معماری
اسی

رنگ امیزی اسید فست

 

اسی
باکتری های اسید فست باکتریهایی هستند که رنگ کاربول فوشین(فوشین قلیایی حل شده در یک مخلوط فنل-الکل-اب)را حتی پس از بیرنگ شدن با اسید هیدروکلریک در الکل،نگه میدارند.یک اسمیر از باکتریها بر روی لام در محلول کاربول فوشین غوطه ور می گردد و در حمام بخار حرارت داده می شود.پس از این مرحله ،تغییر رنگ باکتری با اسید-الکل روی میدهد و در نهایت یک رنگ متضاد(ابی یا سبز)استفاده میشود.باکتریهای اسید-فست(مایکوباکتریها و بعضی از اکتینومایستها مشابه انها)به رتگ قرمز در مایند،و سایر باکتریها با رنگ متضاد استفاده شده،رنگ امیزی می شوند.

رنگ امیزی اسید فست

رنگ امیزی اسید فست یا ذیل نلسون – Ziehl-Neelsen Stain
رنگ امیزی ذیل نلسون – Ziehl-Neelsen Stain رایجترین روش رنگ امیزی در آزمایشگاه های مایکوباکتریولوژی است.
البته روش دیگری هم به نام اسید فست تغییریافته وجود دارد.نحوه ساختن رنگ اسید فست یا ذیل نلسون
۱- محلول کربول فوشین – Carbolfuchsin
الف) محلول فوشین بازیک Basic fuchsin- – 3/0 گرم از فوشین بازیک را در ml 10 اتانول- Ethanol- 95 % حل می کنند.
ب) محلول فنل، مقدار ۵ گرم از فنل کریستاله–Phenol crystals را کمی گرم می کنند تا ذوب شود. سپس با اضافه کردن آب مقطر حجم نهایی آن را به ۹۰ میلی لیتر می رسانند.
برای تهیه محلول کربول فوشین، مقدار ml 10 از محلول فوشین بازیک را به ۹۰ میلی لیتر از محلول فنل اضافه می نمایند.
۲- محلول رنگ بر
برای آماده کردن اسید الکل ۳%، ml ۳ از اسید کلریدریک غلیظ را در ml ۹۷ از اتانول حل می کنند.به آرامی اسید را به ظرف الکل اضافه می نمایند.
برای رنگ بری می توان از اسید سولفوریک ۲۵ % نیز استفاده کرد ( ml25 اسید + ml75 آب مقطر).
۳ – محلول رنگ آمیزی زمینه
۰.۳ گرم از آبی متیلن( Methylene blue) را در ۱۰۰ ml آب مقطر (Distilled water )حل می کنند.
رنگ زمینه می تواند سبز مالاشیت یا اسید پیکریک باشد. (مقدار محلول ۵/۲ گرم از سبز مالاشیت یا ۵/۳ گرم از اسید پیکریک را در ml 500 آب مقطر حل می کنند).
لازم به ذکر است که رنگ ذیل نلسون تهیه شده باید در شیشه های تار نگهداری و در ظرف کمتر از ۱ ماه مصرف شوند زیرا گذشت زمان در محلول کربول فوشین، کریستال های کوچکی ایجاد می شود که ممکن است در رنگ آمیزی اشکال ایجاد کند.

نحوه رنگ آمیزی اسید فست یا ذیل نلسون

ابتدالامها را باید فیکس شوند. برای فیکس کردن دو راه وجود دارد
۱- استفاده از حرارت
۲-استفاده از فورر به مدت حداقل ۱۰ دقیقه و در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد
بعد از فیکس کرد نمونه،روی لام را با رنگ کربول فوشین(فوشین بازی) آغشته می کنیم . بعد از پخش کردن رنگ کربول فوشین در سطح لام ، با استفاده از پنبه اغشته با الکل سطح زیری لام را حرارت میدهیم که حرارت تا زمانی ادامه پیدا می کند که بخار از روی لام متصاعد شود. اگر رنگ از روی لام پاک شود دوباره روی ان با رنگ پوشانیده شود . اگر مدت زمان زیادی حرارت دادن طول بکشد باعث رسوب در سطح لام خواهیم بود که نتایج مثبت کاذب را افزایش می دهید . بعد از حرارت لام را به مدت ۵دقیقه در هوای ازاد اتاق قرار میدهیم در این مرحله تمام آرتیفکتها ، باسیلها و سایر مواد موجود در لام رنگ امیزی می شوند . علت حرارت در رنگ امیزی ذیل نلسون این است که از انجا که دیواره TB بسیار لیپیدی است رنگ نمیتواند وارد دیواره باسیل شود بنابراین با حرارت، نفوذ رنگ به داخل باسیل ها را افزایش می دهیم . بعد از ۵دقیقه ، با آب معمولی لام را از بغل شستشو و آب گیری می کنیم و سپس با اسید الکل ۳% رنگ بری را انجام می دهیم . اسید الکل به مدت ۳ تا ۴ دقیقه بر روی لام پخش شده و رنگ باسیلها به علت دیواره مخصوص انها شستشو داده نشده و رنگ قرمر کربول فوشین را در خود می گیرد ولی همه رنگ ها از اجسام موجود در لام برداشته می شود دراخر برای افزایش کنتراست می توان از یک رنگ زمینه ای مانند متیلین بلو و یا مالاشیت سبز استفاده کرد.. مدت زمان لازم برای متیلین بلو ۱ دقیقه است . لام ها را پس از خشک کردن در زیر میکروسکوپ با عدسی ۱۰۰ می بینم.

پاسخ دهید