معماری

نورترن بلاتینگ

از آنجا که RNA به سختی به کاغذهای نیتروسلولزی متصل می‌شود، از روش ساترن نمی‌توان برای مولکول‌های RNA استفاده کرد (۲۱). برای انتقال مولکول‌های RNA از روشی بنام نورترن ‌بلاتینگ استفاده می‌شود. اساس این روش مشابه روش ساترن ‌بلاتینگ است (۱۹-۲۱)، با این تفاوت که در آن از کاغذهای فعال شده یا کاغذهای DBM، استفاده می‌شود (۱۵). این کاغذها را می‌توان به راحتی با تیمارهای شیمیایی خاصی از کاغذ صافی تهیه کرد (۱۲). در این روش، به علت تک رشته‌ای بودن RNA و تفکیک آن بر روی ژل واسرشت کننده نیازی به مرحله مجاورت با هیدرکسید سدیم نمی‌باشد. در ضمن به علت حساس بودن مولکول‌های RNA دقت بیشتری در انجام مراحل لازم است (۱۶).

کلید واژه: نورترن بلاتینگ، بلاتینگ، ژل پلی‌اکریل‌امید

 

بلاتینگ چیست؟

بلاتینگ روشی است برای جدا کردن DNAیا RNAیا پروتئین بر روی یک ماده‌ی ناقل که عموماً از ژل الکتروفورز استفاده می‌شود (۱). تکنیک وسترن بلاتینگ برای آنالیز پروتئین، ساترن بلاتینگ برای آنالیز DNA و نورترن بلاتینگ برای آنالیز RNA استفاده می‌شود (۲).

نورترن بلاتینگ

نورترن بلاتینگ تکنیکی است که در ردیابی توالی خاص RNAکاربرد دارد. این تکنیک توسط جیمز آلوین و جوج استارک در دانشگاه استندفورد در سال ۱۹۷۹ ابداع شد. نام این روش به صورت متضاد از نام ساترن بلاتینگ گرفته شده است (۳).

 

مراحل پیش از انجام آزمایش نورترن بلاتینگ :

آماده کردن ژل آگاروز

ما در این روش نیازمند ژل آگاروز ۲/۱% به میزان ۳۵۰ میلی‌لیتر می‌باشیم که برای این کار مقدار ۲/۴ گرم ژل اگاروز را در مقدار ۵/۳۰۴ میلی‌لیتر آب حل می‌کنیم، سپس تا دمای°C 60 گرم کرده و در نهایت به میزان ۳۵ میلی‌لیتر از ۱۰x MOPS و ۵/۱۰میلی‌لیتر بافر فرمالدهید ۳۷% به آن اضافه می‌کنیم (۳).

آماده کردن پرمیکس:

  • ۵ ml of 10x MOPS running buffer
  • ۷۵ ml of 37% formaldehyde
  • ۲۵ ml of formamide.

 

آماده کردن نمونه RNA:

  • ۷۵ ml of premix
  • RNA (0.5 to 10 mg)*
  • water to 50 ml

*اگر نمونه ما از نظر درصد MRNA بالاتر از ۰۵/۰> باشد از MRNA توتال سرمی استفاده می‌شود ولی اگر میزانMRNA کم باشد می‌توان از POLY(A) استفاده کرد، سپس در دمای ۵۵ درجه به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه می‌کنیم. سپس ۱۰ میکرولیتر از فرمالدهید به هر نمونه اضافه می‌کنیم و در ولتاژ۱۰۰ تا ۱۲۰ ولت به مدت ۳ ساعت قرار می‌دهیم. پس از آن ژل را از تانک درمی‌آوریم و در SSC به مدت ۴۵ دقیقه قرار می‌دهیم (۵).

 

مراحل نورترن بلاتینگ:

نمونه RNA از خیلی از بخش‌های زیستی مانند بافت‌های مختلف گرفته می‌شود. نمونه RNA بر روی ژل گذاشته می‌شود و نمونه‌ها بر اساس سایزشان بعد از انجام الکترفورز مشخص می‌شوند (۶). ژل بر روی یک ورقه از جنس نایلون یا نیتروسلولز که به روش ساندویچ قرار داده شده است بلاتینگ می‌شود، سپس پروب را که با مواد‌ی که اشعه رادیوگرافی ساطع می‌کنند یا با مواد کمی‌لومینسانس نشانه‌گذاری شده‌اند و از خود نور ساطع می‌کنند را در اتاقک تاریک قرار می‌دهیم و جواب را بر روی فیلم X-ray مشاهده می‌کنیم (۷).

 

شناسایی microRNAs توسط نورترن بلاتینگ

microRNAs که از سلول‌های مختلف میزبان و ویروس‌ها منشأ می‌گیرند نقش مهمی در سیکل عفونت ایفا می‌کنند. شناسایی microRNAs و اینکه چه اثری بر میزبان خود دارند اساساً با روش نورترن ‌بلاتینگ انجام می‌شود (۸). همانطور که گفته شد روش نورترن ‌بلاتینگ سبب جداسازی microRNAs از نظر سایز می‌شود و می‌تواند اطلاعات جامعی از سایز و ساختمان اصلی آن بدهد، بنابراین می‌تواند یک وسیله باارزش برای کشف و شناسایی انواع جدید microRNAs باشد (۱۰ )

روش حساس نورترن‌ بلاتینگ با استفاده از مواد غیر رادیواکتیو برای شناسایی microRNAs

ادامه داشتن شناسایی RNAهای کوچک (small RNAs) فعال نیازمند آن است که میزان دقیق درصد و اندازه‌ی آنها با یک روش دقیق شناسایی شود (۱۲). امروزه نورترن‌ بلاتینگ به صورت گسترده به عنوان یک روش مرجع برای شناسایی small RNAs مورد استفاده قرار می‌گیرد. در تکنیک جدیدی که ارائه شده است نوعی از بلاتینگ که بر اساس پروتکل نورترن بلاتینگ برای small RNAs می‌باشد جهت small RNAs با طول ۱۵-۴۰ باز استفاده می‌شود (۱۳). در این تکنیک از دایگوگسین که با الیگونوکلوئیک اسید و ۱-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) برای اتصال با RNA استفاده شده است.

این روش به طور مشخص برای شناسایی RNAها با طول کمتر از ۰٫۰۵FMOL مورد استفاده قرار می‌گیرد که چند ثانیه بعد از مواجه شدن غشا با ماده نشاندار شده که در بالا ذکر شد می‌تواند از خودش نور در محفظه تاریک ساطع کند و این روش ۱۰۰۰ بار تولید نور را بهبود بخشیده است. در مقایسه با روش اصلی که خیلی خطرناک است و نیازمند نمونه تازه می‌باشد این روش خیلی ارزان‌تر است و نسبت به محیط زیست کمتر آسیب‌زا بوده و بسیار دقیق‌تر می‌باشد (۱۴).

 

مزیت‌های نورترن بلاتینگ

  • روشی استاندارد در مورد مطالعه میزان بیان ژن MRNA
  • شناسایی میزان سایز MRNA
  • مطالعه بر روی اسپلایسینگ RNA
  • مطالعه بر روی نیمه عمر RNA
  • اغلب برای تأیید و چک کردن موش‌های ترانش‌ژنیک و ناک‌اوت شده استفاده می‌شود.
  • می‌تواند برای پروب‌های ناقص استفاده شود.
  • غشا می‌تواند ذخیره شود و سا‌ل‌ها بعد دوباره بازبینی و همچنین دوباره پروب‌گذاری شود..

 

معایب نورترن‌ بلاتینگ:

۱-شناسایی چند پروبی مشکل است.

۲-اگر نمونه ما حتی به میزان اندک با آنزیم RNAase آسیب ببیند کیفیت جواب‌ها و میزان بیان‌ها دچار مشکل منفی کاذب می‌شوند.

۳-روش استاندارد نورترن ‌بلاتینگ حساسیت کمتری نسبت به روش‌های دیگر مثل RT-PCR دارد.

 

 

References:

  1. Ghildiyal,M. and Zamore,P.D. (2009) Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat. Rev. Genet., 10, 94–۱۰۸٫
  2. Li,Z., Kim,S.W., Lin,Y., Moore,P.S., Chang,Y. and John,B. (2009) Characterization of viral and human RNAs smaller than canonical MicroRNAs. J. Virol., 83, 12751–۱۲۷۵۸٫
  3. Varallyay,E., Burgyan,J. and Havelda,Z. (2008) MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat. Protoc., 3, 190–۱۹۶٫
  4. Holtke,H.J. and Kessler,C. (1990) Non-radioactive labeling of RNA transcripts in vitro with the hapten digoxigenin (DIG); hybridization and ELISA-based detection. Nucleic Acids Res., 18, 5843–۵۸۵۱٫
  5. Ramkissoon,S.H., Mainwaring,L.A., Sloand,E.M., Young,N.S. and Kajigaya,S. (2006) Nonisotopic detection of microRNA using digoxigenin labeled RNA probes. Mol. Cell Probes, 20, 1–۴٫

۶-Kornberg, A., Baker, T. A., DNA Replication. (2nd ed.) pp 15, W. H. Freeman & Co. (1992)

۷-Sobel, R., Dubitsky, A., Brickman, Y. (2002), Genetic Engineering News, 23, 2.

۸-Southern, E. M., (1975) J. Mol. Biol. 98:503-51

۹-Voet, D., Voet, J. Biochemistry. (vol. 1, 3rd ed.), pp 110-112, John Wiley & Sons Inc. (2004).

۱۰-Jump up to: a b c Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538–۵۳۹٫

۱۲- Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277–۲۷۹٫

۱۳- Jump up to: a b c d e Schlamp, K.; Weinmann, A.; Krupp, M.; Maass, T.; Galle, P. R.; Teufel, A. (2008). “BlotBase: A northern blot database”. Gene 427 (1–۲): ۴۷–۵۰٫ doi:10.1016/j.gene.2008.08.026. PMID ۱۸۸۳۸۱۱۶٫

۱۴- b c d e Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–۵۸۹٫

۱۵- Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes”

حمیدرضا جهان‌تیغ، دانشجوی کارشناسی ارشد ایمنولوژی

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی

پاسخ دهید