معماری
آزمایش انعقادی

کنترل کیفی آزمایشات انعقادی (تست های انعقادی)

کوآگولومتر

کلیات: زمانی که بیمار با خونریزی به پزشک مراجعه می‌کند چندین تست غربالگری جهت تشخیص و طبقه‌بندی این اختلالات مورداستفاده قرار می‌گیرد که معروف‌ترین این تست‌ها تست PT و PTT است. در آزمون PT مسیر انعقاد خارجی و مشترک (فاکتورهای ۱، ۲، ۵، ۷،۱۰) را کنترل می‌کنیم؛ البته از آزمون PT برای مانیتورینگ داروهای ضدانعقاد خوراکی مثل وارفارین یا کمادین نیز استفاده می‌شود. آزمون PTT مسیر انعقاد داخلی را چک می‌کند؛ البته برای مانیتورینگ مصرف هپارین نیز از آزمون PTT استفاده می‌شود. تست PT و PTT و سایر تست‌های انعقادی را می‌توان با روش دستگاهی نیز انجام داد که برای این کار از دستگاه کوآگولومتر استفاده می‌شود، ولی چون روش دستی هنوز مورد تأئید WHO می‌باشد و جواب کوآگولومترها همیشه درست نیست و بعضاً جعلی نیز هست از این روش نیز یاد می‌کنیم.

 

مکانیسم دستگاه‌های آنالایزر انعقاد خون

آنالایزرهای انعقاد خون کامل برای پایش انعقاد از یکی از چند روش زیر استفاده می‌کنند؛ ایمپدانس، فتومتری، الکترومغناطیس و روش ایمپدانس مکانیکی که از تغییرات ویسکوزیته خون جهت تعیین زمان تشکیل لخته استفاده می‌شود. یک پروب ارتعاشی در نمونه قرار داده می‌شود که بر اساس کشش ویسکوزیته نمونه حرکت می‌کند. وقتی‌که تشکیل لخته آغاز می‌گردد، کشش افزایشی پیدا کرده و باعث تغییر در حرکت پروب می‌شود که توسط ترانس دیوسرها به تغییرات الکتریکی تبدیل می‌گردد. یک نمایشگر دیجیتالی زمان سپری شده از زمان ورود پروب تا تشکیل لخته را نشان می‌دهد.

ابزارهایی که از روش فتومتریک استفاده می‌کنند معمولأ از یکی از مکانیسم‌های زیر بهره می‌برند:

  • Scattered Light Detection for Clotting Assay: کدورت حاصل از تشکیل لخته فیبرین اندازه‌گیری می‌شود؛ بدین ترتیب که شدت نور متفرق شده به علت لخته اندازه‌گیری می‌گردد. طول‌موج نور معمولاً ۶۶۰ است.
  • Transmitted Light Detection for Chromogenic Assay: ترکیبات رنگی می‌توانند جذب نوری را تغییر دهند که این تغییرات نور گزارش می‌شود و زمان تغییرات در جذب نور برحسب دقیقه حساب می‌شود.
  • Transmitted Light Detection for immune Assay: واکنش Ag-Ab می‌تواند سبب تغییر در جذب نور شود. این تغییر در جذب نوری برحسب دقیقه محاسبه می‌شود.
  • Nephlometry

ابزارهایی که از روش فتومتریک استفاده می‌کنند تغییر در دانسیته نمونه را تا تعیین شروع لخته پایش می‌کنند. نمونه در یک کووت قرار داده می‌شود و یک اشعه نور که توسط Collimator فوکوس شده است از میان نمونه تا فتودتکتور عبور داده می‌شود. هنگامی که لخته تشکیل می‌شود، فتودتکتور افزایش دانسیته نوری را با اندازه‌گیری کاهش Transmittance تعیین کرده و سیگنال‌ها شروع پروسه تشکیل لخته را مشخص می‌کنند.

برخی دستگاه‌ها از ترکیب روش ایمپدانس مکانیکی و فتومتریک استفاده می‌کنند (تکنیک فتومتریک وقتی که لخته تشکیل می‌شود ایمپدانس الکتریکی را تعیین می‌کند). کاربر نمونه را در قسمت مخصوصی قرار می‌دهد که خون را با فواصل مشخص برنامه‌ریزی‌شده بالا کشیده و به‌صورت قطره‌قطره برمی‌گرداند. وقتی که لخته تشکیل شد، رشته‌های فیبرینی در قسمتی از دستگاه تجمع پیدا کرده و باعث کم شدن سرعت پائین آمدن خون می‌شود، توسط یک سیستم نوری زمان سپری شدن برای عبور نور تا قطع آن اندازه‌گیری می‌شود. کمتر از ۳۰ میلی‌ثانیه تغییر در سرعت پائین آمدن برای تعیین لخته احتیاج است. در تکنیک الکترومغناطیس برای بدست آوردن زمان End Point Clotting با یک آنالیز Depth Graphic از تشکیل لخته و واکنش‌های عوامل تشکیل لخته استفاده می‌شود. برای تعیین یک End Point Clotting یک آهن‌ربا و لوله آزمایش در مسیر یک دتکتور مغناطیسی طوری ثابت شده است که با چرخش لوله آزمایش موقعیت آن‌ها نسبت به هم تغییری نمی‌کند. وقتی که لخته تشکیل می‌شود آهن‌ربا را گرفتار می‌کند و باعث قطع ارتباط الکترومغناطیس می‌شود.

برای ترمیم شکل‌گیری لخته و لیز آن، آنالایزر از یک پیستون که با سیم پر شده است و در اطراف نمونه خون که در کووت است و غوطه‌ور شده، استفاده می‌کنند. کووت با حرکت نوسانی حرکت داده می‌شود و هنگامی که لخته تشکیل شد پیستون از میان ویسکوزیته به وجود آمده حرکت می‌کند. حرکت پیستون به‌وسیله یک سنسور مغناطیسی به سیگنال‌های الکتریکی تبدیل می‌شود، سپس این سیگنال‌ها به‌وسیله کامپیوتر تفسیر گردیده و پارامترهای هموستاز بیمار، شاخص‌های فیبرینولیتیک و انعقاد را ترسیم می‌کند. در روش جدید، محفظه‌ای شامل ۴ بویین که یک کووت ساچمه‌دار را احاطه نموده است وجود دارد. با شروع روند لخته‌سازی، ساچمه درون کووت به حرکت درآمده و پس از انجام روند لخته‌سازی و انعقاد با ایستادن ساچمه از حرکت، روند انعقاد کامل فرض گردیده و زمان شروع و خاتمه حرکت ساچمه بیانگر زمان روند انعقادی می‌باشد. این روش در دستگاه‌هایی چون Stago فرانسه دیده می‌شود.

 

کنترل کیفی:

نتایج PT و APTT توسط یکسری عوامل پس از آنالیز همچون نحوه جمع‌آوری نمونه، خصوصیات سطحی ظرف نمونه‌برداری، نوع ضدانعقاد مصرفی، نحوه ذخیره‌سازی نمونه و عوامل آنالیتیک همچون دما، زمان انکوباسیون، زمان تماس با ماده فعال‌کننده سطحی، نوع معرف‌ها و نحوه بررسی اتمام کار تحت‌تأثیر قرار می‌گیرند.

 

نمونه‌گیری:

  • نمونه‌گیری باید توسط یک فرد باتجربه و در شرایط آرامش کافی گرفته شود زیرا استرس و تمرین بدنی (ورزش) باعث افزایش فاکتور ۸ و Vwf و فیبرینولیز می‌شود.
  • نمونه‌گیری باید ساده باشد و بدون فشار سرنگ از خون پر شود. انسداد رگ سبب آزاد شدن پلاکت، افزایش فعالیت فیبرینولیتیک و فعال شدن بعضی از فاکتورهای انعقاد می‌شود.
  • گرفتن نمونه از Line و کاتتر ممنوع است؛ به علت رقیق شدن نمونه و تداخل با هپارین.
  • برای به حداقل رساندن اثرات فعال شدن تماسی، باید سرنگ مورداستفاده از پلاستیک باکیفیت بالا، پلی‌پروپین و یا سرنگ شیشه‌ای پوشیده توسط سلیکون باشد.
  • اگر بیمار تست‌های دیگری غیر از تست انعقادی دارد باید نمونه برای تست انعقادی لوله دوم یا سرم باشد.
  • خون باید در زمان نمونه‌گیری با ضدانعقاد مخلوط شود و سپس چند بار لوله سروته شود. برای تست‌های انعقادی اورژانس باید نمونه را روی یخ گذاشت و به آزمایشگاه ارسال نمود.
  • نمونه‌گیری باید سریع، تمیز با سرنگ و نیدل مناسب (g21) انجام شود. اگر قبل از خشک شدن الکل اقدام به نمونه‌گیری شود همولیز ایجاد می‌شود و نمونه فاقد ارزش است.
  • نمونه مورداستفاده برای تست انعقادی قبل از جدا کردن پلاسما، نباید در یخچال بماند.
  • برای اکثر تست‌های انعقادی لازم است پلاسما در کمتر از یک ساعت پس از نمونه‌گیری از گلبول‌ها جدا گردیده و به‌سرعت آزمایش شود (برای فاکتورهای ناپایدار باید زودتر این کار صورت گیرد). ماندن پلاسما در حرارت اتاق باعث تخریب فاکتورهای انعقادی و کاهش فعالیت آن‌ها می‌شود.
  • پلاسما پس از جدا شدن بایستی در لوله درب بسته در یخچال نگهداری شود. در صورت بازماندن درب ظروف محتوی پلاسما، تغییر PH باعث تخریب فاکتور انعقادی و ایجاد خطا می‌گردد.
  • بهترین زمان برای نمونه‌گیری تست انعقادی AM 6 است ولی نمونه‌گیری بستگی به رژیم دارویی (ضد انعقاد) مریض دارد. در کتاب هنری ۲۰۰۷ به نقل از NCCLS آمده است: نمونه جدا شده PT برای مدت ۲۴ ساعت و در مورد PTT برای مدت ۴ ساعت در دمای اتاق پایدار است. البته می‌توان پلاسما را جدا کرد و در ۲۰- نگه داشت وتا دو هفته PT را انجام داد و در ۷۰- درجه تا چهار هفته می‌توان این کار را انجام داد.

 

ضد انعقاد:

  • ضد انعقاد برای تست‌های انعقادی تری‌سدیم سیترات gr/L32 (gm10/0) است. بقیه ضد‌انعقادها پذیرفتنی نیست. فاکتور ۵ و ۸ در اگزالات ناپایدار است و هپارین و EDTA نیز مکانیسم انعقاد را مختل می‌کنند. مزیت دیگر تری‌سدیم سیترات این است که Ca به‌صورت سریع در سیترات خنثی می‌شود.
  • برای تست‌های انعقادی روتین، ۹ حجم از ضدانعقاد مخلوط می‌شود (۵۵/۰ میلی‌لیتر برای cc5 نمونه). اضافه شدن خون به ضدانعقاد باید در یک دقیقه صورت بگیرد و بعد از اضافه شدن باید حداقل ۴ بار لوله به‌آرامی تکان داده شده و سروته شود.
  • به علت غیرنرمال شدن هماتوکریت در آنمی شدید و پلی‌سیتمی، حجم ضدانعقاد باید از طریق فرمول زیر اصلاح شود:

۵/۴ خون ml حجم سیترات لازم جهت =

 

سانتریفیوژ نمونه:

  • اکثر تست‌های انعقادی روی پلاسما (PPP) انجام می‌شود که به‌وسیله سانتریفیوژ در دور g2000 برای ۱۵ دقیقه و در cº۴ تهیه شده است. نمونه برای PT ، ضدانعقاد لوپوس (LAC) و اندازه‌گیری فاکتور ۷ (هفت) باید در دمای اتاق باشد و باید ظرف ۲ ساعت انجام شود.
  • برای تست عملکرد پلاکت، LAC و Activated PC resist (APCR) باید سانتریفیوژ در دمای اتاق باشد. برای LAC و APCR مهم است که میزان پلاکت زیر ۱۰۴ باشد، لذا باید پلاکت‌ها را توسط دو بار سانتریفیوژ کردن و یا استفاده از فیلتر mµ ۲/۰ جدا کرد.
  • سانتریفیوژ مورداستفاده برای تست انعقادی باید کالیبر باشد و تمام معیارهای لازم که در کنترل کیفی سانتریفیوژ آمده است را دارا باشد.

 

حمل نمونه‌ها و محلول‌ها Handling of samples and reagent:

  • همه نمونه‌های پلاسما باید تا زمان انجام در لوله پلاستیکی یا شیشه سلیکونی و در دمای C º۴ قرار بگیرند، به جز پلاکت و Cold activation of VII factor.
  • پیپت کردن باید توسط پیپت‌های با سطح غیرترشونده (Disposable) و یا سمپلرهای با نوک غیرترشونده انجام شود.
  • همه لوله‌ها و ظروف باید یک‌بار مصرف باشد ولی اگر مجبور شدید از لوله چندبار مصرف استفاده کنید باید لوله‌ها را با اسید کرومیک و مایع شوینده مانند Decan90 20% تمیز نمایید.

 

نکات قابل‌توجه هنگام انجام تست‌های PT و APTT

  • دستورالعمل تولیدکنندگان: این دستورالعمل‌ها باید همراه کیت باشد و کاملاً می‌بایست از آن‌ها پیروی کرد.
  • تغییرات قابل‌قبول: خطاهای آنالیتیکال در اثر عوامل تداخلی می‌توانند روی نتایج PT اثر بگذارند. با توجه به این خطاها (آنالیتیکال) جهت قابل‌قبول بودن نتایج می‌بایست میزان CV روزانه کمتر از ۵% باشد.
  • خصوصیات آب مورداستفاده: آب مورداستــــفاده می‌بایست شرایط موجود در NCCLS (C3-A2) را دارا باشد.
  • غلظت یون کلسیم: غلظت یون کلسیم می‌بایست طبق دستورالعمل سازنده باشد ولی معمولاً غلظت استفاده در تست انعقادی ۰۲۵/۰ مولار می‌باشد.
  • شرایط وسایل مورداستفاده: درصورتی‌که نتایج کنترل‌ها خارج از محدوده تعیین‌شده باشد می‌بایستی همگی مراحل شامل معرف‌ها، پلاسمای کنترل و وسایل از لحاظ کارایی ارزیابی شوند.

 

جمع‌آوری، حمل‌ونقل و نگهداری پلاسمای کنترل:

  1. استفاده از استانداردهای مرجع بین‌المللی که برای بعضی از فاکتورها موجود است جهت کنترل و کالیبره تست انعقادی ارجحیت دارد.
  2. در صورت عدم دسترسی به استاندارد بین‌المللی می‌توان پلاسمای خون ۲۰ فرد نرمال (ترجیحاً مرد ۴۰-۲۰ ساله نرمال و بدون مشکل انعقادی ولی اگر زن باشد باید داروی ضدحاملگی استفاده نکند) را با هم mix کرد (۲۰ نفر برای داشتن فعالیت انعقادی ۱۰۰% می‌باشد ولی می‌توان این تعداد را بنا به شرایط به ۵ نفر نیز کاهش داد) و بعد از چک کردن از نظر آلودگی به کار برد. البته لازم است پلاسمای تهیه‌شده با استانداردهای رفرنس بین‌المللی از نظر صحت چک شود (روش آن در کتاب Dacie آمده است).
  3. باید برای بدست آوردن عدد Pooled Serum حداقل ۲۰ بار روی آن با روش مرجع PT و TT انجام داد و بعد آن را در ۷۰- فریز کرد.
  4. اگر پلاسمای کنترل توسط آزمایشگاه تهیه شود می‌بایست همانند پلاسمای مورداستفاده درست‌ با آن عمل شود یعنی از همان ضدانعقاد و به همان میزان به خون افزوده شود و شرایط حمل و نگهداری آن مشابه پلاسمای بیماران باشد.
  • تفاوت انجام تست‌های کنترل: کنترل را می‌بایست در روز ابتدای انجام آزمایش و یا در حین آزمایش انجام داد. همچنین با تغییر ویال مصرفی و یا تغییرات اساسی در وسایل (مثل تغییر سمپلر، پیپت) می‌بایست کنترل مجدداً انجام بگیرد. در صورت بالا بودن حجم کاری آزمایشگاه می‌بایست حداقل پس از هر ۴۰ تست، یک‌بار کنترل گذاشت (یک کنترل نرمال و یک کنترل غیرطبیعی).
  • تکرارپذیری تست دوتایی:NCCLS می‌گوید: میزان تفاوت نتایج دوتایی بین دو کنترل نباید بیش از ۱۰% باشد، البته نظر آزمایشگاه رفرنس ایران (پائیز ۸۶) نیز همین است. بعضی از مراجع میزان تفاوت مجاز جواب‌ها بین دو بیمار باسابقه مصرف وارفارین جهت آزمایش PT را حداکثر ۱ ثانیه و برای بیماران بدون مصرف ضد انعقاد، ۵/۰ثانیه می‌دانند.
  • محدوده مرجع: محدوده مرجع می‌بایست طبق سند C28-A NCCLS در آزمایشگاه تعیین شود. طبق توصیه آزمایشگاه رفرنس ایــــــــــران، برای تعییـن محدوده مرجع کنترل یا Pooled Plasma، نمونه تهیه‌شده، ۲۰ بار آزمایش شود و سپس میانگین و انحراف معیار نتایج محاسبه شود. محدوده مورد انتظار Mean ±۲SD است.

 

کنترل کیفی عمومی:

نتایج کنترل کیفی می‌بایست هر روز توسط افراد ورزیده از جهت بررسی Shift نتایج کنترل یا اعداد خارج از محدوده کنترل بررسی شود. نگهداری تمامی محلول‌ها و وسایل می‌بایست طبق توصیه سازندگان دستگاه صورت گیرد.

همچنین نتایج کنترل کیفی می‌بایست حداقل ماهی یک‌بار بازنگری شوند تا نتایج از نظر تغییرات بلندمدت نیز بررسی گردند. آزمایشگاه می‌بایست در برنامه‌های کنترل کیفی که توسط سازمان‌های معتبر تدارک دیده می‌شود، مستمراً شرکت جوید. همچنین می‌بایست شماره سریال تمامی معرف‌ها و مواد مصرفی نیز در محل مطمئنی ثبت گردد.