معماری

نانو بادیها

Nanobodies

تعریف، تولید و کاربرد در پزشکی

 

چکیده:

آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویژه‌ای در خون شترسانان یافت می‌شود که فقط از زنجیره سنگین همودایمر تشکیل شده‌اند. ویژگی منحصربه‌فرد این آنتی‌بادی‌ها نسبت به آنتی‌بادی‌های معمولی عدم وجود زنجیره سبک در ساختمان آنها است. جایگاه متصل شونده به آنتی‌ژن در این آنتی‌بادی‌ها از یک دومن تنها تشکیل شده که مربوط به دومن متغیر این آنتی‌بادی‌ها است که به همین علت نانوبادی نامیده می‌شود. نانو‌بادی‌های اختصاصی به آنتی‌ژن را به‌آسانی با زمان ایمنوزاسیون کوتاه در شترسانان با آنتی‌ژن و با استفاده از گنجینه VHH و نمایش فاژ می‌توان بدست آورد. خصوصیات بیوشیمیایی سودمند آن شامل حلالیت خوب، پایداری در برابر عوامل دناتوره‌کننده، پروتئازها و دمای بالا، اختصاصیت به آنتی‌ژن، اندازه کوچک و عدم ایجاد دیمریزاسیون باعث شده است که آنها به‌عنوان ابزاری ایده‌آل برای تحقیق، تشخیص و درمان بکار روند. در مطالعه حاضر تلاش شده نگاه اجمالی به ویژگی‌های نانوبادی‌ها، روش‌های طراحی و تولید و کاربرد آنها در تشخیص و درمان بیماری‌ها داشته باشیم.

 

مقدمه:

آنتی‌بادی‌ها مولکول‌های پروتئینی هستند که در طی پاسخ ایمنی در بدن پستانداران ازجمله انسان و موش توسط لنفوسیت‌های B تولید می‌شوند. از نظر ساختاری آنتی‌بادهای معمول از چهار زنجیره پلی‌پپتید تشکیل شده‌اند؛ دو زنجیره کوتاه‌تر را زنجیره‌های سبک (L) می‌نامند که با پیوند دی‌سولفیدی به دو زنجیره‌ بلندتر سنگین(H) متصل می‌شوند. هر کدام از زنجیــــــــره‌های ایمنوگلوبولین از نواحی ثابت (Constant Region) و متغیر(Variable Region) تشکیل شده است. توانایی شناسایی و اتصال به آنتی‌ژن در نواحی بسیار متغیر زنجیره‌های سبک و سنگین(VH & VL) وجود دارد که اصطلاحاً Fab نامیده می‌شود.

نواحی ثابت زنجیره سنگینFC) ) در عملکردهای بیولوژیک آنتی‌بادی‌ها ازجمله اتصال به گیرنده‌های روی سلول‌های هدف و تثبیت کمپلمان و اپسونیزاسیون نقش دارند که در نهایت به راه‌اندازی عملکردهای اجرایی به‌منظور حذف آنتی‌ژن منجر می‌شود. این ناحیه برای کاربردهایی که فقط اتصال به آنتی‌ژن مدنظر است، ضروری نیست.

آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال و مونوکلونال دارای مصارف تحقیقاتی، تشخیصی و درمانی بسیاری می‌باشند ولی به علت واکنش ناحیه Fc با رسپتورهای Fc سلول‌های بیگانه‌خوار، دارای اثرات جانبی ناخواسته می‌باشند، ازاین‌رو نانوبادی‌ها به علت خصوصیات بیوشیمیایی ویژه ازجمله حلالیت خوب، پایداری در برابر عوامل دناتوره‌کننده، پروتئازها و دمای بالا، اختصاصیت به آنتی‌ژن، اندازه کوچک و عدم ایجاد دیمریزاسیون به‌عنوان ابزاری ایده‌آل برای تحقیق، تشخیص و درمان بکار می‌روند.

 

نانو‌بادی‌ها (آنتی‌بادی‌های تک دومن طبیعی)

در اواخر دهه 1980 پروفسور ریموند هامرز و همکارانش آنتی‌بادی‌های IgG اختصاصی را از سرم خون شتر جدا کردند که آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین (antibodies Heavy-chain یا HCAbs) نامگذاری شدند. این آنتی‌بادی‌ها نسبت به آنتی‌بادی‌های معمولی فاقد زنجیره سبک (زنجیره L) و نخستین دومن ثابت (CH1) زنجیره سنگین (زنجیره H) بودند. آنتی‌بـــــــادی‌های زنجیره سنگین از چین‌خوردگی دو زنجیره سنگین H به وجود آمده‌اند که در ناحیه انتهایی ســــــر N خود دارای یک دومن متغیر اختصاصی هستند که به اصطلاح به آن دومن متغیر زنجیره سنــــــــــــــــــــــگین آنتی‌بادی (Variable domain heavy chain antibody) یا VHH یا نانوبادی گویند. حیواناتی که این آنتی‌بادی‌ها را تولید می‌کنند جزء خانواده شترسانان هستند.

آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین را براساس طول منطقه لولا (hinge region) به دو نوع ایزوتیپ شامل ایزوتیپ لولا کوتاه (short-hinge isotype) و ایزوتیپ لولا بلند (longe-hinge isotype) تقسیم می‌کنند. (شکل 1)

آنتی‌بادی‌های موجود در سرم شترسانان شامل سه ساب‌ایزوتیپ IgG می‌باشند که IgG1 همانند آنتی‌بادی‌های معمولی می‌باشد اما IgG2 و IgG3 همان آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین می‌باشند. وزن مولکولی IgG1 همانند آنتی‌بادی‌های معمولی حدود 150 کیلودالتون و وزن مولکولی IgG2 و IgG3، 90 کیلودالتون می‌باشد.

 

مقایسه بین دومن‌های VH آنتی‌بادی‌های معمولی و VHH آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین:

1-هر دو دارای توالی‌های متغیر CDRها هستند که در بین نواحی بیشتر حفظ شده (FRها) قرار دارند.

2- در VH مناطق حفظ شده هست که از اسیدهای آمینه هیدروفوبیک تشکیل شده و در موقعیت‌های 37، 44، 45 و 47 ناحیه FR2 قرار دارند. این اسیدهای آمینه با نواحی هیدروفوبیک زنجیره‌های سبک میانکنش می‌کنند.

3- در VHH، ناحیه FR2 از اسیدهای آمینه هیدروفیلیک (موقعیت‌های 37، 44، 45 و 47) تشکیل شده که زنجیره‌های سبک قادر به اتصال به آن نیستند.

4- نواحی CDR2 و CDR3 و VHH ازنظر اندازه بزرگ‌تر از VH می‌باشد.

5- هومولوژی بین VH و VHH در نواحی داربست (FR‌ها) بیش از 90 درصد می‌باشد.

 

ساختار VHH

جایگاه اتصال به آنتی‌ژن آنتی‌بادی‌های زنجیره سنگین از دومن تک زنجیره تشکیل شده که بطور مستقیم از طریق منطقه لولا به دومن Fc متصل می‌گردد. به این دومن متغیر VHH گویند.

این دومن از 9 صفحه بتا تشکیل شده که همان نواحی حفظ‌شده‌ای هستند که مناطق داربست(FR) نامیده می‌شوند. این FRها شامل FR1، FR2، FR3 و FR4 هستند و از 3 لوپ تشکیل شده که این لوپ‌ها همان مناطق شاخص مکمل CDR می‌باشند. این CDRها شامل CDR1، CDR2 و CDR3 هستند.

پیوندهای دی‌سولفیدی در VHH

پیوندهای دی‌سولفیدی عمومی بین FR1 و FR3، پیوند دی‌سولفیدی اختصاصی در انواع مختلف شترسانان به ترتیب بین CDR3 و انتهای CDR1 و بین CDR3 و ابتدایCDR2 می‌باشد

روش تهیه نانوبادی‌ها

ابتدا خون شتر غیرایمن یا ایمن شده نسبت به یک ایمونوژن را جمع‌آوری و لنفوسیت‌های آن را جدا کرده و سپس mRNA را استخراج کرده و توسط آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از روی آن cDNA ساخته می‌شود. پس از ساخت cDNA، جهت تولید مقدار بیشتر DNA، PCR انجام می‌شود. سپس نانوبادی‌ها به درون وکتور مناسبی مانند فاژمید کلون می‌شوند، این وکتورهای حاوی نانو بادی‌ها به درون باکتری‌های E.coli TG1 ترانسفورم شده و تولید کتابخانه‌های نانوبادی (107 VHH) می‌کنند. با روش Panning می‌توان نانوبادی اختصاصی به آنتی‌ژن را جدا کرد. جهت تولید نانو بادی‌های محلول از سویه‌های E.coli و میزبان یوکاریوتی با بازده مثل مخمرساکارومایسس سرویزیه استفاده می‌گردد، همچنین به‌منظور خالص‌سازی نانوبادی‌ها از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی استفاده می‌گردد .

 

 

کاربرد نانوبادی‌ها در پزشکی

نانوبادی‌ها به خاطر ویژگی‌های منحصربه‌فردی از قبیل تولید آسان و باصرفه، اندازه کوچک، توالی انسانی شده (جایگزینی 12 اسیدآمینه از 14 اسیدآمینه متفاوت بین VH انسانی و VHH شتر)، پایداری و مقاومت به حرارت، حلالیت بالا، چین‌خوردگی برگشت‌پذیر، افینیتی اختصاصی و زیاد نسبت به هدف و همچنین شناسایی اپی‌توپ‌هایی که توسط آنتی‌بادی‌های معمولی شناسایی نمی‌شوند برای اهداف کاربردی بسیار ایده‌آل هستند.

از نانوبادی‌ها می‌توان به‌عنوان ابزارهایی برای پژوهش، تشخیص و تحقیق استفاده کرد. از نانوبادی‌های با میل پیوندی بالا می‌توان برای اهداف مهمی مثل خالص‌سازی پروتئین‌ها، سیستم دارورسانی، بررسی مولکول‌های مخابره کننده پیام (signaling) درون سلولی و بیومارکرهای سرطان استفاده کرد.

کونژوگه کردن نانوبادی با عناصر رادیواکتیو یا نانوبادی‌های متصل شده به GFP، محل تمرکز مولکول را شناسایی می‌کنند. از این ‌روش در تکنیک‌های تصویربرداری با رزولوشن بالا استفاده می‌گردد، همچنین ادغام ژنتیکی پروتئین فلورسنت به نانوبادی‌ها و بیان درون سلولی، تولید کروموبادی یا فلوبادی‌هایی می‌کند که می‌توانند آنتی‌ژن در بخش‌های مختلف سلولی در سلول‌های زنده را ردیابی کنند .

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

فهیمه لاوی

دانشجوی دکترای ایمونولوژی

پاسخ دهید