RT-PCR

 همانطور که از معنی واژه بر می آيد مفهوم Real-time PCR   مشاهده لحظه به لحظه يک فرايند می باشد. مشکلات و نواقص عديده موجود در End point PCR همراه بانياز به يک روش تعيين کمی دقيق زمينه گشايش عرصه ای نوين در تکنيک PCR گرديد. با استفاده از این تکنیک می توان بررسی های کیفی و کمی را با بیشترین دقت و در زمانی کوتاه تر نسبت به Conventiona PCR انجام داد.

 مزاياي روش Real-time PCR:

1) تكثير در هر زمان قابل مشاهده مي باشد. به عبارتي امكان مانيتورينگ لحظه به لحظه واكنش فراهم آمده و در هر سيكل امكان بررسي فرآيند تكثير وجود دارد.

2) امكان بهينه سازي واكنش وجود دارد بطوري كه مناسب ترين غلظت DNA و پرايمر و همچنين تعداد سيكل لازم برای تکثير  مشخص مي شود.

3) امكان قطع واكنش در زمان دلخواه: از آنجايي كه روند PCR قابل مشاهده است. درصورت عدم تكثير ويا رفتن به فاز سكون (Plateau) مي توان به واكنش خاتمه داده و از اتلاف وقت و انرژی پرهيز نمود.

4) انجام PCR كمي : با استفاده از روش Absolute Quantification و Relative Quantification ميزان دقيق و نسبي الگوي اوليه قابل اندازه گيري است.

5) معمولا˝واكنشها سريعتر اتفاق افتاده و زمان كمتري لازم است.

6) محدودة تشخيص آن (Detection Range) بالاتر از PCR معمولي بوده و حتي اختلاف كمتر از 2 برابر را هم نشان مي دهد.

كاربردهاي Real-Time PCR:

1) بررسی بيان ژنها:  كاربرد وسيع آن در مورد بيان سايتوكاين هاي مختلف بخصوص در مورد بيماري هاي خود ايمني و پاتوژنهايي نظير ليشمانيا مي باشد.

2) Drug Therapy Efficacy:  براي اين منظور يك ژن خاص (البته اين ژن عامل بيماري نيست و بعنوان ماركر تلقي مي شود) درنظر گرفته شده و اثر داروي موردنظر بر تغييرات بيان اين ژن بررسي مي شود . تغيير بيان اين ژن نشان دهنده وضعيت درمانی می باشد.

3) بررسي ميزان بيان آنزيم هاي كبدي براي متابوليزه كردن داروي خاص: بطور كلي اثر داروها بر روی  آنزيم هاي كبدي به دو صورت است. گروهي بيان آنزيمهاي تجزيه كننده داروها را افزايش داده و گروه ديگر باعث مهاراين آنزيمها مي شوند. براي داروهاي دسته اول مقدار دارو درخون كاهش مي يابد و در نتيجه به دوز دارويي بالاتري نياز است ولي دردسته دوم دارو تجزيه نشده و در نتيجه مقدار كمتري دارو موردنياز است.

4) كابرد در جهت  شناسايي و تعيين  Load عوامل عفوني :حساسيت به مراتب بالای اين تکنيک  امکان تعيين ميزان دقيق  يک پاتوژن را  مهيا کرده است. تعيين ميزان دقيق  عواملی مثل HIVوHBV در درمان افراد آلوده دارای ارزش می باشد.

5) در سيستم هاي كنترل غذا و دارو براي  Food Safety: نمونه موردنظر از نظر ميزان آلودگي ميكروبي با نمونه كنترل مقايسه مي شود.

6) بررسي سرطان هاي خوني و تعيين خطر بازگشت آن: حساسيت اين روش ، تشخيص 1 سلول سرطاني از ميان 105 سلول سالم است كه تشخيص قبل، درحين و بعد از درمان قابل انجام است.

7)در تعيين ميزان موفقيت پيوند اعضاء : هر فرد شاخص هاي ايمونولوژيك ويژه اي دارد. با بررسي اين شاخص ها در فرد دهنده و گيرنده، قبل و بعد از پيوند و مقايسه آنها باهم ميزان موفقيت پيوند مشخص مي شود. درصورت موفقيت پيوند بايد شاخص هاي فرد دهنده درعضو پيوندي پس از پيوند بيشتر باشد.

8) ژن درماني: در اين حالت براي تعيين دوز وكتورحاوی ژن مورد نظر در ژن درمانی يا Copy Number آن و ارزيابي اينكه وكتور وارد چه سلولها يا بافتي شده است از Real -Time PCR استفاده مي شود.

9) ژنوتايپينگ : متداولترين كاربرد آن تشخيص قبل از تولد، تشخيص قبل از لانه گزيني، تعيين  زيرمجموعه (subtype) ويروسها و باكتريها مي باشد. در ژنوتايپينگ از مدل اختصاصي (specific format) استفاده مي شود  که در صفحات بعدی توضيح داده خواهد شد.

10) تشخيص ناقلين ناهنجاري هاي كروموزومي مثل سندرم داون و دوشن همراه با تعيين دوز ژني(Gene Dosage)

در اين حالت ژن ها به گونه اي انتخاب مي شوند كه مقدار آنها متناسب با كاهش يا افزايش كروموزوم تغيير يابد. معمولا˝ از ژنهايی استفاده می شود که در هر کرموزوم يک کپی از آن موجود باشد(single copy)  .

در صورت تغيير تعداد کرموزومها تعداد کپی اين ژنها نيزتغيير می کند.

Loss of Hetrozigosity (11 :درصفتي كه رابطه غالب ومغلوبي برقرار باشد فرد هتروزيگوت به دليل داشتن آلل غالب، سالم است. درصورت حذف يا جهش در آلل غالب ،بيماري در فرد بروز مي كند. به اين حالت  LOHگفته مي شود. با استفاده ازReal-time PCR  و از طريق تعيين تعداد نسخه ژن مورد نظر می توان به وجود يا عدم وجوداين نقص پی برد.

12) تشخيص  پلي مورفيسم ناشي از جهش تك نوكلئوتيد  :(Single nucleotide Polymorphism)به جهش هاي نقطه اي در منطقه اي از ژن گفته مي شود كه بهترين ماركرهاي اختصاصي ژنتيكي در فرد است كه داراي پلي مورفيسم با فراواني حداقل 1%

لینک منبع:http://www.nobellab.com/index.php/azmayeshgah-baraye-pezeshkan/98-real

ممکن است شما دوست داشته باشید بیشتر از نویسنده