معماری

مقاومت‌های دارویی در مایکوباکتریوم‌ها و ژن‌های مرتبط با آن

بیماری سل یکی از مهم‌ترین عوامل اصلی مرگ و میر در دنیای امروز است. امروزه سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به دارو (DR-TB) و یا مقاوم به چندین دارو (MDR-TB) به علت ناکافی بودن برنامه‌های کنترل سل و استفاده نامنظم از داروهای ضد سلی در حال افزایش است، لذا تشخیص سریع مقاومت دارویی برای جلوگیری از انتشار باکتری‌های مقاوم به دارو یک راهکار مهم در کنترل بیماری می‌باشد. مقاومت چند دارویی که به صورت مقاومت همزمان به حداقل دو داروی ایزونیازید و ریفامپین تعریف می‌شود در بسیاری از کشورها به بیش از ده درصد می‌رسد و به نظر می‌رسد امروزه خیلی بیشتر از آنچه در گذشته نشان داده شده بود گسترش پیدا کرده است. مکانیسم‌های مقاومت دارویی در مایکوباکتریوم‌ها اساس و پایه کروموزومی دارد و اغلب ناشی از جهش‌هایی است که در ژنوم باکتری رخ می‌دهد. این مقاومت می‌تواند به نسل‌های بعدی باکتری منتقل شود و درمان را دچار اختلال کند. هدف این مقاله مروری بر مکانیسم مقاومت در برابر داروهای ضد سلی و ژن‌های مرتبط با این نوع مقاومت‌ها از دیدگاه مولکولی است.

کلمات کلیدی: داروهای ضد سلی، مقاومت، سل، ژن، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس

 

پیشگفتار:

سالیانه سل موجب مرگ حدود 2 میلیون نفر در دنیا می‌شود و اکثر این موارد در کشورهای در حال توسعه یا عقب مانده اتفاق می افتد. سازمان جهانی بهداشت تخمین زده است که بین سال‌های 2000 و 2020 نزدیک به یک بیلیون فرد دیگر به سل آلوده خواهند شد و از این میان 200 میلیون نفر به بیماری مبتلا شده و 35 میلیون نفر نیز بر اثر بیماری سل جان خود را از دست خواهند داد. علی‌رغم پیشرفت‌هایی که در درمان و مهار بیماری سل حاصل شده، هنوز هم این بیماری به عنوان یکی از مشکلات عمده بهداشتی مخصوصاً در کشورهای در حال توسعه باقی است. امروزه سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به دارو (DR-TB) و یا مقاوم به چندین دارو (MDR-TB) به علت ناکافی بودن برنامه‌های کنترل سل و استفاده نامنظم از داروهای ضد سلی در حال افزایش است. ایران یکی از کشور‌هایی است که میزان ابتلا به سل در آن بالاست. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که ایران یکی از مناطق اندمیک انواع جدا شده‌های مقاوم به دارو نیز هست.

فهرست کلی ژن‌هایی که موتاسیون در آنها باعث مقاومت به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس خواهند شد شامل موارد زیر است:

1) سیکوسرین: alrA

2) فلوروکینولون: par + gyrA

3) ماکرولیدها: RNA ریبوزومی 23s

4) ریفامپین: rpoB

5) استرپتومایسین: (rrs) RNA ریبوزومی 16s + (rpsl) s12

6) اتامبوتول: embR ,embA ,embB

7) ایزونیازید: KatG ,furA ,inhA ,KasA ,Rvo340 ,iniB ,iniA

iniC, efpA,ndh, OxyR, ahPC intergenic regioh mab – inhA promoter.

 

از این بین ما به بررسی ژن‌های rpoB؛ مارکر مقاومت به ریفامپین، embB؛ مارکر مقاومت به اتامبوتول و KatG؛ مارکر مقاومت به ایزونیازید که در بین مسلولین ایرانی شایع‌ترند، خواهیم پرداخت.

 

ریفامپین:

مقاومت چند دارویی که به صورت مقاومت همزمان به حداقل دو داروی ایزونیازید و ریفامپین تعریف می‌شود، در بسیاری از کشورها به بیش از ده درصد رسيده و به نظر می‌رسد امروزه خیلی بیشتر از آنچه در گذشته نشان داده شده بود گسترش پیدا کرده است. ریفامپین به عنوان داروی ضد سل در سال 1972 معرفی شد و از آن موقع به عنوان یک جزء کلیدی در درمان چند دارویی ضد سل مطرح است. ریفامپین یک داروی باکتریسیدال است و به ساب یونیت β آنزیمRNA پليمراز وابسته به DNA متصل می‌شود و مانع شروع رونویسی می‌گردد. استفاده گسترده از ریفامپین و سایر مشتقات ریفامایسین موجب ظهور مقاومت به ریفامپین گردیده است. در مطالعات متعدد نشان داده شده است که موتاسیون در ژن rpoBکه کد کننده ساب یونیت β آنزیم RAN پلیمراز است، بطور مشخص در ارتباط با فنوتایپ‌های مرتبط با ریفامپین می‌باشد. بیش از 70 نوع موتاسیون متفاوت در ژنrpoB برای نمونه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به ریفامپین از سراسر جهان گزارش شده است. موتاسیون‌ها در ژن rpoB بیشتر در یک ناحیهbp 81 به نام ناحیه تعیین کننده مقاومت به ریفامپین(RIF resstance determining region) یا RRDR صورت می‌گیرد. از آنجایی که که تا 90 درصد نمونه‌های مقاوم به ریفامپین دارای موتاسیون در کدون‌های 531 و 526 و 516 ناحیه RRDR هستند، این ناحیه برای تشخیص سریع نمونه‌های مقاوم به ریفامپین استفاده می‌شود، اگر چه نشان داده شده است که آنالیز مولکولی ژن rpoB در بیش از 90 درصد نژادهای مقاوم به به ریفامپین از نواحی جغرافیایی مختلف برای تشخیص مقاومت به ریفامپین مفید بوده است، اما اطلاعات کمی از ناحیه آسیای خاور میانه در دست است.

 

اتامبوتول:

از داروهای خط اول در درمان بیماری سل اتامبوتول می‌باشد که در ترکیب با دیگر داروها به کار می‌رود. اتامبوتول با آنزیم‌های آرابینوزیل ترانسفرازهای دیواره سلولی مایکوباکتری‌ها واکنش داده و از سنتز آرابینوگالاکتان که برای ساختن دیواره سلولی لازم است جلوگیری می‌کند و منجر به تجمع اسید مایکولیک می‌گردد که موجب مرگ سلول می‌شود.

اپران embcAB، مایکوباکتری‌های آرابینوزیل ترانسفرازها را کد می‌کند. موتاسیون در embB می‌تواند منجر بـــــه ایجاد مقاومت به اتامبوتول در مایکوباکتریوم توبوکلوزیس گردد. 90 درصد از موتاسیون در کدون ATG-met 306 رخ می‌دهد. موتاسیون منجر به جایگزینی اسید آمینه دیگر به جای متيونین می‌شود. اتامبوتول از داروهای با ارزش در درمان بیماری سل می‌باشد، ولی امکان ایجاد مقاومت به اتامبوتول وجود دارد.

از طرف دیگر مایکوباکتر مکانیسم‌های مختلفی را برای فرار از کشته شدن توسط دارو به کار می‌گیرد. یکی از این مکانیسم‌ها ایجاد موتاسیون در ژن‌هایی است که پروتئین هدف دارو را کد می‌کنند. ژن embB ژنی است که آرابینوزیل ترانسفراز را کد می‌کند که پروتئین هدف اتامبوتول می‌باشد. ایجاد موتاسیون در embB موجب مقاومت به اتامبوتول می‌گردد. در بیشتر موتاسیون‌ها در ژن 306 embBرخ می‌دهد. تعداد سویه‌های مقاوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به یک یا چند داروی خط اول در حال افزایش است و روش استانداردی برای درمان توبرکلوزیس مقاوم به چند دارو(MDR-TB) وجود ندارد و عفونت با این سویه‌ها خصوصاً در افرادی که دچار سوء تغذیه و یا آلوده به HIV هستند، منجر به مرگ می‌گردد، لذا شیوع MDR-TB یک خطر جدی برای کنترل سل در سرتاسر جهان می‌باشد و موجب افزایش سل در دنیا می‌گردد. روش مولکولی (MAS-PCR) برای تعیین مقاومت به داروی اتامبوتول و مقایسه آن با روش proportion استفاده می‌گردد که موتاسیون در باز اول و سوم emb B 306 را مورد بررسی قرار می‌دهد (شکل شماره 1) تا از این طریق بتوان مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به اتامبوتول را سریع‌تر شناسایی نمود و انتقال سویه‌های مقاوم را به حداقل ممکن رسانید.

 

شکل شماره 1: نمایی از تکثیر قطعه از ژن emb B در روش MAS-PCR

 

 

مزایای روش MASPCR برای تشخیص مقاومت به اتامبوتول:

  1. آزمایش سریعی است و مستقیماً بر روی نمونه‌های کلینيکی بدون جداسازی ارگانیسم قابل انجام است.
  2. این روش ژنوتیپ سویه‌ها را مورد بررسی قرار می‌دهد، در حالی که روش proportion فنوتیپ یا بیان ژنوتیپ را مورد ارزیابی قرار می‌دهد که تحت تأثیر شرایط آزمایشگاهی می‌باشد.
  3. خطر MAS-PCR در مقایسه با proportion کمتر است.
  4. با روش MAS-PCR همچنین شناسایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نیز صورت می‌گیرد.

 

معايب روش MASPCR براي تشخيص مقاومت به اتامبوتول:

  1. مقاومت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به اتامبوتول ممکن است از طریق مکانیسم‌های دیگر رخ داده باشد.
  2. موتاسیون در embB306 در برخی از سویه‌های حساس به اتامبوتول وجود دارد.
  3. ممکن است موتاسیون در embB306 وجود داشته باشد ولی موجب مقاومت به اتامبوتول نشود.
  4. نتایج مثبت کاذب به سبب آلودگی نمونه‌ها با اسید نوکلئیک خارجی رخ دهد.

 

ایزونیازید:

علی‌رغم پیشرفت‌هایی که در درمان و مهار بیماری سل حاصل شده، هنوز هم این بیماری به عنوان یکی از مشکلات عمده بهداشتی مخصوصاً در کشورهای در حال توسعه باقی است. در حال حاضر ایزونیازید و ریفامپین در کنار هم شالوده‌ی درمان شیمیایی کوتاه مدت عفونت‌های مایکوباکتریوم توبرکولوزیس را تشکیل می‌دهند. مشاهدات حاکی از آن است که باسیل‌های سل در مجاورت با ایزونیازید خاصیت مقاومت به رنگبری با اسید را از دست داده و از بین می‌روند. بدین ترتیب محققین حدس می‌زنند که این دارو باعث تغییر در ترکیب لیپیدی دیواره سلولی شود. تشخیص مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و نیز تعیین الگوی حساسیت دارویی آن ارزش فراوانی در بکارگیری روش‌های درمان مؤثر و نیز کنترل جهانی سل دارد. ظهور سویه‌های مقاوم دارویی مایکوباکتریوم توبرکولوزیس، مانع بزرگی را در مسیر درمان و کنترل بیماری ایجاد نموده است. رویداد سل مقاوم به دارو در نقاط مختلف جغرافیایی یکسان نیست. فراوانی سویه‌های MDR (سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکولوزیس با مقاومت توأم به ایزونیازید و ریفامپین) سالهاست که در حال افزایش است و تاکنون چندین مورد از شیوع آنها گزارش شده است. استونی، ایران، چین، هند و برخی نواحی روسیه بعنوان اندمیک‌ترین نواحی وجود مقاومت دارویی معروف شده است. مطالعات انجام گرفته نشان می‌دهد که نزدیک 5 درصد از باسیل‌های سل کشت داده شده از بیماران ایرانی، MDR هستند. مقاومت دارویی در یک جمعیت باکتریایی بزرگ باسیل سل در پی موتاسیون‌های خودبخودی تک مرحله‌ای و اتفاقی روی می‌دهد. احتمال بروز موتاسیون‌های مرتبط با مقاومت دارویی برای ریفامپین 8-10 است، در حالی که این مقدار در خصوص ایزونیازید و برخی از داروهای مرسوم ضد سلی 6-10 است. بررسی خصوصیات مولکولی سویه‌های باسیل سل مقاوم به داروی متعلق به نواحی جغرافیایی مختلف، اطلاعات مفیدی برای ارائه روش‌های مولکولی بهتر تشخیص مقاومت دارویی را فراهم می‌آورد. آنزیم katG باسیل سل هم به عنوان یک آنزیم کاتالاز باعث حذف پراکسید هیدروژن شده و هم به عنوان یک آنزیم پراکساید می‌تواند ایزونیازید را اکسید کرده و به فرم فعال درآورد تا بتواند اثر ضد سلی داشته باشد. مقاومت مایکوباکتریوم توبرکولوزیس به ایزونیازید ممکن است به واسطه انواع مختلفی از موتاسیون‌ها روی دهد. موتاسیون‌هایی که در katG اتفاق می‌افتد مخصوصاً جانشینی S315T، مسئول بروز اکثر موارد مقاومت به ایزونیازید محسوب می‌شود، گرچه فراوانی جانشینی katG S315T در جمعیت‌های مختلف یکسان نیست. برخی از این موتاسیون‌ها باعث بروز تغییرات کونفورماسیونی در katG می‌شوند و برخی نیز از اتصال ایزونیازید جلوگیری می‌کنند. به عبارت دیگر، به نظر می‌رسد تغییر S315T که در محل اتصال ایزونیازید بر روی katG روی می‌دهد عامل بخش عمده‌ای از شکست‌های درمانی سل باشد.

 

نتیجه گیری:

در حال حاضر تست‌های تعیین حساسیت دارویی به عنوان ابزاری مناسب برای انتخاب رژیم‌های درمانی مناسب جهت درمان موفق مسلولین مخصوصاً سل مقاوم چند دارویی به کار می‌رود. از سویی نیز انجام این تست‌ها ارزیابی میزان تأثیر برنامه‌های کنترل سل به خصوص در انواع سل مقاوم به دارو را ممکن می‌سازد. روش‌های مختلفی برای تعیین حساسیت باسیل سل به داروهای ضد سلی وجود دارد ولی هیچ یک از آنها کامل نیست و نتایج آنها پزشکان را برای درمان مؤثر مسلولین چندان راضی نمی‌کند. جهت انجام روش‌های متداول کلینیکی مثل روش نسبی و روش مطلق، نیاز به پرسنل کارآمد و ماهر و صرف زمان طولانی و هزینه‌ی بالا می‌باشد و در عین حال نتایج این تست‌ها چندان قابل تکرار و مطمئن نیست. ایران یکی از کشورهایی است که میزان ابتلا به سل در آن بالاست. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که ایران یکی از مناطق آندمیک انواع جدا شده‌های مقاوم به دارو نیز هست، بنابراین به کار بردن روش‌های مولکولی برای تشخیص موتاسیون‌هایی که مرتبط با مقاومت دارویی است و می‌تواند زمان مورد نیاز برای شناسایی انواع مقاوم را تا حدود زیادی کاهش دهد، بسیار مفید است.

References:

 

1.Johnson, R., E. M. Streicher, G. E. Louw, R. M. Warren, P. D. van Helden, and T. C. Victor. 2006. Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Curr.Issues Mol.Biol. 8:97-111.

 

  1. Dye C, Espinal MA, Watt CJ, Mbiaga C, Williams BG. Worldwide incidence of multidrug-resistant tuberculosis. J Infect Dis 2002; 185: 1197–202.

 

  1. Yves L. Janin. Antituberculosis drugs: Ten years of research. Bioorganic & Medicinal Chemistry 2007.

 

  1. Espinal MA, Laszlo A, Simonsen L, Boulahbal F, Kim SJ, Reniero A, et al. Global trends in resistance to antituberculosis drugs. N Engl J Med 2001; 344 : 1294-303.
  2. Mark T. McCammon, John S. Gillette, Derek P. Thomas, Srinivas V. Ramaswamy, Edward A. Graviss, Barry N. Kreiswirth, Jan Vijg and Teresa N. Quitugua Detection of rpoB Mutations Associated with Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 2005; 49(6): 2200-2209.
  3. Tang X, Morris SL, Langone JJ, Bockstahler LE. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J Microbiol Methods. 2005 ;63(3):318-30.
  4. Cheruvu Mani, N. Selvakumar,* Sujatha Narayanan, and P. R. Narayanan . Mutations in the rpoB Gene of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from India. Journal of Clinical Microbiology 2001; 39(8); 2987-2990 .

8. A Telenti, N Honore, C Bernasconi, J March, A Ortega, B Heym, HE Takiff and ST Cole. Genotypic assessment of isoniazid and rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at reference laboratory level.j ournal of Clinical Microbiology 1997; 35(3);719-723.

 

  1. Ginsburg AS, Grosset JH, Bishai WR. Fluoroquinolones, tuberculosis, and resistance. Lancet Infect Dis 2003; 3: 432-42.

 

  1. 10. Ainsa JA, Martin C, Gicquel B. Molecular approaches to tuberculosis. Mol Microbiol 2001; 42: 561-70.

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

یوسف تاروردی‌زاده1، رضا کاظمی درسنکی1، نفیسه قربانی2

1کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان

2عضو هیئت علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان