معماری
وسترن بلاتینگ

وسترن بلاتینگ

کاربردهای روش الکتروفورز بر روی ژل در ابتدا محدود به موارد خاصی بود؛ زیرا دسترسی کاوشگرهای (پروب‌های) ملکولی به پروتئین‌های جدا‌سازی شده در بستر ژل بسیار دشوار بود. سرانجام Towbin و همکاران در سال ۱۹۷۹، روشی را ابداع کردند که توانایی انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشای جاذب را می‌داد. این روش به وسترن بلاتینگ یا بلاتینگ پروتئین معروف شد.
این تکنیک ابتدا در آزمایشگاه George Stark در استانفورد ابداع شد. نام وسترن بلات از جانب W.Neal Burnette به این تکنیک اختصاص یافت و در حقیقت بیشتر یک شوخی و مزاح با اسم تکنیک ساترن بلات (Southern blot) بود که به منظور بررسی DNA، پیشتر توسط Edwin Southern نامگذاری شده بود. تکنیک بررسی RNA را نورترن بلات (Northern blot) می‌نامند.

سـاده‌تـریـن روش پـروتـئـیـن بـلاتـیـنـگ، دات بــلاتـیـنــگ نــامـیــده مــی‌شــود. در روش مــذبـور مولکول‌های پروتئینی محلول در نمونه به کمک پی پت متغیر یا سرنگ هامیلتون، به‌طور مستقیم بـه غـشـا مـنـتـقـل مـی‌‌شـوند. با انجام این روش، اطلاعاتی کیفی در مورد بروز پروتئین به‌دست می‌آید.
روش دیـگــر کــه پـیـچـیــده‌تـر اسـت، وسـتـرن بـلاتینـگ نـامیـده مـی‌شود که شامل جد‌اسازی مخلوط پروتئینی بر روی ژل و سپس انتقال آن‌ها به یک غشای مناسب است. در این روش یک مـلـکــول پــروتـئـیـنـی از طـریـق میـانکنـش بـا یـک آنـتــی‌بــادی اخـتـصــاصــی نـشــانــدار، شـنــاســایـی می‌شود. در این تکنیک، منبع تولید پروتئین که in vitro و یا in vivo باشد، تفاوتی نمی‌کند. منبع نمونه‌ها هم ممکن است از بافت کامل یا کشت سلولی گرفته شده باشند. در اغلب موارد، باید با اســتـــفــــاده از blender، homogenizer و یـــــا sonication، بـــافـــت مـــورد نــظـــر را خـــرد کــرد. سلول‌ها نیز ممکن است که لازم باشد تا با یکی از وسـایـل بالا، آن‌ها را خرد کرد. لازم به ذکر اسـت کـه بـاکـتـری ها، ویروس‌ها و نمونه‌های محیطی نیز می‌توانند منبع پروتئین بوده و وسترن بلات تنها محدود به بررسی مطالعات سلولی نمی‌شود.
از آنجائی‌که غالبا وسترن بلاتینگ را به کمک اتصال آنتی بادی ها مورد تجزیه و تحلیل قرار می دهند، به آن ایمونو بلاتینگ نیز گفته می شود. وسترن بلات یکی از روش های ایمونواسی است که برای آشکار سازی پروتئین  در بافت ها و مایعات بدن به کار می رود. این روش، ترکیبی از الکتروفورز و انتقال پروتئین ها به یک فاز جامد است.
با این روش می‌توان اطلاعاتی در مورد خصوصیات مختلف آنتی‌ژن‌های پروتئینی شامل وجود و مقدار آنتی‌ژن، وزن ملکولی پروتئین، ایزوفرم‌ها و محصولات شکسته شده آن و کارایی روش استخراج آنتی‌ژن به دست آورد.
وسترن بلات به شما می‌گوید که چه مقدار پروتئین در سلول وجود دارد. چنانچه پروتئین به سرعت تجزیه شود، تکنیک وسترن بلات قادر به تشخیص آن نخواهد بود.
در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی از وسترن بلاتینگ به منظور بررسی و تایید حضور یک آنتی بادی در بدن و تشخیص بیماری‌های عفونی و انگلی، بیماری‌های خود ایمنی و آلرژی استفاده می‌شود. همچنین از این روش به عنوان آزمایش تاییدی برای تشخیص عفونت HIV و ۱HTLV- پس از نتایج مثبت این آزمایش‌ها با روش الیزا و انسفالوپاتی اسفنجی گاوی و همچنین بیماری Lyme، استفاده می‌شود.
برای آنالیز پروتئین‌های جدا شده با الکتروفورز و تشخیص پروتئین مورد نظر از واکنش آن با آنتی بادی اختصاصی استفاده می‌شود. این واکنش نمی‌تواند بر روی ماتریس الکتروفورز انجام شود. برای این کار می‌توان قسمتی از ژل را که حدس زده می‌شود نوار پروتئین مورد نظر در آن قرار دارد، برش زده و نمونه پروتئینی را از آن به داخل یک بافر انتقال داد. این روش سخت و وقت گیر ‌است. روش کارآمدی که مورد استفاده قرار می‌گیرد روش وسترن بلاتینگ است. در این روش ملکول‌های جدا شده توسط ژل الکتروفورز از ژل به فیلترهای غشایی انتقال داده می‌شوند. این ملکول‌ها در سطح غشا فیلتری در همان محلی که منتقل شده‌اند پایدار باقی می‌مانند. در این حال به سهـولـت برای انجام واکنش با آنتی بادی‌های اختصاصی آمادگی دارند. غشا مورد استفاده در روش وسترن بلاتینگ معمولا نیترو سلولزی و یا پلی وینیل دی فلوراید (PVDF) (Polyvinylidene difluride) است. باید توجه داشت که نباید میان ژل و غشا، حباب هوا ایجاد شود. زیرا در این صورت، پروتئین مورد نظر از ژل به غشا انتقال پیدا نمی‌کند.
انتقال پروتئین از ژل به غشا توسط الکتروفورز معکوس و در طول ۳۰ دقیقه تا ۲ سـاعـت  صـورت مـی‌گیـرد. ایـن کـار تـوسط دو روش مرطوب (Wet) و نیمه خشک (Semi dry) صورت می‌گیرد. در روش مرطوب ژل الکتروفورز در یک قاب در کنار غشا و در ظرفی حاوی بافر بین دو الکترود قرار می‌گیرد. اعمال جریان الکتریکی و برقراری اختـلاف پتانسیل موجب مهاجرت یون‌ها از ژل به غشا خواهد شد. در روش نیمه خشک ظرف بافر با فیلترهای کاغذی آغشته به بافر جایگزین می‌شود. مراحل انجام وسترن بلاتینگ در تصویر۱ به صورت کلی نشان داده شده است.
بعـد از تثبیـت پروتئین‌ها بر روی غشا برای حصول اطمینان از کامل بودن انتقال مـی‌تـوان از روش‌هـای رنـگ‌آمیـزی غیر اختصاصی استفاده کرد. در عین حال آنتی ‌بادی‌های اختصاصی قادر به نشان دادن استانداردها از جمله مارکرهای وزن ملکولی روی ژل نیستند. بنابراین در کنار تشخیص با آنتی بادی می‌توان برای آنالیز کامل از یک روش رنگ آمیزی مانند Ponceau S استفاده کرد. جای نوارهای رنگ آمیزی شده با Ponceau S با مداد بر روی غشا علامت گذاری می‌شود. چرا که این رنگ ماندگار نیست و در طی تشخیص با آنتی‌بادی شسته می‌شود. لازم به یادآوری است که در هنگام کار کردن با فیلتر نیترو سلولز باید از دستکش استفاده شود.

خلاصه مراحل کلی آزمایش وسترن بلات
‌آماده‌سازی نمونه
‌جدا‌سازی پروتئین‌های موجود در نمونه توسط SDS-PAGE
‌انـتقـال پـروتئیـن‌هـای جـداسـازی شـده بـر روی ژل به غشا
‌رنـگ آمـیـزی کـردن پـروتـئـیـن‌هـای بلات شده بر روی غشا
‌پـوشـاندن جایگاه‌های غیر اختصاصی بر روی غشا با محلول‌های بلوکه کننده
‌مــجـــاور ســـاخــتـــن غــشـــا بـــا آنــتـــی بــادی اختصاصی پروتئین هدف
‌مـجـاور سـاخـتـن غشا با آنتی بادی ثانویه نشاندار شده با بیوتین
‌اضافه کردن آنزیم نشاندار
‌اضـافـه کـردن سـوبـسـتـرای مـنـاسـب بـرای آنزیم مورد استفاده
‌بررسی نتایج به‌دست آمده

 

پاسخ دهید