع چرخة سلولي و نقايص موجود در DNA جهت تشخيص انواع لوكمي‌ها و لنفوم‌ها بوسيلة فلوسيتومتري امكان ‌پذير است. همچنين اين روش در تشخيص بيماري‌ها، تعيين پيش‌آگهي و هم براي ارزيابي درمان بدخيمي‌ها كاربرد دارد. فلوسايتومترهاي كلينيكي معمولاً براي استفادة‌ آزمايشگاه‌هاي كلينيكي تنظيم شده است، اما بعضي از آنها ظرفيت جداسازي (Sorting) انتخابي سلول‌ها را دارا مي‌باشند كه در كارهاي تحقيقاتي مورد استفاده هستند. پيشرفت‌هاي هم‌زمان در وسايل و تجهيزات، توليد آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال، رنگ‌هاي فلورسانس، كامپيوتر و نرم‌افزار، دريچة جديدي جهت استفاده از تكنيك فلوسايتومتري، در آزمايشگاه‌هاي كلينيكي گشوده است.

در فلوسايتومتري مدرن، مجموعه‌اي از فن‌آوري‌هاي گوناگون براي سنجش سلول‌ها و بررسي ساختمان و محتواي دروني آنها بكار گرفته شده است. در اين روش حتي ذرات كوچكتر از 1/0 ميكرومتري قابل تشخيص بوده و آستانه رنگ سنجي آن حدود 1000 مولكول رنگ يا 18-10×1 گرم رنگ به ازاي هر سلول است. بدين مفهوم كه اگر يك گرم رنگ در حجمي به ابعاد m300 × Km 3000 × Km3000 حل شود، دستگاه قادر به تشخيص آن مي‌باشد.

 

كاربردهاي فلوسايتومتري

به طور کلی کاربرد پزشکی فلوسايتومتری را می‌توان در چهار مورد خلاصه کرد:

  • تشخيص و طبقه بندی سرطان‌های خون (توانايی تشخيص دقيق جمعيت‌های سلولی غيرطبيعی همراه با تعيين رده و ميزان بلوغ سلول‌ها)
  • سنجش فاکتورهای بيولوژيکی و حضور بعضی مولکول‌های اختصاصی که در تعيين پيش‌آگهی بيماری نقش دارند.
  • شناسايی آنتی‌ژن‌هايی که به عنوان هدف‌های درمانی استفاده می‌شود. (استفاده از آنتی‌بادی بر عليه آنتی‌ژن‌هاي خاص که سلول بدخيم آن را بيان می‌کند).
  • شناسايی سلول‌های باقی مانده بدخيم در طول درمان که در تعيين پاسخ به درمان و احتمال عود بيماری بسيار مهم هستند.

 

مزاياي سيستم فلوسايتومتري بر ساير روش‌هاي اندازه‌گيري فلوروسانس

1- عيني بودن Objective

2- حساسيت بالا (دستگاه مي‌تواند تا بيش از هزار مولكول فلوئوروكروم را در سلول مشخص كند)

3- سرعت عمل زياد كه بررسي تعداد زيادي سلول را ممكن مي‌سازد (105×1 سلول در هر دقيقه)

4- توانايي تشخيص سلول‌هاي نادر با مشخصات اختصاصي در يك جمعيت هتروژن و ناهمگن

5- توانايي مطالعة سلول‌هاي زندة فيكس نشده

6- توانايي اندازه‌گيري معيارهاي همزمان چندين پارامتر و تطابق چند حساسيت هر سلول معلق در مايع

اصول

تكنولوژي فلوسايتومتري بر اساس خصوصيات فيزيكي و شيميايي سلول‌ها يا ديگر ذرات مي‌باشد، هنگامي كه اين سلول‌ها يا ذرات از مقابل يك سيستم آشكارسازي نوري Photo Detector عبور مي‌كنند، ارزيابي مي‌گردند. از آن جايي كه هر سلول وقتي از جلو سيستم گذر مي‌نمايد، به تنهايي اندازه‌گيري و آناليز مي‌شود و همچنين به سبب اين كه اندازه‌گيري‌هاي متعدد و مختلف در زمان واحد انجام مي‌شود، بنابراين پارامترهاي مختلف چند هزار سلول در طول مدت زماني بسيار كوتاهي محاسبه مي‌گردد. بطور كلي اينكه، دستگاه فلوسايتومتري به نحوي طراحي شده است كه قادر است تعداد زيادي سلول و ذرات بيولوژيكي مانند هسته‌هاي جدا شدة سلولي، كروموزوم‌ها و ميكروارگانيسم‌ها را در محيط مايع با استفاده از اشعة ليزر، آناليز نموده و خواص فيزيكي آنها مانند اندازه نسبي و ميزان گرانوليتي سيتوپلاسم را مشخص نمايد. بايد دانست كه فلوسايتومتري قادر است تعداد ۱ سلول سرطاني در ميان ۱۰۰۰۰ تا ۱۰۰۰۰۰ سلول عادي موجود در نمونة مغز استخوان را شناسايي كند.

در اثر تابش اشعة ليزر به سلول‌ها و برحسب اندازه و ساختمان داخلي آنها، سيگنال‌هاي نوري حاصل مي‌شود كه بوسيلة تقويت‌كننده‌هاي نوري PMT = Photo Multiplier Tube دستگاه به سيگنال الكتريكي تبديل مي‌گردد و پس از آناليز بوسيلة كامپيوتر به شكل نمودار نمايش داده مي‌شود. چنانچه سلول‌ها به وسيلة رنگ‌هاي اختصاصي DNA و RNA، پروتئين، شاخص‌هاي سطح سلول‌ها و اجزاي درون سلولي رنگ‌آميزي شده باشند، در اثر تابش اشعة ليزر، فلوروكروم متصل به آنها تحريك شده و در برگشت به حالت پايدار اوليه، سيگنال‌هاي فلوئورسنت خاص با طول موج جذبي مخصوص خود ايجاد مي‌نمايد. اين سيگنال فوتون نوري، داراي طول موج بالايي بوده و انرژي تابشي دارد كه مختص رنگ‌ آن است. سيگنال‌هاي فوق نيز به سيگنال‌هاي الكتريكي تبديل گرديده و در نتيجه كلية مشخصات سلولي، اعم از گرانوليتي، ساختمان درون سيتوپلاسم و شاخص‌هاي مورد نظر سطحي سلول به طور همزمان بصورت نمودار گزارش مي‌شوند.

 

آماده سازي نمونه

براي انجام هر نوع فلوسايتومتري ابتدا بايد سلول‌ها را آماده كرد، به طوري كه سلول‌ها به صورت تكي درآمده و در محيط مناسبي معلق شده باشند. بعضاً يك مرحله تخليص براي بالا بردن غلظت سلول‌هاي مورد نظر در نمونه ضرورت پيدا مي‌كند. روش‌هاي مختلفي براي تهيه، تخليص و آماده سازي سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزيابي بستگي دارد. پس از تهيه سوسپانسيون مناسب، سلول‌ها بايد با مواد فلورسانس رنگ شوند و يا با آنتي‌بادي‌هاي كونژوگه با فلوروكروم نشاندار شوند. روش نشاندار كردن تحت تأثير فاكتورهاي زيادي مانند ميزان اختصاصي بودن آنتي‌بادي و غلظت آنتي‌ژن در سطح يا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی‌بادی مورد استفاده و بکار بردن كنترل‌هاي مثبت و منفي مناسب در آناليز سلول‌ها قرار مي‌گيرد.

 

تمركز هيدروديناميك Hydrodinamic Focousing

 

خصوصيت اصلي يك سيستم فلوسايتومتري اين است كه اندازه‌گيري‌ها بر روي نمونه‌هاي سلولي كه در دستگاه جريان مي‌يابند، انجام مي‌شود. اگر از يك لوله جهت انتقال نمونه استفاده شود، سلول‌ها نمي‌توانند به طور مكرر به نقطه اندازه‌گيري (محل برخورد ليزر به سلول) بروند. اگر از لوله‌هاي باريك جهت اطمينان از انتقال تكرار پذير سلول‌ها استفاده شود، احتمال دارد با عبور سلول‌هاي بزرگتر مسير بسته شود. براي حل اين مشكل از روش ” تمركز هيدروديناميك Hydrodinamic Focousing” كمك گرفته مي‌شود. در اين روش جريان آرامي از سلول‌ها را به درون جريان حامل سريع (Sheath fluid) وارد مي‌كنند. مايع حامل، سلول‌ها را در مركز لوله متمركز مي‌كند، بنابراين سلول‌ها به طور منظم و در يك مسير مجازي به نقطه اندازه‌گيري منتقل مي‌شوند.

هدف از آماده ‌سازي نمونه، تهية يك سوسپانسيون از پارتيكل‌هاي منفرد است كه به روش خاصي رنگ‌آميزي شده‌اند تا در سيستم، بدون ايجاد اختلال در جريان يكنواخت مايع (سيال) و يا انسداد لوله و منافذ دستگاه عبور كنند. در سيســتم فلوسايتومتري، ســلول‌هاي معلق در مــايع ايزوتونــيك از طريق سيستم حسي با فشار هوا از ظرف حــاوي نمــونه به لولة مخــصوصي منتقل شده و به يك محفظة خاصـي به نام «حفرة جريان» Flow chamber وارد مي‌شوند، مايع پوششي Sheath fluid در حفرة نمونه، يك اثر تمركز هيدروديناميكي ايجاد كرده و نمونه را به داخل جريان مي‌كشاند كه زيادتر بودن سرعت جريان مايع پوششي نسبت به مايع حاوي نمونه، سبب هدايت سلول‌ها به صورت منفرد (تك‌تك) جهت عبور از سوراخ انتهايي مي‌شود تا در نقطة خاصي در مقابل اشعة ليزر قرار بگيرد. سلول از لوله شيشه‌ای با سرعتي حدود ۵ تا ۵۰ متر در ثانيه از ميان منفذي باريك و از مقابل پرتوي يک يا چند منبع نوری که غالباً ليزر است، عبور مي‌كنند. بدين ترتيب امكان جمع‌آوري اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا ۵۰۰۰۰ سلول در هر ثانيه فراهم مي‌شود.

 

فلورسانس

فلوسايتومتري بر خصوصيات پراكنده سازي نور توسط سلول‌ها و نيز بر نشر فلورسانس از آنها استوار است. نشر فلورسانس با استفاده مستقيم از مواد رنگ ‌كننده فلورسنت حاصل مي‌شود (در اين روش كه مستقل از آنتي‌بادي است، غالباً از فلوكروم‌هاي متصل شونده به DNA ، RNA و يا ديگر اجزاي سلولي استفاده مي‌شود) يا تركيبي از رنگ فلورسنت با آنتي‌بادي‌هاي مونوكلونال که تحت نام عمومي كونژوگه مورد استفاده قرار مي‌گيرد. در اين حالت انتخاب محل اتصال به سلول، توسط جزء آنتي‌بادي موجود در كونژوگه صورت مي‌گيرد و اين آنتي‌بادي است كه به صورت كاملاً اختصاصي، آنتي‌ژن هدف را بر روي سلول يا در داخل آن شناسايي كرده و به آن متصل مي‌شود و جزء فلورسنت موجود در كونژوگه ابزاري براي رديابي محل و ميزان آنتي‌بادي‌هاي متصل شده به هدف مي‌باشد.

سيستم نوري

سيستم نوري فلوسايتومتر متشكل از يك يا چند منبع نوري به همراه يك سري از عدسي‌ها، فيلترها و آشكارسازها است. عدسي‌ها و فيلترها جهت انتقال نور منبع به نقطه اندازه‌گيري و نيز براي انتقال نور پراكنده و فلورسانس از نقطه اندازه‌گيري به آشكارسازها به كار مي‌روند.

الف) منبع نور:

انواع مختلفي از منابع نوري براي فلوسايتومتر وجود دارند. در فلوسايتومترهاي مدرن، نور ليزر به عنوان منبع نوري بكار مي‌رود، ليزر نسبت به جيوه يا لامپ‌هاي ديگر مزايايي دارد كه از آن جمله مي‌توان به توليد نور منوكروم (تك ‌رنگ) و با اندازة نقطه‌اي بسيار كوچك آن اشاره كرد، اين اندازة نقطه‌اي بسيار مهم است، زيرا هرچه نور در فضاي كوچك‌تري محدود شود، ميزان تهييج سلول به حد ماكزيمم نزديكتر مي‌شود، علاوه بر اين باعث اطمينان از قرار گرفتن تنها يك سلول در برابر نور در هر لحظه مي‌گردد. بيشترين ليزر مصرفي نيز، ليزر آرگون با طول موج 488 نانومتر مي‌باشد كه با هوا سرد مي‌شود، ارزان‌تر هم بوده و قابل دسترس‌تر است. ليزرهاي ديودي نيز به دليل پايداري و قيمت ارزان مورد استفاده قرار مي‌گيرند و معمولاً طول موج (ششصد و سي و پنج) نانومتر آن مورد استفاده است.

ب) فيلترها:

سيستم نوري فلوسايتومتر، سيگنال‌هاي فلوئورسانس ساطع شده از سلول‌ها را به يك سيستم الكترونيكي هدايت مي‌كند، اين سيستم از يك سري فيلترهاي مخصوص جذب نور و آينه‌هاي Dichoric يا دو رنگ نما تشكيل شده است. فيلترهاي نوري، فقط طول موج خاصي را عبور داده و مانع عبور ساير طول موج‌ها مي‌شوند. فيلترهاي دو رنگ نما، آينه‌هاي انتخابي هستند كه اجازه عبور طول موج‌هاي بلند را مي‌دهند و طول موج‌هاي كوتاه را منعكس مي‌كنند. فيلتر باند عبوري جهت عبور باند باريكي از طول موج بين 640 – 620 نانومتر طراحي شده است. فيلترهاي جذب نور در زاوية 90 o نسبت به مسير تابش اشعة ليزر قرار گرفته‌اند و آينه‌هاي Dichoric نسبت به فيلترها در زاوية 45O قرار دارند. علاوه بر اين دتكتورهاي خاصي به منظور دريافت سيگنال‌هاي حاصل از اندازة سلول و گرانوليتي در اين سيســــــتم وجود دارند كه اصطلاحاً Fs sensor و SS sensor ناميده مي‌شوند. به مجرد عبور يك سلول از مقابل اشعة ليزر، چندين پارامتر فيزيكي و فلوئورسانس آن، بطور همزمان اندازه‌گيري مي‌شود.

ج) آشكارسازها:

با عبور ذرات يا سلول‌ها از مقابل پرتو ليزري، مولكول‌هاي فلورسانس سطح سلول، فوتون‌هايي با طول موج خاص در همه جهات تابش مي‌كنند. سيستم اپتيكي بخشي از اين فوتون‌ها را به آشكارسازها (Detector) مي‌رسانند. فوتوديود‌ها (PD) و فوتومولتي تيوب‌ها (PMT) به خاطر حساسيت بالاي آن‌ها به عنوان آشكارساز استفاده مي‌شوند. ابتدا فوتون‌هاي رسيده از نمونه توسط آشكارسازها به فوتوالكترون تبديل شده و سپس جريان الكتريكي آن به ولتاژ تبديل مي‌شود. به دليل اينكه سيستم الكترونيكي، ولتاژ را اندازه‌گيري و مقايسه مي‌كند، بايد خروجي آشكارساز به ولتاژ تبديل گردد. تبديل جريان به ولتاژ با عبور جريان يا شار الكتريكي از يك مقاومت انجام مي‌گيرد. آن چه اتفاق مي‌افتد بر اساس قانون اهم قابل پيش‌بيني است. ولتاژ توليد شده برابر حاصل ضرب جريان در مقاومت است و چون مقدار مقاومت ثابت است ولتاژ خروجي مستقيماً متناسب با جريان ورودي است. مدار الكترونيكي كه اين تبديل را انجام مي‌دهد،”تقويت كننده Trans-impedence” نام دارد كه مي‌تواند در مدار بخش PMT جاسازي شود. اين مدار جريان فوتو الكترون‌ها را به ولتاژ تبديل كرده و تقويت خطي ولتاژ را فراهم مي‌كند.

پراكنش

اگر چه سلول‌ها به خودي‌ خود داراي فلورسانس اندكي در برخي طول موج‌ها هستند اما بدون بكارگيري نور تهييج كننده (ليزر) هيچ سيگنالي توليد و به ردياب‌هاي دستگاه ارسال نخواهد شد. پس از برخورد نور ليزر به سلول‌ها، بازتاب نور ليزر در جهات مختلف پراکنده شده و توسط ردياب‌هايی که در زوايای مختلف قرار دارند، برای کسب اطلاعات جمع‌آوری می‌شود.

در صورتي كه سلول به صورت يك كرة همگن و يكنواخت باشد، در اثر تابش ليزر، نور تحت زاوية 360o توسط سلول پراكنده و بوسيلة آشكارساز مستقيم Fs sensor كه در زاوية 2-20 o نسبت به محور تابش ليزر قرار دارد، دريافت و اندازه‌گيري مي‌شود، اين نور اصطلاحاً FALS ناميده مي‌شود و مقدار آن رابطة مستقيم با اندازة سلول دارد. به عبارت ديگر نوری که در جهت مستقيم پراکنده می‌شود (Forward ) متناسب با سايز سلول يا ذره است.

مقدار نوري كه تحت زاوية 90 o نسبت به محور تابش ليزر از سلول پراكنده مي‌شود. اصطلاحاً نور SSناميده مي‌شود و مقدار آن بستگي به خصوصيات شكست نور توسط سلول، اجزاي دروني، ميزان گرانوليتي سيتوپلاسم، ساختمان هسته و سطح سلول (ناهمواري غشاء) دارد. براي مثال يك گلبول قرمز رسيده با سيتوپلاسم همگن، بدون هسته و اندامك‌هاي سيتوپلاسمي، نسبت به يك ياخته ائوزينوفيل كه حاوي گرانول‌هاي سيتوپلاسمي زياد و هستة مركب از چند قطعه است، تفرق نوري 90 o بسيار كمتري دارد. سيگنال پراكنش نوري 90o، توسط آشكارساز قائمه دريافت مي‌شود و به سيگنال ديجيتالي تبديل مي‌گردد.

از نظر ميزان نور SS، لنفوسيت‌ها و گرانولوسيت‌ها به ترتيب از كم به زياد قرار دارند. به اين ترتيب موازين FALS و SS مي‌تواند براي مشخص كردن تيپ هر كدام از سلول‌ها بكار رود و رابطة آن بدين شرح است:

گلبول‌هاي قرمز و نخاله‌هاي سلولي > لنفوسيت > منوسيت > گلبول‌هاي سفيد چند هسته‌اي

 

انتشار فلوئورسانس

علاوه بر اين اگر مولکول‌های فلورسنت و يا فلوروکروم‌ها به سلول‌ها متصل شده باشند، توسط نور تابيده تهييج شده و بازتابی حاصل می‌شود که ساير ردياب‌ها و فيلترهای نوری آن را جذب می‌کنند. مولكول‌هاي فلورسنت مي‌توانند متصل شده به آنتي‌بادي‌ها، رنگ‌هاي حساس به Ca++ و متصل شده به اجزاي سلولي، مولكول‌هاي فلورسنتي كه توسط سلول بروز داده مي‌شوند و رنگ‌هاي متصل شونده به DNA باشند. نتيجه دقيق، بررسی چند پارامتری هر ذره يا سلول است و تعداد پارامترهای بررسی شده بستگی به تعداد مولکول‌های فلورسنتی دارد مورد استفاده قرار گرفته است.

آشكارساز فلورسانس، امواج فلورسانس منتشره از برخورد نور ليزر به فلوروكروم‌هاي متصل به سلول را دريافت مي‌كند. اين آشكار‌ساز در زاويه 90o نسبت به منبع نوري يعني روبروي آشكارساز قائمه قرار مي‌گيرد. در صورت مطالعه هم‌زمان چند فلوروكروم كه به اجزاء مختلف سلولي متصل شده‌اند، مي‌توانيم از چندين آشكارساز فلورسانس استفاده كنيم.

بر اساس پارامترهاي تفرق نوري (FALS و SS) مي‌توان gateهاي الكترونيكي (محدوده‌ها) بدور دسته‌جات سلولي مورد نظر براي تجزيه با فلورسنت كشيد، آنگاه فلوئورسانس سلول‌ها در نمونه مي‌تواند بطور انتخابي تعيين شود و بصورت توزيع كثرت ترسيم گردد. كليه اطلاعات توسط يك كامپيوتر كه در يك سيستم گنجانيده شده است، جمع‌آوري، محاسبه و ذخيره مي‌گردد.

غالباً حجم مورد نياز از نمونه موردآزمايش نيز خيلي كم و حدود ۱۰۰ ميكروليتر مي‌باشد. بررسي فلوسايتومتريك هرچه زودتر بايد انجام شود (پس از نمونه‌گيري)، بهرحال نمونه‌ها را مي‌شود براي 24 ساعت در دماي اتاق (مخصوص خون كامل) و يا 4oC (مخصوص سلول‌هاي منونوكلئر جدا شده) نگهداري نمود و سپس ايمونوفنوتايپينگ انجام داد. در هنگامي كه نمونه‌ها براي بيشتر از 24 ساعت نگهداري مي‌شوند، اضافه كردن محيط كشت سلولي، مانند RPMI ضروري است.

فلوروكروم‌ها

براي انجام فلوسايتومتري لازم است كه ابتدا سلول‌ها با فلوروكروم‌ها نشاندار شوند. از طرفي براي نشاندار كردن اجزاء داخلي سلول بايد اقدامات خاصي را انجام داد تا آنها در دسترس آنتي‌بادي يا ماده فلورسنت قرار گيرند. تعداد فلوروكروم‌هاي مورد استفاده براي فلوسايتومتري در طي ساليان متمادي مرتباً افزايش يافته است و اين احتمال وجود دارد كه در آينده، تعداد فلوروكروم‌هاي مورد استفاده براي آناليز سلول‌ها بيش از اين نيز افزايش يابد. شناخت انواع فلوروكروم‌ها و آگاهي از مزيت‌ها و معايب هر كدام تنها راه استفاده بهينه از آنها براي دستيابي به مقاصد علمي تحقيقاتي است. امروزه پرمصرف‌ترين رنگ‌هاي فلوئورسان متصل به آنتي‌بادي‌ها در فلوسايتومتري باليني، فلوئورسين ايزوتيوسيانات (FITC) و فيكواريترين (PE) مي‌باشند. تمامي اين رنگ‌هاي فلوئورسان در محدودة488nm طيف‌هاي جذبي دارند. بنابراين، يك، تك طول موج تحريكي ليزري، مي‌تواند تمامي اين دو رنگ را تحريك كند.

فلوسايتومترهاي اوليه قادر بودند فقط يك يا دو رنگ فلورسانس را تجزيه و تحليل كنند اما امروزه دستگاه‌هايي عرضه شده‌اند كه قادرند چندين رنگ فلورسانس را به طور هم‌زمان رديابي و تجزيه و تحليل كنند. پيشرفت‌هاي همزمان در وسايل، توليد آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال، رنگ‌هاي فلوئورسانس، كامپيوتر و نرم‌افزار، دريچة جديدي جهت استفاده از تكنيك فلوسايتومتري، در آزمايشگاه‌هاي كلينيكي گشوده است.

 

سيستم كامپيوتري

اين سيستم، پالس‌هاي ديجيتال آشكارسازها را دريافت كرده و به آناليز داده‌ها مي‌پردازد. امروزه نرم‌افزارهاي جديدي براي آناليز سريع‌تر داده‌ها در دسترس مي‌باشند. همچنين كنترل قسمت‌هاي مختلف دستگاه فلوسايتومتري بر عهده اين سيستم مي‌باشد.

 

اهميت فلوسايتومتري در بررسي فنوتيپ سلول‌ها

 

آنتي‌ژن‌هاي سلولي كه اصطلاحاً به نام (CD) clusters of Differentiation ناميده مي‌شود، صرفاً شاخص‌هاي شناسائي انواع مختلف سلولي نيستند، بلكه فعاليت‌هاي مهم سلولي را تنظيم مي‌كنند و اكثراً از جنس پروتئين يا گليكوپروتئين هستند، اين مولكول‌ها به عنوان گيرنده‌هاي فاكتورهاي اصلي رشد، سيتوكين‌ها و پروتئين‌هاي سرمي عمل مي‌كنند و يا به عنوان آنزيم‌هاي غشائي فعاليت نموده و اتصال سلول‌ها را به ساير سلول‌ها و اجزاء ماتريكس خارج سلولي ميسر مي‌نمايند، اين شاخص‌هاي شناسائي به وسيلة متدهاي فلوسايتومتري به راحتي قابل تشخيص و ارزيابي مي‌باشند. بررسي شاخص‌ها جهت افتراق جمعيت‌هاي سلولي خاص نيز بكار مي‌رود و مي‌توان بدين طريق با توجه به اين شاخص‌هاي آنتي‌ژني، سلول‌ها را از يكديگر تفكيك كرد. همچنين امروزه با تكنيك فلوسايتومتري FACS Fluorescence Activated Cell Sorterعلاوه بر خصوصيات سلول‌ها، مي‌توان سلول‌ها را از يكديگر تفكيك نموده و در لوله‌هاي جمع ‌كننده مخصوص هر نوع سلول جمع‌آوري نمود و بر روي آنها تحقيقات انجام داد.

سلول‌ها از اجزاء مختلفي مثل غشاء سيتوپلاسمي، غشاء هسته‌اي، هسته و سيتوپلاسم تشكيل مي‌شوند و تقريباً همه مولكول‌هاي موجود در قسمت‌هاي مختلف سلول را مي‌توان با استفاده از فلوسايتومتري رديابي و تعيين مقدار نمود. معمولاً مولكول‌هاي سطحي موجود در غشاء سيتوپلاسمي به راحتي در دسترس آنتي‌بادي قرار مي‌گيرند ولي براي رسيدن آنتي‌بادي يا ماده فلورسانس به مولكول‌هاي دروني سلول روش‌هاي مطمئن و مؤثري لازم است. هر سلولي بر حسب نوع و تخصصي كه به عهده دارد مولكول‌هاي مختص به خود را بيان مي‌كند؛ بدين معني كه همة ژن‌ها در همه سلول‌ها بيان نمي‌شوند بلكه برحسب وظيفه‌اي كه در طي تمايز بر عهده سلول گذاشته شده است و بر حسب محيطي كه در آن قرار مي‌گيرد هر سلولي خود انتخاب مي‌كند كه در پاسخ به شرايط محيطي كدام ژن را فعال سازد. بنابر اين رديابي پروتئين‌هاي سلولي حاصل از بيان ژن‌ها هم در سطح و هم در درون سلول مي‌تواند وسيله‌اي بسيار مفيد براي شناسايي سلول باشد. مولكول‌هاي سطحي سلول‌ها تحت نام عمومي CD كه مخفف Cluster Differentiation مي‌باشد شناخته مي‌شوند و براي رديابي آن‌ها از آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال كونژوگه با فلوروكروم استفاده مي‌شود. مثلاً ماركرهاي سطحي سلول‌هاي NK عبارتند از CD16و CD56 كه آنتي‌بادي‌هايي با همين نام قادرند اين مولكول‌ها را در سطح سلول شناسايي نمايند. اغلب لفظ آنتي‌بادي در گفتار يا نوشتار حذف مي‌شود مثلاً كونژوگهCD16 همان آنتي‌بادي شناسايي كننده CD16 مي‌باشد كه متصل به فلوروكـــــروم است، يا كونــــــــــــــژوگه CD34 اشاره به آنتي‌بادي شناسايي كنندة CD34دارد كه با فلوروكروم مناسبي كونژوگه شده است، ماركر اختصاصي سلول‌هاي ريشه‌اي تمايز نيافته مغز استخوان مي‌باشد.

 

جداسازي سلولي

بيشترين مورد استفاده از فلوسايتومتری، ارزيابي آنتی‌ژن‌هاي سطحی بيان‌شده بر روی سلول‌ها مي‌باشد، اما علاوه بر آن سلول‌ها ممکن است با روش‌هاي مختلف برای اندازه‌گيری خصوصيات عملکردی بوسيلة فلوسايتومتری مورد بررسی قرار گيرند. مي‌توان تغييرات زماني بيان گيرنده‌ها را تعيين كرد يا بر همكنش يک نوع سلول را با سلول ديگر اندازه‌گيری نمود. بعلاوه، امكان ارزيابي تغييرات در فعاليت آنزيم‌ها و پتانسيل غشايی وجود دارد. همچنين مي‌توان آزمايشاتی برای نشان دادن فاگوسيتوز و آزادسازی مولکول‌های فعال زيستي انجام داد.

روش جداسازي سلول‌ها با استفاده از خصوصيات فلورسانس آنها توسط ايمونولوژيست‌هايي ابداع شد كه تلاش مي‌كردند جمعيت‌هاي خالص سلول‌ها را از نمونه‌هاي مختلط تهيه كرده و پس از تكثير آنها در محيط كشت سلولي، نقش مجزاي هر سلول را در سيستم ايمني بررسي نمايند. جداسازهاي جرياني وسايلي ضروري و پرطرفدار در علوم بيولوژيكي و علوم ديگر هستند. كارآيي اصلي اين جداسازها، چنانچه از نامشان برمي‌آيد، جدا كردن جمعيت‌هاي سلولي دلخواه از ميان جمعيتي هتروژن از سلول‌ها براي مطالعة بيشتر مي‌باشد. بطور كلي اگر سلول يا ذره‌اي داراي خصوصيات منحصر به فردي از نظر فيزيكي يا شيميايي باشد با استفاده از آن خصوصيات مي‌توان براحتي آن را شناسايي كرده و از ديگر سلول‌هاي همراه جدا كرد.

با استفادة هم‌‌زمان از دو روش آناليز سلولي و جداساز سلولي Cell Sorter امكان مطالعة بيشتر و كشت سلول‌هاي كاملاً شناخته شده از نظر فنوتايپي يا رفتاري فراهم مي‌گردد. در حضور يون‌هاي کلسيم خصوصيات طيفی برخي از رنگ‌های فلورسنت تغيير می‌يابد. از اين رنگ‌ها براي اندازه‌گيري تغييرات غلظت كلسيم اجزاء سلولي در هنگامي ‌که سلول‌ها بوسيله انواع محرک‌ها تحريک می‌شوند استفاده مي‌شود.

كنترل كيفي

داشتن برنامه‌هاي كنترل‌ كيفي براي روش‌ها و تجهيزات در هر نوع فلوسايتومتري ضروري بوده و يك نياز اساسي محسوب مي‌گردد. اين برنامه‌ها براي اطمينان از كيفيت نتايج بدست آمده به كار برده مي‌شوند. همچنين برنامه‌هاي كنترل كيفي بايستي مرتباً و در حد كفايت انجام شوند تا تشخيص نقاط اشكال به آساني ممكن گردد. بدين منظور، برنامة كنترل كيفي در هر دو زمينة كنترل كيفي داخلي و روش‌هاي ارزيابي كيفي خارجي، بايد به اجرا گذاشته شوند.

در فلوسايتومتري طي دو مرحلة جمع‌آوري اطلاعات و مرحلة آناليز اطلاعات امكان خطا وجود دارد كه با بكارگيري روش صحيح تهية نمونه سلولي و تنظيم دقيق دستگاه مي‌توان از خطاهاي مربوط به مرحلة جمع‌آوري اطلاعات جلوگيري كرد اما توانايي اپراتور در طراحي صحيح آزمايش، تنها جنبه‌اي از كسب اطلاعات است كه براي آن روش‌هاي كنترل خطا وجود ندارد. بدين معني كه انتخاب آنتي‌بادي مناسب و انتخاب فلوروكروم متناسب با غلظت و موقعيت آنتي‌ژن نيازمند تجربيات و اطلاعاتي است كه بايد توسط محقق كسب شوند.

روش فلوسايتومتري در ساية افزايش روز افزون تعداد آنتي‌بادي‌ها، تترامرها و رنگ‌هاي توليد شده براي استفاده در ارزيابي فعاليت سلول‌ها به عنوان يك ابزار مهم در مطالعة سلول‌هاي سيستم ايمني در آمده است. فلوسايتومتري چند رنگي اين امكان را فراهم آورده است كه انواع سلول‌هاي موجود در نمونة خون يا سلول‌هاي كشت شده به تفكيك مورد ارزيابي قرار گيرند. سلول‌هاي تحت مطالعه با استفاده از آنتي‌بادي‌هاي اختصاصي معرف زيرگروه‌هاي سلولي، شناسايي مي‌شوند و خصوصيات رفتاري آنها نيز با استفاده ازآنتي‌بادي‌هاي اختصاصي (مثلاً ضد سايتوكين) و يا رنگ‌هاي ارزيابي كنندة حيات سلولي تعيين مي‌شوند.

 

علی اصغر صفری فرد، کارشناس ارشد خون شناسی و بانک خون

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی