معماری
هموگلوبین الکتروفورز

آزمایش هموگلوبین الکتروفورز

این تست جهت تشخیص هر نوع هموگلوبین غیر طبیعی و بیماری هایی نظیر بتاتالاسمی مینور، بتاتالاسمی ماژور، کم خونی داسی شکل و … مورد استفاده قرار میگیرد. در بتاتالاسمی مینور غلظت هموگلوبین A2 بیش از ۳٫۳ بوده و غلظت هموگلوبین F معمولاً بین ۵ تا ۲۰ % هموگلوبین تام است و در بتاتالاسمی ماژور مقدار هموگلوبین F حدود ۷۰ تا ۹۰% از هموگلوبین تام است. افزایش جزئی غلظت Hb F در بیماری های خونی نظیر آنمی و لوسمی حاد دیده می شود.

نام اختصاری: Hb electro

سایر نام ها: الکتروفورز هموگلوبین،

, HGB electrophoresis, Hemoglobin Cascade   Hb Variant

بخش مورد انجام: هماتولوژی

نوع نمونه قابل اندازه گیری : خون تام

حجم نمونه مورد نیاز: ۱۰ ml

شرایط نمونه گیری: نیاز به ناشتایی نمی باشد.

ملاحظات نمونه گیری:

  1. با رعایت اصول نمونه گیری از بیمار خون وریدی گرفته شود. و در ویال های حاوی ضد انعقاد EDTA یا ACD یا هپارینه جمع اوری نمایید.
  2. از جمع آوری نمونه در ویال های بدون ضد انعقاد و یا ضد انعقاد نامناسب اجتناب نمایید.
  3. دانستن سن بیمار حائز اهمیت است.
  4. در صورت انتقال خون بیمار در ۴-۳ ماه گذشته، در برگه آزمایش یادداشت نمایید.
  5. در صورت داشتن سابقه بیماری خونی، آن را در برگه آزمایش یادداشت نمایید.
  6. پس از جمع آوری نمونه، آن را در دمای یخچال نگه دارید. از سانتریفیوژ نمودن نمونه اجتناب نمایید.
  7. محل خونگیری را از لحاظ خونریزی بررسی نمایید و در صورت لزوم با باند فشاری ببندید.

موارد عدم پذیرش نمونه:

ü      نمونه های لخته شده

ü      نمونه های مانده در دمای اتاق و نمونه های فریز شده

ü      نمونه های بدون برچسب یا با برچسب اشتباه

شرایط نگهداری: از خون تام باید همان روز همولیزات تهیه گردد. همولیزات در دمای ۰C 8- 4 به مدت یک هفته پایدار است. از فریز کردن نمونه و یا نگهداری در دمای اتاق اجتناب نمایید.

اطلاعات تکمیلی:

هموگلوبینوپاتی نوعی اختلال خونی ارثی است که توسط اشکال مختلف هموگلوبین یا کاهش تولید هموگلوبین (تالاسمی) مشخص می‌شود. هموگلوبین پروتئینی است که حاوی آهن می‌باشد. این پروتئین در گلبول‌های قرمز یافت می‌شود و وظیفۀ انتقال اکسیژن از ریه‌ها به سرتاسر بدن را به عهده دارد. هموگلوبین‌های طبیعی موجود از این قرار می‌باشند:

هموگلوبین A: حدود ۹۵ تا ۹۸ درصد کل هموگلوبین را در افراد بالغ تشکیل می‌دهد.

هموگلوبین A2: حدود ۲ تا ۳ درصد کل هموگلوبین را در افراد بالغ تشکیل می‌دهد.

هموگلوبین F (هموگلوبین جنینی): حدود ۱ تا ۲ درصد کل هموگلوبین را در افراد بالغ تشکیل می‌دهد. این هموگلوبین اولین هموگلوبینی است که در دوران بارداری در جنین تولید می‌شود و بعد از تولد، تولید آن کاهش می‌یابد و بعد از حدود ۱ تا ۲ سال به میزان ۱ تا ۲ درصد می‌رسد.

جهش‌های ژنتیکی می‌توانند نوع هموگلوبین تولیدی را تغییر دهند و می‌توانند روی شکل، اندازه و عملکرد گلبول‌های قرمز تأثیر گذار باشد. گلبول‌های قرمزی که محتوای هموگلوبین آنها مشکل داشته باشد نمی‌توانند به صورت صحیح به وظایف خود عمل نمایند و نسبت به بقیۀ گلبول‌های قرمز با سرعت بیشتری توسط بدن تخریب می‌شوند. اگر این روند سرعت بگیرد می‌تواند باعث به وجود آمدن نوعی کم‌خونی بنام کم‌خونی همولیتیک شود. در افرادی که مبتلا به کم‌خونی وابسته به سلول‌های داسی شکل هستند هموگلوبینی به نام S وجود دارد. هموگلوبین C باعث کم‌خونی همولیتیک و هموگلوبین E می‌تواند علامت خاصی نداشته باشد یا باعث کم‌خونی خفیفی گردد. به طور معمول افرادی که قصد ازدواج با یکدیگر را دارند نیز این آزمایش را انجام می‌دهند که مشخص شود آیا ناقل انواع غیرطبیعی هموگلوبین هستند و یا مبتلا به کم‌خونی یا تالاسمی‌می‌باشند یا خیر. در صورتی‌که هر کدام از والدین ناقل و در انتظار فرزند باشند می‌توان از جنین نیز قبل از تولد آزمایش‌های مربوطه را به عمل آورد. از علائم ابتلا به کم‌خونی می‌توان به خستگی و ضعف، کمبود انرژی، زردی و رنگ پریدگی اشاره کرد. بعضی از انواع بیماری‌ها مانند کم‌خونی وابسته به سلول‌های داسی شکل علائم شدیدتری نسبت به بقیه بروز می‌دهند مانند دردهای شدید، تنفس بریده بریده، بزرگ شدن طحال و اختلالات رشد در بچه‌ها.

از انواع دیگر هموگلوبین که زیاد شایع نیستند می‌توان به M ,J ,G ,D ,Bart ,H اشاره کرد.

 

کاربردهای بالینی:

  1. جهت بررسی نقایص مربوط به هموگلوبین (هموگلوبینوپاتی) نظیر کم خونی داسی شکل، تالاسمی ها و …..
  2. در صورت وجود نتایج غیرطبیعی در آزمایش CBCاین آزمایش درخواست می‌شود.
  3. این آزمایش بخشی از برنامۀ غربالگری نوزادان نیز می‌باشد.

روش مرجع و ارجح:

روش های متداول: الکتروفورز هموگلوبین با ژل سیترات آگار به روش اسیدی (pH: 6-6.5)،  الکتروفورز هموگلوبین با ژل آگاروز یا استات سلولز به روش قلیایی (pH: 8.4-8.6 ) ، روش HPLC.

در این آزمایشگاه ژل های اسیدی و قلیایی  توسط اپراتور ساخته می شود.

سایر روشها: الکتروفورز کاپیلاری، الکتروفورز ژل نشاسته (pH: 6.8-7)، الکتروفورز زنجیره گلوبولین (۶٫۳, ۸٫۹)، ایزوالکتریک فوکوسینگ (IEF)

الکتروفورز به روش سیترات آگار، جهت افتراق هموگلوبین های غیر طبیعی :

هنگامی که هموگلوبین حاصل از گلبول های قرمز لیز شده را بر روی کاغذ یا ژل الکتروفورز در میدان الکترومغناطیسی قرار دهند، انواع مختلف هموگلوبین با سرعت های متفاوتی حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند. حرکت انواع گوناگون هموگلوبین بر روی ژل موجب پیدایش باندهای مختلفی می شود. شکل باند حاصل با شکل باند طبیعی و سایر باندهای غیر طبیعی شناخته شده مقایسه می گردد. سپس از روی آن وجود بیماری را تشخیص می دهند. مقدار هر باند را می توان به صورت درصدی از هموگلوبین کل گزارش نمود که نشانگر شدت بیماری می باشد.

تمام هموگلوبین ها از ناحیه کاتد (- ) به سمت آند (+) شروع به حرکت میکنند. برخی هموگلوبین ها سرعت تجمع مساوی دارند و در یک ناحیه با هم دیده میشوند. مثلا Hb A2 قابل تفکیک از Hb C/E/O نیست. همچنین HbS نمیتواند از Hb D جدا شود. در الکتروفورز به روش سیترات آگار  در  pH: 6.2 سه گروه هموگلوبین خواهیم داشت.

هموگلوبین های کند شامل  O، E،A2، C و C-Harlem که نزدیک کاتد جمع می شوند. گروه میانه شامل HbF ، HbA،HbS ، Lapore ، G و  D هستند. گروه سریعتر یا نزدیک به آند شامل N ، J ، I ، H ، Hb K و Bart’s.

در بتاتالاسمی (یعنی HbS-β-Thalasemia یا HbC-β-Thalasemia) هموگلوبین A کاملاً از بین رفته و تصویر الکتروفورز شکل هموزیگوت از هموگلوبین های متغیر دیده می شود ( یعنی HbSS یا  HbCCو بدون HbA با مقادیر متغیر HbF). در بتا تالاسمی هتروزیگوت HbA2 معمولاً افزایش میابد. وجود یک باند ضخیم در ناحیه A2 معمولاً معرف HbC است.  در این هموگلوبینوپاتی بیش از ۹۰% هموگلوبین تام را هموگلوبین C تشکیل می دهد.

هموگلوبین ها از نظر سرعت حرکت از سمت کاتد به آند (چپ به راست):

 

A      E        G         F        A        K        J      بارتز   N        H

O        D                                                           I

C        S(lepore)

 

متدولوژی بر اساس نوع هموگلوبین:

Hemoglobin A2 and F: Cation Exchange/HPLC
Hemoglobin Electrophoresis: Capillary Electrophoresis
Hemoglogin S: Hemoglobin S Solubility
Unstable Hemoglobin: Isopropanol Stability
Hgb F, Red Cell Distribution: Flow Cytometry
Hgb Variant by Mass Spec: Mass Spectrophotometry (MS)
Hgb ELP, Molecular: Polymerase Chain Reaction (PCR) Analysis/Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA), Polymerase Chain Reaction (PCR)/DNA Sequencing
IEF Confirms: Isoelectric Focusing

 

مقادیر مرجع:

Hgb A نوزادان: ۵٫۹ – ۷۷٫۲%
 ماه۱ – ۲: ۷٫۹ – ۹۲٫۴%
  ماه۳ – ۵: ۵۴٫۷ – ۹۷٫۱%
 ماه۶ – ۸: ۸۰٫۰ – ۹۸٫۰%
 ماه۹ – ۱۲: ۸۶٫۲ – ۹۸٫۰%
 ماه۱۳ – ۱۷: ۸۸٫۸ – ۹۸٫۰%
ماه۱۸ – ۲۳: ۹۰٫۴ – ۹۸٫۰%
≥  ماه ۲۴: ۹۵٫۸ – ۹۸٫۰%
Hgb A2  نوزادان: ۰٫۰ – ۲٫۱%
ماه ۱ – ۲: ۰٫۰ – ۲٫۶%
 ماه۳ – ۵: ۱٫۳ – ۳٫۱%
≥ ماه ۶: ۲٫۰ – ۳٫۳%
Hgb F نوزادان : ۲۲٫۸ – ۹۲٫۰%
ماه ۱ – ۲: ۷٫۶ – ۸۹٫۸%
ماه۳ – ۵: ۱٫۶ – ۴۲٫۲%
 ماه۶ – ۸: ۰٫۰ – ۱۶٫۷%
 ماه۹ – ۱۲: ۰٫۰ – ۱۰٫۵%
 ماه۱۳ – ۱۷: ۰٫۰ – ۷٫۹%
ماه۱۸ – ۲۳: ۰٫۰ – ۶٫۳%
≥  ماه ۲۴: ۰٫۰ – ۰٫۹%
واریانت ها:  عدم وجود واریانت های غیر طبیعی

 تفسیر نتایج : این تست جهت تشخیص هر نوع هموگلوبین غیر طبیعی و بیماری هایی نظیر بتاتالاسمی مینور، بتاتالاسمی ماژور، کم خونی داسی شکل و … مورد استفاده قرار میگیرد. در بتاتالاسمی مینور غلظت هموگلوبین A2 بیش از ۳٫۳ بوده و غلظت هموگلوبین F معمولاً بین ۵ تا ۲۰ % هموگلوبین تام است و در بتاتالاسمی ماژور مقدار هموگلوبین F حدود ۷۰ تا ۹۰% از هموگلوبین تام است. افزایش جزئی غلظت Hb F در بیماری های خونی نظیر آنمی و لوسمی حاد دیده می شود.

اندازه گیری Hb F برای تشخیص تالاسمی ها و ناهنجاری های ارثی ساخت هموگلوبین بکار می رود.  معمولاً به تدریج Hb F های خون به Hb A  تبدیل می شود. بطوری که بعد از ۲ سالگی کمتر از یک درصد هموگلوبین های خون از نوع F می باشند.

اگر بعد از ۶ ماهگی درصد هموگلوبین F بیش از ۵% باشد، باید به  تالاسمی مشکوک شد.

مقدار هموگلوبین A2 در فرد طبیعی ۳٫۵- ۱٫۵ % است . در تالاسمی مینور مقدار Hb A2 بیشتر از این میزان است (۶%- ۴%).

محتوی هموگلوبین در برخی از هموگلوبینوپاتی های شایع که توسط الکتروفورز مشخص گردیده از قرار زیر است:

 

Hb H Hb C HbS Hb F Hb A2 Hb A1 هموگلوبینوپاتی های شایع
  %۸۰-%۱۰۰ % ۲ % ۲ – %۳ % ۰ آنمی داسی شکل ( هموزیگوس Hb SS)
  %۲۰-%۴۰ %۲۲ % ۲ – %۳ %۶۰ -%۸۰ صفت داسی شکل (هتروزیگوس Hb SA)
  %۹۰-%۱۰۰ % ۲ % ۲ – %۳ بیماری هموگلوبین C (هموزیگوس)
%۵-%۳۰ % ۲ – %۳ %۶۵ -%۹۰ بیماری هموگلوبین H
%۱-%۳ %۴-%۶ %۵۰ -%۸۵ بتاتالاسمی مینور (هتروزیگوس)
%۶۵-%۱۰۰ % ۲ – %۳ %۵ -%۲۰ بتاتالاسمی ماژور (هموزیگوس)

 

عوامل مداخله گر:

  • آنمی مگالوبلاستیک ناشی از داروها و هیپرتیروئیدیسم باعث افزایش Hb A2 می شودو تزریق خون قبل از آزمایش باعث ایجاد تداخل در آزمایش میگردد.
  • انتقال خون در طی ۱۲ هفته قبل ممکن است  به علت رقیق شدن غیر طبیعی هموگلوبین سبب تغییر نتایج آزمایش شود.

توضیحات:

  • روش سیترات آگار هموگلوبین S را از هموگلوبین E، D، G و C جدا میکند. اساس این روش الکتروفورز با pH : 6.2 بر روی ژل سیترات آگار است.
  • هموگلوبین C و S عمدتاً در غرب و مرکز آفریقا و هموگلوبین E و H در جوامع جنوب آسیا شایع است.
  • روش الکتروفورز ژل نشاسته برای جداسازی هموگلوبین S از D و G و هموگلوبین C از O و E مناسب است.
  • روش الکتروفورز زنجیره گلوبولی قادر به جداسازی هموگلوبین های H و بارتز از دیگر هموگلوبین هاست.
  • الکتروفورز ژل سیترات آگار یک روش انتخابی برای غربال واریانتهای معمول هموگلوبین است، اما مقادیر کم هموگلوبین A و F مشکل جدا می شوند.
  • الکتروفورز کاپیلاری (CE) تکنیک کلاسیک الکتروفورز در لوله موئینه سیلیکای به هم جوش خورده با منافذ کوچک که اغلب با پوشش پلیمری نازک (پلی ایمید) که در سطح خارجی احاطه شده است، انجام می شود. این لوله موئینه به عنوان اتاقک الکتروفورز عمل می نماید که در انتها به یک آشکارساز متصل شده و از طریق منبع بافر با ولتاژ بالا ایجاد می شود. مزیت اصلی CE پراکندگی گرما با راندمان بالا در مقایسه با الکتروفورز های رایج می باشد. پراکندگی گرمای ایجاد شده، اجازه استفاده از ولتاژی در دامنهء ۲۵ تا ۳۰ کیلووات را فراهم می کند که موجب افزایش کارایی جداسازی می گردد و زمان جداسازی را در بعضی موارد به کمتر از یک دقیقه کاهش می دهد. حجم نمونه در حدود پیکولیتر تا نانولیتر می باشد تا انحراف در میدانی که به دلیل حضور نمونه ایجاد می شود به حداقل برسد. این تکنیک در جداسازی هموگلوبین کاربرد دارد.
  • تکنیک ایزوالکتریک فوکوسینگ (IEF)، ترکیبات آمفوتریک نظیر پروتئین ها را با افزایش قدرت تفکیک در محیطی شامل شیب پایدار pH جدا می نماید. پروتئین ها به ناحیه ای از محیط که pH ژل با pI پروتئین برابر باشد حرکت می نماید. در این نقطه، بار پروتئین صفر می شود و حرکت آن متوقف می شود. پروتئین هایی که مقادیر pI فقط ۰٫۰۲ واحد pH تفاوت دارند با روش IEF از هم جدا می شوند. این تکنیک در بررسی هموگلوبینها کاربرد دارد.

پاسخ دهید