معماری
تست غربالگری

تست‌های غربالگری

Prenatal Screening Tests; cffDNA

تست‌های غربالگری سلامت جنین عموماً به منظور تشخیص قبل از تولد سندرم داون (تریزومی ۲۱)، سندرم ادوارد (تریزومی ۱۸)، سندرم پاتو (تریزومی ۱۳) و پره اکلامپسی انجام می‌شود. این تست‌ها به دو دسته تهاجمی و غیرتهاجمی تقسیم می‌شوند؛ تست‌های تهاجمی عبارتند از آمنیوسنتز و نمونه‌گیری از پرزهای جفتی (CVS[1]) و تست‌های غیرتهاجمی نیز مشتمل بر غربالگری سه ماهه اول، غربالگری سه ماهه دوم، غربالگری تجمعی و NIPT[2] می‌باشند.

  • تست‌های غربالگری تهاجمی

تست‌‌های غربالگری تهاجمی شامل آمنیوسنتز و CVS هستند که ایراد اصلی آنها سقط جنین ناخواسته می‌باشد.

  • آمنیوسنتز

آمنیوسنتز یک تکنیک تشخیصی قبل از تولد است که طی آن حدود ۲۰-۱۵ میلی‌لیتر از مایع آمنیون اخذ و مورد بررسی ژنتیکی قرار می‌گیرد. این روش یکی از رایج‌ترین روش‌های تهاجمی تشخیصی قبل از تولد در سه‌ماهه‌ی دوم بارداری است. آمنیوسنتز بین هفته‌های ۱۵ تا ۲۲ بارداری انجام می‌شود و انجام آن زودتر از این زمان منجر به آسیب جنین می‌شود. از عوارض آمنیوسنتز می‌توان به زایمان زودرس، دیسترس تنفسی، ناهنجاری‌های جسمی، آسیب به جنین و بیماری‌های مربوط به Rh مادر اشاره کرد. مطالعات اخیر در سال‌های ۲۰۰۶-۲۰۰۰، خطر سقط ناشی از روش آمنیوسنتز را ۶/۰ % تا ۸۶/۰% تخمین زده ‌است (۱).

  • نمونه گیری از پرزهای جفتی (CVS)

این روش به منظور تشخیص ژنتیکی در دوران جنینی بین هفته‌ ۱۰ تا ۱۳ بارداری انجام می‌گیرد. در این روش پرزهای کوریونی از جفت گرفته شده و بررسی کروموزومی بر روی آن انجام می‌گیرد. خطر سقط ناشی از این روش نیز ۲-۱% است (۲).

تست غربالگری

  • تست‌های غربالگری غیرتهاجمی

تست‌های غربالگری غیرتهاجمی شامل روش‌های سنتی غربالگری سه ماهه اول، سه‌ماهه دوم، تجمعی و تست جدید NIPT می‌باشند. اشکال اصلی روش‌های سنتی غربالگری، میزان مثبت کاذب بالای آنها می‌باشد.

  • غربالگری سه ماهه اول بارداری

این تست در بین هفته ۱۰ تا ۱۴ حاملگی انجام می‌شود. در این روش از مارکرهای سونوگرافی (NT[3] یا ضخامت پشت گردن رحم) و بیوشیمی ([۴]PAPP-A و [۵]β-HCG) استفاده می‌شود. حساسیت آن برای غربالگری سندرم داون ۸۷-۸۲% و میزان مثبت کاذب آن حدود ۵% است.

  • غربالگری سه ماهه دوم بارداری

نام دیگر این تست کواد[۶] است و در بین هفته ۱۵ تا ۲۰ حاملگی انجام می‌شود. در این روش مارکرهای بیوشیمیایی (شامل β-HCG، آلفا فیتوپروتئین، استریول غیرکن‍ژوگه و اینهیبین A) اندازه‌گیری می‌شوند. حساسیت این روش برای غربالگری سندرم داون حدود ۸۰% و میزان مثبت کاذب آن حدود ۵% است (۳).

  • غربالگری تجمعی

از ترکیب معیار خطر محاسبه شده در سه ماهه اول و دوم بدست می‌آید و حساسیت این تست برای غربالگری سندرم داون ۹۷-۹۴% است.

  • NIPT با استفاده از [۷]cffDNA موجود در پلاسمای مادر

روش جدید و غیرتهاجمی غربالگری است که با استفاده از تکنولوژی تعیین توالی، میزان افزایش DNAآزاد جنین را در خون مادر از هفته دهم بارداری بررسی می‌کند. در این روش بدون نیاز به سلول‌های بافت جفت (CVS) یا نمونه گیری از مایع آمنیوتیک (آمنیوسنتز)، از چند میلی‌لیتر خون وریدی مادر استفاده شده و در یک تست همزمان، تریزومی های ۲۱، ۱۸ و ۱۳ بررسی می‌شود. حساسیت این روش برای غربالگری سندرم داون بیش از ۹۹% و میزان مثبت کاذب آن کمتر از ۱/۰% است (۴, ۵).

  • cff DNA

در سال ۱۹۹۷، Dennis Loو همکارانش برای اولین بار وجود DNA آزاد جنینی را در خون مادر گزارش دادند. نیمه عمر این DNA بسیار کوتاه و حدود ۱۶ دقیقه است و در کمتر از ۲ ساعت بعد از تولد از خون مادر حذف می‌شود. cffDNA عمدتاً از سلول‌های جفتی آپوپتوتیک جنینی آزاد می‌شود (۶). اما مکانیسم‌های دیگری نیز برای آزاد شدن DNA جنینی وجود دارد که از آن جمله می‌توان به آزاد شدن DNA از سلول‌های هماتوپوئیتیک جنینی و انتقال مستقیم مولکول‌های DNA اشاره کرد. DNA موجود در خون مادر شامل DNA مادری و DNA جنینی است که به صورت قطعات کوتاه (۲۰۰-۱۵۰ جفت باز) در گردش خون دیده می‌شوند. منشاء اصلی DNA مادری (cfDNA[8]) سلول ‌های خونی مادر می‌باشد. میزان DNA جنینی موجود در پلاسمای مادر از ۵% تا ۱۰% متغیر است؛ این مقدار با پیشرفت بارداری افزایش می‌یابد و در اواخر دوران بارداری به حداکثر می‌رسد (۷).

  • مزایای استفاده از cffDNA

صحیح‌ترین تست غربالگری غیر تهاجمی است که در حال حاضر برای تشخیص آنوپلوئیدی وجود دارد و تشخیص زودهنگام را ممکن می‌سازد.

  • محدودیت‌های استفاده از cffDNA

برای اطمینان از وجود اختلال، می‌بایست علاوه بر تست cffDNA، تست غربالگری تهاحمی (CVS یا آمنیوسنتز) نیز انجام شود. همچنین در مواردی که میزان DNA جنینی موجود در پلاسمای مادر کمتر از ۴% باشد، نمونه‌ها با این تست قابل تفسیر نیستند.

  • جمع‌آوری نمونه و استخراج DNA

ده تا بیست میلی‌لیتر خون محیطی در لوله حاوی ۲۰۰ میکرولیتر EDTA 5/0 مولار جمع‌آوری و سریعاً به دمای ۴ درجه سانتیگراد منتقل می شود. نمونه‌های خون به مدت ۱۰ دقیقه در g 3000 سانتریفوژ و محلول رویی (حاوی پلاسما و بافی‌کوت) با دقت جدا شده و به میکروتیوب ۵/۱ میلی‌لیتری منتقل می‌شود. در مرحله بعد به کمک کیت، DNA ژنومی استخراج می‌گردد. مطالعه‌ی Wong و همکاران در سال ۲۰۱۳ در خصوص پایداری cffDNA نشان داد که میزان cffDNA موجود در پلاسمای مادر به مدت ۷ روز در طیف دمایی (۴، ۲۳، ۳۷ و ۴۰ درجه سانتیگراد) پایدار است، در حالی که در دمای بالاتر از ۲۳ درجه سانتیگراد میزان DNA توتال (عمدتاً مادری) به خاطر تجزیه سلول‌های مادر و آزاد شدن DNA آن‌ها افزایش می‌یابد (۸).

۲-۴- فاکتورهایی که بر میزان cffDNA تأثیر می‌گذارند

  • میزان cffDNA با پیشرفت بارداری افزایش می‌یابد، مطالعه Wang و همکاران در سال ۲۰۱۳ نشان داد که میانگین cffDNA در هفته دهم (روز ۱ تا ۶) ۲/۱۰% بود که تا هفته ۲۱ به تدریج هفته‌ای ۱/۰% و از هفته ۲۱ به بعد هفته‌ای ۱% افزایش یافت (۹).
  • میزان cffDNA با افزایش وزن مادر کاهش می‌یابد (۹).
  • مطالعه Urato و همکاران در سال ۲۰۰۸ نشان داد که میزان cffDNA در سرم زنان باردار سیگاری سه برابر زنان باردار غیر سیگاری است (۱۰).
  • کاربردهای بالینی cffDNA

عبارتند از: تعیین جنس جنین، تشخیص نوع RhD، تشخیص آنوپلوئیدی جنین، تعیین اختلالات تک‌ژنی و تعیین ابوّت.

  • تعیین جنس جنین

اولین کاربرد cffDNA تعیین جنس جنین است که از طریق آشکار شدن ژن‌های موجود بر روی کروموزم Y جنین‌های مذکر مشخص می‌شود. برای تعیین جنس جنین از ژن SRY[9] به عنوان مارکر DNA جنینی جنس مذکر استفاده می‌شود. این تست برای بررسی خطر بروز اختلالات جنسی وابسته به X، تشخیص مبهم بودن ژنیتال و مدیریت شرایط متابولیک کاربرد دارد و از هفته پنجم به بعد انجام می‌شود. فاکتورهایی که بیشترین تأثیر را در نتیجه تست دارند عبارتند از سن بارداری و روش تکثیر DNA. چندین مطالعه در هفته‌های پنجم و هفتم بارداری با کمک Real-Time PCR انجام شده که میزان حساسیت آن را ۱۰۰% نشان داده‌اند (۱۱).

  • تشخیص نوع RhD

برای پیشگیری از بروز بیماری‌های همولیتیک باید وضعیت RhD جنین و مادر مشخص شود. روش‌های سنتی تشخیص وضعیت RhD مشتمل بر تکثیر ژن RhD در مایع آمنیوتیک و آزمایش سرولوژی در بدو تولد می‌باشد. برای تشخیص وضعیت RhD جنین به کمک cffDNA از دو منطقه‌ی ژن RhD (اگزون ۵ و ۷) استفاده می‌شود. دلایل نتایج منفی کاذب این تست؛ عبارتند از: کمبود DNA جنینی موجود در پلاسمای مادر، علل بیولوژیکی (انجام تست در اوایل دوران بارداری) و علل تکنیکی (استخراج ضعیف DNA) (12).

 

 

  • تشخیص آنوپلوئیدی جنین

آنوپلوئیدی علت اصلی نقص تولید‌مثل و بیماری‌های مادرزادی همراه با اختلال کروموزومی مثل تریزومی ۲۱ (سندرم داون)، تریزومی ۱۸ (سندرم ادروارد)، تریزومی ۱۳ (سندرم پاتو)، سندرم کلاین‌فلتر (XXY) و سندرم ترنر (XO)، می‌باشد. همانطور که اشاره شد رایج‌ترین تکنیک‌های تشخیص آنوپلوئیدی قبل از تولد CVS و آمنیوسنتز هستند که هر دو از روش‌های تهاجمی محسوب می‌شوند. جدیدترین تکنیک برای تشخیص آنوپلوئیدی، ارزیابی مقادیر نسبی کروموزوم هدف (مثلاً ۲۱) با تکنیک Real-Time PCR است. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که میزان cffDNA در شرایط آنوپلوئیدی افزایش می‌یابد. Lo و همکاران نشان دادند که به واسطه cffDNA موجود در پلاسمای مادر، می‌توان جنین دارای تریزومی ۲۱ را با حساسیت ۱۰۰% و اختصاصیت ۹/۹۷% تشخیص داد. بر اساس اطلاعات بدست آمده طی ۸ مطالعه تا سال ۲۰۱۲، cffDNA از نظر وضعیت آنوپلوئیدی غربالگری شد. در پنج مورد از مطالعات مذکور از تکنیک [۱۰]MPSS و در بقیه از تکنیک DANSR[11] استفاده گردید. همچنین هر ۸ مطالعه تریزومی ۲۱، ۶ مطالعه تریزومی ۱۸ و دو مطالعه نیز تریزومی ۱۳ را بررسی کردند. به عنوان مثال در مطالعه Norton و همکاران که بر روی ۳۲۲۸ زن باردار انجام شد نشان داده که حساسیت روش DANSR برای غربالگری تریزومی ۲۱ (سندرم داون)، ۱۰۰% و برای غربالگری تریزومی ۱۸ (سندرم ادوارد)، ۹۷% است. در همه این مطالعات وضعیت صحیح کروموزومی بوسیله CVS یا آمنیوسنتز تأیید شد (۱۳).

  • تعیین اختلالات تک‌ژنی

بیماری‌هایی مثل آکندروپلازی، هانتینگتون، دیستروفی عضلانی، هیپرپلازی مادرزادی آدرنال، هموفیلی و β- تالاسمی به دلیل جهش‌های تک‌نقطه‌ای ایجاد می‌شوند و برای تشخیص آنها می‌توان ژن‌های جهش‌یافته را در خون مادر شناسایی کرد. بیماری آکندروپلازی در اثر جهش نقطه‌ای در ژن FGFR3[12] ایجاد می‌شود. در مطالعه‌ای که در آن از cffDNA استفاده شد، در بیش از ۹۸% موارد، این بیماری تشخیص داده شد. به کمک cffDNA می‌توان بیماری هانتینگتون را در حدود هفته دهم بارداری با صحت بسیار بالا تشخیص داد. رایج‌ترین علت بیماری β- تالاسمی جهش در ژن CTTT می‌باشد که می‌توان به کمک PCR این جهش را با حساسیت ۱۰۰% و اختصاصیت بالا شناسایی نمود.

  • تعیین ابوّت

تعیین ابوّت جنین به کمک سیستم ژنوتیپی [۱۳]DNA- STR امکان‌پذیر است. DNA- STR آلل‌های چندگانه دارد و می‌تواند تنوع بسیار بالایی داشته باشد (۱۱).

  • تست‌های تجاری موجود برای NIPT

تعدادی از شرکت‌ها مثل [۱۴]Sequenom، Verinata[15]، Ariosa[16] و [۱۷]Natera نسل جدیدی از تست‌های NIPT را طراحی کرده‌اند که همه آنها برای بدست آوردن اطلاعات موجود در cffDNA از روش تعیین توالی استفاده می‌کنند. هر شرکت برای تفسیر داده‌های ژنتیکی از اَلگوریتم مخصوص خود استفاده می‌کند. اگر چه تکنولوژی مورد استفاده این شرکت‌ها متفاوت است ولی کاربرد بالینی همه مشابه است و همگی cfDNA موجود در خون مادر را برای بررسی وجود آنوپلوئیدی آنالیز می‌کنند. میزان تشخیص این کیت‌ها برای تریزومی‌های مختلف متفاوت است؛ به عنوان مثال شرکت Natera تست Panorama را بر اساس SNP طراحی کرده است که می‌تواند تریزومی‌های ۲۱، ۱۸ و ۱۳ را با اختصاصیت ۱۰۰% و حساسیت ۹۹-۹۲% غربالگری کند (جدول ۱) (۳, ۱۴).

جدول ۱٫ تست‌های تجاری موجود برای تست NIPT

۴-۱- مراحل انجام تست Panorama

  • خون مادر در حدود هفته ۹ بارداری اخذ و پلاسما و بافی‌کوت آن جدا می شود.
  • DNA موجود در پلاسما و بافی‌کوت، تکثیر و به کمک دستگاه توالی‌یاب آنالیز می‌شود. به کمک این تکنیک می‌توان تفاوت ژنتیکی SNP‌های بین ژنوم مادر و جنین را مشخص نمود.
  • داده‌های حاصل از مرحله قبل به کمک اَلگوریتم NATUS آنالیز می‌شوند. این اَلگوریتم می‌تواند سیگنال ناشی از DNA مادر را از سیگنال ناشی از DNA جنین تمیز دهد.
  • گزارش حاوی معیار خطر برای کروموزوم‌های ۲۱، ۱۸، ۱۳، X و Y آماده می‌شود.

۵- نتیجه‌گیری

بزرگترین ایراد روش‌های سنتی غربالگری، درصد بالای نتایج مثبت و منفی کاذب و در تست تأئیدی، احتمال سقط جنین به علت تهاجمی بودن روش نمونه‌گیری است، در حالی که با روش NIPT تقریباً همه جنین‌های مبتلا به سندرم داون با مثبت کاذب بسیار پایین شناسایی می‌شوند. برای درک اهمیت این موضوع به این مثال توجه نمایید: کل موارد حاملگی در ایران در سال ۹۲ حدود ۵/۱ میلیون نفر بوده است. در روش‌های سنتی غربالگری برای این تعداد حاملگی، تعداد زنان باردار با نتایج مثبت کاذب حدود ۷۵۰۰۰ نفر تعیین می‌شود ولی با روش NIPT این تعداد تنها ۵۱۰ نفر خواهد بود. به این ترتیب، با توجه به نتایج مثبت کاذب بسیار پایین روش NIPT، سالانه بیش از ۷۴۴۹۰ مورد انجام آزمایش آمنیوسنتز کمتر درخواست می‌شود که هزینه آن به تنهایی معادل ۷۴۵ میلیارد ریال است و چنانچه از این روش استفاده شود، این هزینه به خانواده ها تحمیل نمی‌شود. همچنین تعداد موارد سقط جنین ناشی از نمونه‌گیری تهاجمی در روش‌های سنتی غربالگری ۶۰۰ مورد و در روش NIPT تنها ۲۳ مورد می‌باشد؛ یعنی با استفاده از روش NIPT، سالانه جان ۵۷۳ جنین نجات داده می‌شود.

 

References

  1. Wilson R, Langlois S, Johnson J. Mid-trimester amniocentesis fetal loss rate. Journal of obstetrics and gynaecology Canada: Journal d’obstetrique et gynecologie du Canada. 2007;29(7): 586-95.
  2. Dodgson J, Martin J, Boswell J, et al. Probable amniotic fluid embolism precipitated by amniocentesis and treated by exchange transfusion. British medical journal (Clinical research ed). 1987; 294 (6583):1322.
  3. Norwitz ER, Levy B. Noninvasive Prenatal Testing: The Future Is Now. Reviews in obstetrics and gynecology. 2013; 6(2):48.
  4. Musci TJ, Fairbrother G, Batey A, et al. Non‐invasive prenatal testing with cell‐free DNA: US physician attitudes toward implementation in clinical practice. Prenatal diagnosis. 2013; 33: 424-428.
  5. Lau TK, Chan MK, Salome Lo PSY, et al. Clinical utility of noninvasive fetal trisomy (NIFTY) test-early experience. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 2012; 25(10):1856-9.
  6. Caroline F W, Hilary B. The use of cell-free nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal dignosis. Human Reproduction Update. 2009; 1(15): 139-151.
  7. Jiang F, Ren J, Chen F, et al. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies. BMC medical genomics. 2012;5(1):57.
  8. Wong D, Moturi S, Angkachatchai V, Mueller R, DeSantis G, van den Boom D, et al. Optimizing blood collection, transport and storage conditions for cell free DNA increases access to prenatal testing. Clinical Biochemistry. 2013; 46(12): 1099-104.
  9. Wang E, Batey A, Struble C, et al. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell‐free DNA in maternal plasma. Prenatal diagnosis. 2013; 33(7):662-6.
  10. Urato AC, Peter I, Canick J, et al. Smoking in pregnancy is associated with increased total maternal serum cell‐free DNA levels. Prenatal diagnosis. 2008; 28(3):186-90.
  11. Ghorbian S. Applications of Cell-Free Fetal DNA in Maternal Serum. International Journal of Infertility and Fetal Medicine. 2012; 3(2):33-9.
  12. Macher HC, Noguerol P, Medrano-Campillo P, et al. Standardization non-invasive fetal RHD and SRY determination into clinical routine using a new multiplex RT-PCR assay for fetal cell-free DNA in pregnant women plasma: results in clinical benefits and cost saving. Clinica Chimica Acta. 2012; 413(3):490-4.
  13. Walsh JM, Goldberg JD. Fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing: a technology assessment. Prenatal diagnosis. 2013; 33(6):514-520.
  14. Agarwal A, Sayres LC, Cho MK, et al. Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States. Prenatal diagnosis. 2013; 33(6):521-31.

 

[۱] – Chorionic Villus Sampling

[۲] – Noninvasive Prenatal Trisomy

[۳] – Nuchal Translucency

[۴] – Pregnancy-associated Plasma Protein-A

[۵] – β-Human Chorionic Gonadotropin

[۶] – Quad

[۷] – Cell free fetal DNA

[۸] – Cell Free DNA

[۹] – Sex Determining Region Y

[۱۰] – Massively Parallel Signature Sequencing

[۱۱] – Digital Analysis of Selected Regions

[۱۲] – Fibroblast Growth Factor Receptor 3

[۱۳] – Short Tandem Repeat

 

دکتر ابوالفضل گلستانی۱، امیر حسین دوستی مطلق۲

دانشیار گروه بیوشیمی بالینی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران۱، دانشجوی دکتری تخصصی بیوشیمی بالینی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران

ماهنامه اخبار آزمایشگاهی