معماری

تایپینگ مولکولی

آگاهی از اصول اپیدمیولوژی جمعیت‌های میکروبی در فیلدهای میکروب‌ شناسی پزشکی، محیطی و کشاورزی مهم است. معرفی سویه‌های باکتریائی که فنوتیپ‌های پاتوژنتیکی مرگ‌آور و بسیار اذیت کننده را نشان می‌دهند، توسعه مقاومت به چند آنتی بیوتیک و کسب روش‌های جدید از انتقال بین ارگانیزم‌های میزبان، فشاری روی محققان جهت کسب شناسائی و مونیتورینگ منشأ و انتشار واریانت‌های ژنتیکی جدا (سویه‌ها) در داخل یک گونه وارد کرده است. کاملاً مشخص است که بهترین فرض در مشخص کردن سویه‌های خاص در کاربرد عملی بیولوژی مولکولی یافت می‌شود. امروزه تکنیک‌های ژنتیک مولکولی مانند PCR، انگشت نگاری اسیدنوکلئیک و آنالیز سکانس DNA کروموزوم باکتری ابزاری مهم در شناسائی باکتری‌ها می‌باشند. با تایپینگ مولکولی می‌توان شیوع‌ عفونت‌های بیمارستانی، شناسائی مخازن آلودگی ناشی از غذا یا انتشار سویه‌های پاتوژنیک گیاهی در محیط و جداسازی ژنوتیپ خاص در کونجوگاسیون با یک باکتری خاص را مشخص کرد و همچنین این روش‌ها به ما آگاهی بیشتر اصول اپیدمیولوژی و تکامل و انتشار بسیاری از بیماری‌های باکتریال را می‌دهند.

از زمان پاستور که فرض‌های اپیدمیولوژیکی در تایپینگ و تمایز باکتری‌ها متکی به روش‌های فنوتیپی و بیوتیپی بود، تمایز اولیه باکتری‌ها و روش‌های طبقه بندی اولیه از روی طبیعت تاکسونومیک باکتری‌ها بسیار گیج کننده بودند. مفاهیم گونه‌های کلاسیک در طبقه بندی باکتری‌ها از ابتدا غیرقابل کاربرد بود و از قرن ۲۰ بود که این مفاهیم برای طبقه بندی تاکسونومیک باکتری‌ها بکار رفت. اخیراً تعاریف گونه‌های مورفولوژی یا کلاسیک با مقایسه سکانس نوکلئوئیدی rDNA s16 به طور کامل مشخص شده است. سویــــــه‌ها اغلب نشان دهنده تنوع نوکلئوئیدی زیرگونه در ارتباط با بعضی فنوتیپ‌های خاص یا غالب (مانند خصوصیات پاتوژنیسیته) می‌باشد. بهرحال فرض‌های فنوتیپیک در آزمایشگاه میکروب‌ شناسی هنوز یک سنگر و یک قلعه می‌باشند. امروزه چند تا از این روش‌ها مانند انگشت نگاری متابولیکی نیازمندی‌های تغذیه، آنالیز تفاوت در مقدار اسیدهای چرب و تغییرات ساختمانی در ویژگی‌های مورفولوژیکی متفاوت پیدا شده در سطح باکتری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، بنابراین یک رنگ آمیزی گرم خود به تنهائی راهی را برای شناسائی و تمایز یک باکتری از دیگری باز می‌کند، هرچند هنوز احتیاط‌هابی در ارتباط با این نوع روش‌های تایپینگ کلاسیک که از نظر تاریخی خیلی قدیمی، مشکوک و به سادگی قابل اتکا نمی‌باشند، وجود دارد. تغییرات در روش‌های تایپینگ مولکولی که روی شناسائی ژنوتیپ‌های خاص در میان سویه‌های باکتری‌ها متمرکز شده است انقلابی در مطالعه تنوع سویــــــــه‌ها و مونیتور کردن شیوع‌های عفونت ایجاد کرده است. این روش‌ها نسبت به روش‌های کلاسیک تیپ بندی دارای چندین فایده از جمله موارد ذیل می‌باشند: نیاز نداشتن به تهیه کشت تک از یک سلول باکتری، افزایش پایداری و حساسیت سنجش و انجام واکنش در زمان کمتر و در نهایت اینکه یک تیپ مولکولی که از انگشت نگاری DNA یا سکانس نوکلئوتید حاصل می‌شود دارای اطلاعات زیادی درباره سویه می‌باشد؛ برای مثال آنالیز انگشت نگاری تکراری با REP ,ERIC و پروب‌های BOX دوازده آمپلیکون (قطعات آمپلی شده) نرمال را در یک سویه خاص نشان می‌دهند.

عموماً روش‌های شناسائی سویه بستگی به ۳ استراتژی پایه زیر دارد.

۱- آنالیز انگشت نگاری کروموزم با بکارگیری تکنیک‌های آمپلی فیکاسیون اولیگونوکلئوتید (RAPD و REP)

۲- قطعات حاصل از RE کروموزم باکتری (RFLP)

۳- آمپلی فیکاسیون آنزیمی سکانس‌های ژن تکی و آنالیز سکانس‌های بعدی محصولات PCR ایجاد شده.

بدون شک مهم‌ترین فایده تایپینگ باکتری‌ها زمانی مشخص می‌شود که چندین قطعه از DNA باکتری توسط PCR آمپلی شود. امروزه پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی چند لوکوسی جهت شناسائی چندین خانواده که عناصر تکراری محافظت شده در سراسر کروموزم دارند، بکار می‌رود. این تکنیک‌ها بدون استفاده از مواد رادیواکتیویته و به آسانی با بکار بردن ترموسایکلر و الکترفوروز افقی قابل اجرا می‌باشند. یکی از بزرگترین فایده تیپ بندی براساس PCR انعطاف پذیری آنها می‌باشد که به ما این اجازه را می‌دهد که در کمیت و کیفیت DNA ژنومی تغییراتی ایجاد نمائیم. آماده سازی جهت انجام PCR می‌تواند به همان سادگی با اضافه کردن سلول کامل مستقیماً به مخلوط واکنش باشد یا اینکه از چندین راه استخراج سریع DNA (معمول یا غیرمعمول) که در عرض چند دقیقه DNA به ما می‌دهد استفاده شود. تکنیک‌های انگشت نگاری براساس PCR که اخیراً در تمایز سویه‌ها بکار می‌روند عبارتند از: rDNA PCR و Rep-PCR نواحی فاصله انداز داخلی s23-s16 (ریبوتایپینگ) و RAPD-PCR .

ارزیابی سویه‌ها بطور مستقیم از سکانس‌های نوکلئوتیدی قدرت یکسانی در حل باکتری خاص دارد و هنگامی که با PCR ژنوم هدف تکی و تکنیک‌های سکانس کننده اتومات کوبل می‌شود اطلاعات ژنوتیپی واضح‌تر و سریع‌تر درباره سویه به ما می‌دهد.

سکانس DNA ریبوزومی در تمایز فیلوژنیکی خانواده‌های دور از هم در یوکاریوت‌ها بسیار مفید می‌باشد. سکانس‌های اجزای کوچک rRNA به طور خاص در حل ارتباط تکاملی داخل شاخه باکتری‌های ارغوانی بسیار مفید و مؤثر است. ارزش تمایزی ژن‌های بکار رفته برای تیپ بندی براساس اسید نوکلئیک سویه‌های متفاوت، اغلب داخل یک سیستم باکتری خاص به صورت تجربی تعیین می‌شود. در بعضی موارد چندین لوکوس متفاوت در کونجوکاسیون با همدیگر به ترتیب سبب افزایش دسترسی در شناسائی سویه‌ها و افزایش تمایز بین دو سویه می‌شوند. عموماً چندین فاکتور داخل ژن‌های کد کننده باکتری که منجر به شناسائی آنها می‌شود به عنوان مارکرهای مولکولی مفید برای تمایز سویه‌ها وجود دارد:

۱- میزان تغییرات سکانس نوکلئوتیدها که سکانس‌های اجزای کوچک و بزرگ rDNA را خیلی تغییر می‌‌دهند.

۲- کد شدن پروتئین حفاظت شده از نظر عملکرد در چندین جنس انتریک سبب شده که این پیشنهاد داده شود که ژن‌ها در گونه‌های نسبتاً دور بطور کامل دست نخورده باقی می‌مانند.

۳- مکان فیزیکی ژن روی کروموزم باکتری نشان دهنده تفاوت کروموزمی بین طبقه‌های باکتری دور از هم می‌باشد.

روش‌های ژنتیک مولکولی خودشان را به عنوان ابزارهای قدرتمند جهت شناسائی و دنبال کردن سویه‌های باکتری‌ها مطرح می‌کنند، ولی دارای چندین عیب می‌باشند. نقص‌های مربوط به کاربرد پروب‌های مولکولی و لوکوس مختلف کروموزمی ممکن است در روش‌های مولکولی مشکل ساز شوند. مثلاً ژنی که اغلب برای تمایز یک گونه بکار می‌رود ممکن است فاقد تنوع سکانس ضروری برای تمایز با گونه‌های غیروابسته مربوطه باشد.

تمایز تجربی کارآمدی روش‌های تایپینگ برای گروه خاصی از باکتری بعضی مواقع گران و زمان‌بر می‌باشد. برای مثال سکانس اجزای کوچک rDNA در تمایز گونه‌های سودوموناس خیلی مفید است ولی فاقد اثر مناسب در تمایز گونه‌های انتروباکتریاسه خیلی وابسته مانند گونه‌های توکسیژنیک اشرشیا و سویه‌های گونه اروینیا نکروژنیک می‌باشد.

امروزه با کمک سکانس کردن در بیشتر روش‌ها از مواد نشان‌دار رادیواکتیو استفاده نمی‌شود چون این روش‌ها کارآمد و از نظر اقتصادی مناسب هستند و شناسائی و تمایز ایمن سویه‌های باکتری‌ها را در دامپزشکی، پزشکی یا آزمایشگاه میکروبشناسی کشاورزی فراهم کرده‌اند.

فهمیدن توزیع و ارتباط پاتوژن ضروری است، چرا که تعیین اپیدمیولوژی میکروب و عفونت به طراحی روش‌هائی جهت کنترل پاتوژن کمک فراوان می‌کند. نقش تایپینگ پاتوژن این است که مشخص کند ایزوله‌هائی که از نظر اپیدمیولوژیکی وابسته هستند از نظر ژنتیکی به هم مربوطند یا خیر. در گذشته از ویژگی‌های فنوتیپی مانند بیوتیپ، سروتیپ، باکتریوفاژ یا باکتریوسین تیپ و پروفایل حساسیت به آنتی بیوتیک جهت تایپینگ میکروب‌ها استفاده می‌شد، ولی با پیشرفت روش‌های مولکولی در دو دهه اخیر امروزه آنها در تایپینگ مولکولی بسیار کارآمد شده‌اند. تکنیک‌های مولکولی که برای تایپینگ میکروب‌ها بکار می‌روند عبارتند از PFGE، روش‌های متکی بر برش آنزیمی، آنالیز پلاسمیدها و روش‌های تیپ بندی براساس PCR. بکارگیری روش‌های مولکولی برای تیپ بندی پاتوژن‌ها در ارتباط دهی دقیق بین سویه‌ها و گونه‌ها بسیار اساسی می‌باشد. اثبات ارتباطات کلون‌های یک پاتوژن به ما این امکان را می‌دهد که منبع آلودگی (انسان یا محیط) را پیدا کرده، سویه‌های عفونی از غیر عفونی را متمایز نموده و در نهایت عود را از عفونت مجدد تفکیک نمائیم.

تعدادی از عفونت‌ها ناشی از میکروب‌های کومنسال می‌باشند، بنابراین این مهم است که تعیین کنیم که آیا این ایزوله جدا شده از فرد بیمار سویه پاتوژن می‌باشد یا اینکه سویه کومنسال سبب عفونت شده است. همچنین با تیپ بندی می‌توان گفت که یک فرد اگر دچار عفونت مجدد شده است در اثر عود بیماری است یا اینکه توسط سویه‌ای غیر از سویه ایجادکننده عفونت اولیه آلوده شده است. همچنین اگر عفونت ناشی از عود باشد این روش‌ها نشان می‌دهند که رژیم درمانی اولیه مؤثر نبوده و درمان جایگزین باید انجام بگیرد.

امروزه با استفاده از تیپ بندی مولکولی در بیمارستان‌ها از شیوع بسیاری از عفونت‌های بیمارستانی ممانعت می‌شود و از این نظر به اقتصاد و سلامت جوامع مختلف کمک شایانی می‌گردد.

 

ویژگی‌های روش‌های تایپینگ:

تعدادی ویژگی مهم مانند روش‌های بکار رفته استاندارد، اختصاصیت، حساسیت، عینی و عملی بودن برای شمای تیپ بندی موفق در نظر گرفته می‌شود. همه سیستم‌های تایپینگ باید خصوصیات قابلیت تیپ بندی، تکرار پذیری، قدرت تمایز و آسانی در اجرا و گزارش دهی و ارزان قیمت بودن را داشته باشـــند. قابلیت تیپ بندی به توانائی تکنیک در طراحی نتیجه مشخص (تیپ) هر ایزوله برمی‌گردد. با روش‌های فنوتیپی بسیاری از ایزوله‌ها غیر قابل تیپ بندی هســــتند، ولی همین ایزوله غیرقابل تیپ بندی در روش‌های مولکولی تا حدودی تیپ بندی می‌شوند. تکرار پذیر بودن روش‌ها به تکرار آزمایش توسط افراد مختلف و گرفتن نتایج یکسان برمی‌گردد. تکرار پــــذیری ضعیف به تغییرات تکنیک در روش یا تغییــــــرات بیولوژیک در طی پاساژهای in vivo یا in vitro ارگانیزم مورد بررسی مربوط می‌شود. قدرت تمایز تکنیک به توانائی تکنیک در متمایز کردن ایزوله‌های غیر وابسته از نظر اپیدمیولوژی (به طور ایده‌آل هر تیپ متفاوت) برمی‌گردد. عموماً روش‌های فنوتیپی قدرت تمایز کمتری نسبت به روش‌های ژنوتایپی دارند. بیشتر روش‌های مولکولی نیازمند مواد و ابزارهای گران قیمت می‌باشند ولی براحتی یاد گرفته می‌شوند و به آسانی برای انواع گونه‌ها قابل اجرا هستند؛ به عبارت دیگر روش‌های فنوتیپی از نظر کارکنان و مواد ارزان‌تر هستند، ولی قدرت تمایز کمی دارند. برای مثال آنتی سرم‌های ضد سالمونلا که در سروتایپینگ آن بکار می‌رود برای ارگانیسم‌های گرم مثبت قابل استفاده نیست.

 

روش‌های فنوتایپینگ:

اولین روشی که برای شناسائی و تیپ بندی ارگانیسم‌ها بکار رفت براساس خصوصیات فنوتیپی بود. یکی از تکنیک‌هائی که خیلی زیاد بکار می‌رفت بیوتیپینگ یا تمایز سویه‌ها براساس خواصی مانند تفاوت در واکنش‌های بیوشیمیائی و مرفولوژی تحمل به محیط‌های متفاوت بود که امروزه هم تا حدودی استفاده می‌شود. اغلب بیوتایپینگ برای کمک به تعیین گونه‌های میکروارگانیسم‌ها براساس توانائی آنها در مصرف مواد در محیط‌های رشد متفاوت و انجام واکنش‌های شیمیائی خاص می‌باشد، همچنین ممکن است اغلب آنها برای جداسازی گروه‌های گونه‌های خاص ناشی از تفاوت‌های بیوشیمیائی در میان ارگانیسم‌ها استفاده شوند. امروزه بیوتایپینگ در آزمایشگاه‌ها با بکارگیری سیستم‌های اتوماتیک که برای تمایز و شناسائی گونه‌ها طراحی شده است، اجرا می‌گردد. این روش اغلب فاقد قدرت تمایز است، چرا که تغییرات در میان ژن‌ها و جهش‌ها خواص بیولوژیکی میکروارگانیسم‌ها را تغییر می‌دهد.

تست‌های حساسیت آنتی بیوتیکی که یک تجربه عمومی در آزمایشگاه میکروبشناسی بالینی است، نوعی تایپینگ فنوتیپی می‌باشند. نتایج آنتی‌ بیوگرام نشان می‌دهد که الگوی مقاومت یا حساسیت ارگانیسم به عوامل ضد میکروبی در آزمایشگاه چگونه است. امروزه تست‌های حساسیت ضد میکروبی به طورتیپیک با روش‌های میکرودولوشن براث اتومات یا دیسک دیفوژن اجرا می‌شود. قابل توجه است که روش دیسک دیفوژن فاقد روش اتوماسیون در اجرا می‌باشد. در بیشتر مطالعات اپیدمیولوژیکی آنتی بیوگرام ارزش محدودی دارد، چرا که ایزوله‌هائی که از نظر ژنتیکی و اپیدمیولوژیکی به هم مربوط نیستند، ممکن است دارای یک نوع الگوی حساسیت باشند، در حقیقت در تعدادی حالت‌ها تفاوت روش ژنوتایپینگ برای مطالعه توزیع این فنوتیپ‌های مقاوم به مواد ضد میکروبی در محیط‌های بیمارستانی استفاده می‌شود.

تست‌های سروتایپینگ از یک سری آنتی‌بادی برای جداسازی آنتی‌ژن‌های سطحی باکتری که تغییرات آنتی‌ژنیکی را از خود نشان می‌دهند، استفاده می‌کنند. روش‌های سروتایپینگ برای دهه‌ها برای گروه بندی و طبقه بندی تعدادی از گونه‌های باکتری‌های پاتوژن بکار می‌رفت و برای تیپ بندی سالمونلاها، لژیونلاها، شیگلاها و استرپتوکک پنومونیه هنوز مورد استفاده قرار می‌گیرد. غالباً سروتایپینگ در تمایز سویه‌های داخل گونه‌های پاتوژن‌های بیمارستانی مانند کلبسیلا و سودوموناس دارای ارزش اپیدمیولوژیکی می‌باشد. راه‌های مختلفی برای جداسازی آنتی‌ژن و آنتی‌بادی بکار می‌رود، ولی مهم‌ترین راه آگلوتیناسیون آنتی‌ژن– آنتی‌بادی می‌باشد که در آن سوسپانسیون سلول باکتری با مجموعه‌ای از آنتی‌بادی مخلوط می‌شود. براساس الگو آگلوتیناسیون سروتیپ مشخص می‌شود. برای ارگانیسم خاص مانند استرپتوکک پنومونیه از تست گوالانک استفاده می‌شود. اشکال این تیپ بندی فقدان آنتی‌سرم‌های خاص و مشکلات در استاندارد سازی روش‌های متفاوت می‌باشد.

در باکتریوفاژ تایپینگ الگوی باکتری‌ها براساس حساسیت یا مقاومت به فاژهای مختلف مشخص می‌شود.

باکتریوفاژ تایپینگ در اجرا و دسترسی به فاژهای فعال از نظر بیولوژیکی با مشکل مواجه است، ولی برای بعضی از باکتری‌ها مانند استافیلوکک اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و گونه‌های سالمونلا هنوز مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش هم وقت‌گیر بوده و هم قدرت تکرار پذیری پائین دارد، همچنین به سختی استاندارد می‌‌شود.

باکتریوسین تایپینگ براساس تولید پروتئین خاص از باکتری‌ها است که مانع رشد گونه‌های هتروژنیک به باکتری تولید کننده می‌شود و مانند باکتریوفاژ تایپینگ در اجرا و دسترسی به باکتریوسین با مشکل مواجه است، ولی هنوز برای تیپ بندی سودوموناس آئروژینوزا بکار می‌رود، بعلاوه فرض‌های مشابهی برای گونه‌های کاندیدا (کاندیدا آلبیکس) مطرح می‌باشد.

روش‌های تایپینگ بر اساس PCR

PCR یک واکنش بیوشیمیائی در آزمایشگاه است که به ما این اجازه را می‌دهد تا مقدار زیادی از سکانس اسید نوکلئیک هدف را تهیه نمائیم. این روش نیازمند DNA الگو از ارگانیزمی که می‌خواهد تیپ بندی شود، دو جفت پرایمر اولیگو نوکلئوتیدی که از روی کنارهای DNA الگو طراحی می‌شود و DNA پلی‌مراز مقاوم به گرما می‌باشد.

تکنیک‌های تایپینگ سویه‌ها بر اساسPCR جهت تولید چندین باند که انگشت نگاری خاصی برای گونه‌ها یا سویه‌های خاص میکرارگانیزم ایجاد می‌کند، طراحی می‌شود. برخلاف تست‌های تشخیصی که حضور یا حذف میکروارگانیزم (یا اسید نوکلئیک آن) در نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد، آنها می‌بایست چندین باند DNA برای اینکه قدرت تمایز مناسب داشته باشند تولید نمایند و این الگوهای باند در میان ایزوله‌ها قابل تکرار باشند، بطوریکه ایزوله‌هایی که دارای چنین الگوهایی نیستند، از گروه خارج شوند.

 

Multiplex-PCR

همانطورکه قبلاً اشاره شد Multiplex-PCR برای افزایش کارآمدی PCR جهت تایپینگ و شناسائی و کاهش قیمت معرف‌ها طراحی گردید. در این روش چندین جفت پرایمر در یک لوله آزمایش در یک واکنش شرکت می‌کنند. استراتژی کلیدی در این روش طراحی پرایمرها است، بگونه‌ای که دمای annealing این پرایمرها نزدیک به هم باشد تا بتوانند محصولات آمپلی شده با اندازه‌های متفاوت را ایجاد نمایند. اگر محصولات آمپلی شده دارای اندازه‌های یکسانی باشند، شناسائی محصولات به سختی انجام می‌شود. نگرانی بعدی با Multiplex-PCR این است که هنگامی که پرایمرها در یک لوله با هم مخلوط می‌شوند، ممکن است در مراحل آمپلی شدن با یکدیگر تداخل ایجاد کنند، لذا اپتیمایز کردن واکنش بسیار مشکل می‌شود (به خصوص زمانی که تعداد جفت پرایمرها افزایش می‌یابد).

RAPD-PCR و AP-PCR

PCR با پرایمرهای اختیاری و PCR پلی‌مورفیک که به صورت راندم آمپلی می‌شوند خیلی شبیه به هم هستند. در این دو روش پرایمرهای راندم که هدف خاصی را روی DNA الگو ندارند برای آمپلیفیکاسیون مورد استفاده قرار می‌گیرند. کلید اصلیRAPD-PCR وAP-PCR در داشتن درجه حرارت annealing پائین پرایمرها و پرایمرهای با طول کمتر از ۱۰ نوکلئوتید می‌باشد (شکل ۱)، بطوریکه در این دمای پائین به پرایمرها این اجازه داده می‌شود که به نقاط مختلف DNA الگو متصل شوند. آمپلیفیکاسیون در این دو نوع PCR زمانی اتفاق می‌افتد که یک پرایمر در دو جهت مخالف به DNA الگو در نزدیکی هم باند کرده باشند. در این صورت قطعه بین این دو پرایمر سنتز می‌شود. اگرچه این روش نسبت به سایر روشهای تایپینگ مولکولی سریعتر می‌باشد، ولی حساسیت متغیری نسبت به آنها دارد. اگر تغییرات در شرایط واکنش یا معرف‌ها در هنگام    AP-PCR مشخص نباشد نتایج به سختی تکرار می‌شوند و تمایز بین باندها تولید شده مشکل است و تایپینگ سویه یک شیوع با مشکل مواجه می‌شود. ولی اگر شرایط کامل کنترل شود AP-PCR یک ابزار قدرتمند در تمایز (به خصوص زمانی که چندین آمپلیفیکاسیون با چندین پرایمر متفاوت انجام می‌شود) است. همچنین گزارش دهی نتایج AP-PCR بعضی مواقع مشکل است، چرا که تغییرات AP-PCR با حوادث ژنتیکی خاصی در سویه ارتباط پیدا نمی‌کند، بنابراین اگر سویه‌های تیپ بندی شده دارای الگوی قطعات یکسان یا الگوهایی با ۳ یا بیش از ۳ قطعه متفاوت ایجاد نمایند، گزارش‌دهی راحت‌تر خواهد بود، اما هیچ خصوصیات خاصی در هنگامی که یک باند در سویه‌ها تغییر می‌کند، وجود ندارد. در مواقعی که سویه‌های مورد بررسی یک یا دو باند متفاوت از سویه شیوع ایجاد می‌کنند، بعضی اوقات ممکن است یک پرایمر جایگزین استفاده شود یا اینکه شرایط واکنش تغییر داده شود. در برخورد با این مشکلات ضروری است که قدرت تمایز و تکرار پذیری هر پرایمر و پروتکل آمپلیفیکاسیون با مجموعه آنالیزهای ایزوله‌ها که قبلاً توسط مطالعات اپیدمیولوژیکی بدست آمده است، اعتبارسنجی گردند.

 

AFLP

پلی‌مورفیسم طول قطعات آمپلی شده، یک روش تایپینگ می‌باشد که در آن محصول هضم DNA توسط آنزیم‌های محدودالاثر و PCR با هم ترکیب شده‌اند. در روشAFLP ، DNA با دو اندونوکلئاز محدودالاثر متفاوت (معمولاً یک برش فراوان‌تر از دیگری ایجاد می‌کند) برش داده می‌شود. این هضم آنزیمی قطعات زیادی ایجاد می‌کند. برای گزارش‌دهی تنها مجموعه خاصی برای مقایسه ایزوله‌ها بکار می‌رود. زیرمجموعه تولید شده (قطعات حاصل از هضم) را در داخل یک لینکر (Linker) یا آداپتور که دارای سایت‌های برش در انتهای قطعات DNA می‌باشند، قرار می‌دهند. پرایمرهای PCR برای هیبرید با سکانس آداپتور یا لینکر، باقی مانده سکانس سایت برش و یک یا دو نوکلئوتید ناشناخته الگو طراحی می‌شوند. با اضافه شدن هر نوکلئوتید (که به صورت راندم انتخاب می‌شود) در انتهای پرایمرها، تعداد قطعاتی که آمپلی می‌شوند، کاهش می‌یابد. بدنبال PCR، محصولات واکنش ژل الکترفورز می‌شوند و الگوهای باندها مشاهده می‌گردد. این روش واجد مزایای RFLP به همراه مزیت افزایش حساسیت توسط PCR که در تولید پروفایل‌ها هم تکرارپذیر بوده و هم گزارش‌دهی ساده (توسط نرم افزارها مانند Bionumeries) دارند، می‌باشد.

همانند RAPD-PCRو AP-PCR ,AFLPمی‌تواند برای ارگانیزمی که اطلاعاتی از سکانس ژنومی آن نداریم استفاده شود.

PCR-RLFP

درست همانند RE که برای اتصال DNA کروموزمی باکتری بکار می‌رود این آنزیم‌ها اغلب برای شکست آمپلی‌کون‌ها هم بکار می‌روند. انتخاب آنزیم‌های محدودالاثر در PCR-RFLP باید با دقت انجام شود، چرا که محصولات PCR کوچک‌تر از کروموزم باکتری می‌باشند و احتمالاً کمتر دارای سایت‌های برش هستند. انتخاب آنزیم اصولاً به دانش قبلی ما در خصوص سایت‌های برش در محصول PCR بستگی دارد که متغیر هستند و ابزار مفیدی برای مقایسه سویه‌ها می‌باشند. اندازه محصولات PCR و تعداد سایت‌های برش که احتمالاً وجود دارد توانائی تمایز این تکنیک را محدود می‌کند.

آنالیز RFLP عموماً روی rDNA بطور مستقیم انجام می‌شود. هنگامی محصول PCR با اهداف rDNA با RFLP آنالیز شوند آن به تکنیک ریبوتایپینگ PCR بر می گردد. PCR-RFLP برای همه انواع متفاوت میکرارگانیزم‌ها شامل باکتری‌ها و قارچ‌ها قابل استفاده است، بعلاوه برای مقایسه سویه الگوهای PCR-RFLP برای تمایز ارگانیزم‌ها بکار می‌رود. استفاده از این تکنیک در تمایز ارگانیزم‌ها بستگی به استفاده از پرایمرهای خیلی اختصاصی در PCR دارد. برای مثال این تکنیک برای شناسائی باکتری‌های سخت‌گیر مانند گونه‌های بوردتلا، کلامیدیا، مایکوپلاسماها، انگل‌هایی که سخت تشخیص داده می‌شوند (مانند کرم‌های قلابی شکل و فیلرها) استفاده می‌شود. این تکنولوژی در تمایز گونه‌های نوکاردیا که در بالین حساسیت مختلفی به آنتی‌بیوتیک‌های متفاوت نشان می‌دهند، کاربرد فراوان دارد. ژن‌های غیر ریبوزومی که ممکن است برای PCR-RFLP مورد استفاده قرار گیرند عبارتند از: ژن‌های house keeping (مانند ژن rPOB) و هر ژنی که دارای اطلاعات اختصاصی سویه برای گروه خاصی از ارگانیزم‌ها باشد (مانند ژن‌هائی که برای آنزیم هیدرولیز کننده هیپورات در کامپیلوباکتر ژوژنی کد می‌کنند). از نظر اصول این تکنیک مشابه RFLP می‌باشد، با این تفاوت که در اینجا آنزیم‌ها را روی محصول PCR اثر می‌دهیم و بعد با بررسی با انجام ژل الکترفورز، الگوهای متفاوت را مورد ارزیابی قرار می‌دهیم.

REP-PCR
اساس کار Rep-PCR قطعات تکراری DNA در ژنوم پروکاریوت می‌باشد. این قطعات تکراری محلی برای هیبریداسیون پرایمرها بکار رفته در Rep -PCR هستند. پرایمرها که مکمل با سکانس‌های تکراری منتشر می‌باشند بعد از آمپلیفیکاسیون با PCR، قطعات DNA در اندازه‌های متفاوت ایجاد می‌کنند که در الکترفورز از همدیگر جدا می‌گردند. الگوهای الکترفوروتیک برای تعیین ارتباط سویه‌های باکتری‌ها با یکدیگر مورد استفاده قرار می‌گیرند. یک مجموعه پرایمر برای قطعات تکراری متفاوت استـــــــفاده می‌شود. Rep-PCRدر انواع ایزوله‌های اشریشیاکلی انتروهموراژیک (EHEC) جهت اثبات انتقال آنها از حیوان به انسان مورد استفاده قرار گرفته است. این تکنیک همانند سایر تکنیک‌ها در تیپ بندی باکتری‌ها، برای پیگیری باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت که مقاوم به عوامل ضد میکروبی می‌باشند و در اپیدمیولوژی عفونت بیمارستانی مهم هستند، کاربرد دارد، همچنین اطلاعات بدست آمده از Rep-PCR جهت شناسائی میکروارگانیزم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. برای مثال این تکنولوژی در شناسائی ارگانیزم‌ها و ارزیابی تنوع ژن‌های استرپتومایسس و شناسائی گونه‌های بوردتلا بکار رفته است. همچنین برای انواع پاتوژن‌های بیمارستانی مانند اشریشیاکلی، استافیلوکک اورئوس و انتروکوک‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در این تکنیک نواحیی که بین قطعات تکراری قرار گرفته است از نظر اندازه متفاوت هستند، لذا بعد از انجام PCR و الکترفورز الگوهای متفاوت ایجاد می‌کنند که براحتی با مقایسه این الگوها می‌توان سویه‌ها را از یکدیگر تمایز و تشخیص داد. (شکل ۱)

شکل ۱: مراحل مختلف اجرای Rrp- PCR

Variable Number Tandem Repeat (VNTR):
تیپ بندی توالی انتهائی با تعداد متغیر (VNTR) به همراه اسپولیگوتایپینگ (Spoligotyping) برای مایکوباکتریم توبرکلوزیس مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ژنوم این باکتری، نواحی غنی از توالی مستقیم با فاصله تکراری و سکانس‌های غیرتکراری یا الیگونوکلئوتیدهای فاصله انداز (Speacer) قرار دارند (شکل ۲). در اسپولیگوتایپینگ نواحی تکراری محافظت شده به عنوان اهداف پرایمرهای PCR جهت آمپلی کردن سکانس‌های فاصله انداز بکار می‌روند. محصولاتی که با پرایمرهای بیوتین‌دار آمپلی می‌شوند برای هیبریداسیون با یک پانل حاوی الیگونوکلئوتیدهای سنتیتیک (که معرف سکانس‌های فاصله انداز می‌باشد) متصل به غشاء استفاده می‌گردند. محصولات PCR به مکمل خود با سکانس‌های الیگونوکلئوتید باند می‌کنند و پروفایل هیبریداسیون متفاوتی ایجاد می‌کنند که برای ژنوتایپینگ ارگانیزم‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرند.

شکل۲: نمائی از VNTR در ۴ الل

VNTR تایپینگ، شکلی از ژنوم‌های باکتری که دارای سکانس کوتاه، تکراری و tandem می‌باشند را مورد استفاده قرار می‌دهد. تعداد کپی از سکانس‌های VNTR اغلب در میان سویه‌های غیروابسته متفاوت می‌باشد که از روی این خصوصیات می‌توان برای ژنوتایپینگ ارگانیزم‌ها استفاده کرد. اغلب پرایمرهای نشان‌دار با فلورسنت برعلیه این نواحی تکراری کامل طراحی می‌شود. بدنبال آمپلی فیکاسیون، محصولات PCR اغلب با سکانس‌های اتوماتیک جدا می‌شوند و جهت تعیین تعداد نواحی‌های تکراری آنالیز و ارزیابی می‌گردند. بطور تیپیک نواحی با توالی زیاد جهت تعیین ژنوتیپ آنالیز می‌شوند. تعدادی پاتوژن‌های بیمارستانی وجود دارند که می‌توان آنها را با تکنیک VNTR تیپ بندی کرد. (شکل ۳)

شکل ۳: نمای کلی از اجرای تکنیک VNTR
IS-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR:
Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus و سکانس‌های داخل شــــــونده روش‌های تیپ بندی بر اساس PCR هستند که در آنها سکانس‌های حفظ شده و توالی‌های تکراری در باکتری یا در بعضی موارد در قارچ‌ها مشاهده می‌شود. در سال ۱۹۹۱‏، Versalovic و همکارانش به حضور سکانس‌های تکراری در رنج وسیعی از گونه‌های باکتری اشاره کردند که می‌توانند مستقیماً جهت انگشت نگاری ژنوم باکتری مورد استفاده قرار گیرند. سکانس‌های تکراری خاصی شامل سکانس ERIC با ۱۲۷-۱۲۴ جفت باز و سکانس‌های BOX با ۱۵۴ جفت باز می‌باشند. این سکانس‌ها عموماً در سراسر کروموزم به صورت داخل ژنی وجود دارند. بعضی سکانس‌های تکراری به سکانس‌های جدیدی در ژنوم نقل مکان می‌کنند که به آنها ســکانس‌هــای داخـل شـونده (IS) یـا تـرانســپوزون می‌گــــــــــــــــــــــویند. اصــول تیپ بندی IS-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR همانند VNTR می‌باشد که قبلاً توضیح داده شد. در همه این تکنیک‌ها تیپ بندی براساس توزیع راندم قطعات داخل ژنوم است که بر اساس آنها می‌توان ارگانیزم‌ها را از یکدیگر متمایز کرد. یعنی اینکه باکتری‌ها در میزان فراوانی توالی تکراری مختلف هستند و لذا الگوهای متفاوت بعد از انجام PCR با پرایمرهای خاصی در الکترفورز ایجاد می‌کنند. در این تکنیک‌ها پرایمرها طوری طراحی می‌شوند که به قطعات تکراری متصل شوند و فاصله بین دو قطعه تکراری که پرایمرها به آنها متصل شده است را آمپلی می‌کنند، لذا تغییر در ارگانیزم‌های غیروابسته ناشی از تعداد و مکان‌های راندم این عناصر در ژنوم می‌باشد. در جدول زیر بخش‌های تکراری در برخی باکتری‌ها ارائه شده است.
جدول ۱: موتیف‌های تکراری در باکتری‌ها
نام طول (bp) باکتری
پالیندروم تکراری خارج ژنی (REP) 38 اشریشیاکلی، سالمونلا تیفی موریم
Consensus تکراری داخل ژنی انتروباکتریا ۱۲۷-۱۲۴ اشریشیاکلی، سالمونلا تیفی موریم
NgREP 26 نایسریا گونوره
DNREP 192-150 دینیکوکوس رادیودورانس
MXREP 87 میکسوکوکوس گزانتوس
REPMP1 300 مایکوپلاسما پنومونیه
SDC1
۴۰۰ مایکوپلاسما پنومونیه

مقایسه و انتخاب یک تکنیک:
هنگامی که می‌خواهیم یک تکنیک مولکولی جهت تایپینگ یک ارگانیزم بکار ببریم بایستی به این نکته توجه داشته باشیم که آیا این تکنیک به رسیدن به اهداف ما کمک می‌کند و آیا به سؤالات ما پاسخ می‌دهد؟ در یک بیمار خاص، کاربرد ویژگی‌های مولکولی در جداسازی عود از آلودگی مجدد یا در موارد باکتریمی (آیا این ناشی از آلودگی می‌باشد یا ناشی از عفونت سایر نقاط بدن) به ما کمک زیادی می‌کنند. مثلاً PFGE می‌تواند در یک گروه در اثبات ارتباط کلونی که در ارزیابی انتشار ارگانیزم از یک فرد به فرد دیگر مهم است، کمک کننده باشد. هنگامی که به انتشار ژن یا ژن‌های مقاومت خاص مشکوک هستیم، آنالیز پلاسمید یا ترانسپوزون موجود در سویه‌ها کمک کننده هستند. از آنجائیکه استفاده از تکنیک‌های مولکولی جهت تیپ بندی باکتری‌ها هزینه‌بر و وقت‌گیر می‌باشند، لذا بایستی همیشه یک دید مناسب در محدودیت‌های روش‌های تایپینگ مولکولی مختلف وجود داشته باشد تا بتوان به طور کامل و مناسب باکتری‌ها را تیپ بندی کرد. هنگامی که روش‌های مولکولی متفاوت را با همدیگر مقایسه می‌کنیم، بایستی این نکته مهم را توجه داشت که هر روش واقعاً چه چیز را ارزیابی می‌کند؛ مثلاً الگوهای قطعات برش خورده در PFGE نشان دهنده تفاوت بین فراوانی سایت‌های برش در طول کروموزم می‌باشند، بنابراین هرگونه تغییر در کروموزوم که روی این سایت‌های برش اثر می‌گذارند سبب بوجود آمدن الگوهای متفاوت می‌شوند و چون در ارگانیزم‌های مختلف این سایت‌ها متفاوت هستند به راحتی ایزوله‌ها را می‌توان از همدیگر افتراق داد. PFGE که حدود ۹۰% از کرموزوم را اسکن می‌کند (مجموعه اندازه‌های قطعات برش خورده) دارای حساسیت متوسط می‌باشد، چرا که تغییرات ژنتیکی کوچک ممکن است در آن قابل جداسازی نباشد. برعکس روش‌های مبتنی بر PCR عموماً نواحی نسبتاًًًً محدودی (کمتر از ۱۰% کروموزمی) را شامل می‌شوند و مجموعه اندازه قطعات آمپلی شده را نشان می‌دهند. از آنجا که محصولات PCR عموماً کوچک هستند (برابر یا کمتر از ۵ کیلوباز) آنالیز الکتروفوروتیک آنها حتی تغییرات ژنتیکی کوچک را که در اندازه محصول PCR اثر می‌گذارند، جداسازی می‌نمایند. باید توجه داشت اگر تغییرات در کروموزم خارج از قطعه مورد نظر باشد، قابل جداسازی نیست.
بعضی از قطعات ژنتیکی در پاتوژن‌های بیمارستانی از یک فرد بیمار به فرد بیمار (سالم یا دیگر؟) منتقل می‌شود. با PFGE می‌توان تغییرات کروموزمی قابل جداسازی تکی که به صورت تغییر در حداقل دو جای باند مشاهده می‌شود را جداسازی کرد. روش‌های PCR حداقل تفاوت یک جا را (مانند حذف یا از دست دادن یا شیف در حرکت الکترفوروتیک یک باند) جداسازی می کنند. اگر اختلاف ژنتیکی با یکدیگر تفاوت زیادی داشته باشند می‌توان نتیجه گرفت که این ایزوله‌ها از همدیگر متفاوت هستند.
امروزه بانک‌های اطلاعات مختلفی در دسترس می‌باشد که تغییرات بسیار جزئی در ژن یا پروتئین‌ها را در خود دارند و می‌توان در بررسی اپیدمیولوژی عفونت‌ها به خصوص عفونت‌های بیمارستانی از آنها استفاده کرد.

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی